BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Ánh Nguyệt Tp Hồ Chí Minh, 02/2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Thị Ánh Nguyệt Tp Hồ Chí Minh, 02/2019 .i DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Nguyễn Thị Ánh Nguyệt Trần Văn Quyền .ii MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii ĐẶT VẤN ĐỀ viii CHƯƠNG TỔNG QUAN 10 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI CYNARA 10 1.1.1 Vị trí phân loại 10 1.1.2 Hình thái thực vật 11 1.1.3 Phân bố sinh thái 14 1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản 14 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI CYNARA 15 1.2.1 Dẫn xuất caffeoylquinic 15 1.2.2 Flavonoid 16 1.2.3 Sesquiterpen lacton 17 1.2.4 Inulin 18 1.2.5 Các thành phần khác 18 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ACTISÔ 19 1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 19 1.3.2 Tác dụng gan mật 19 1.3.3 Tác dụng làm giảm cholesterol 20 1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn – kháng nấm 20 1.3.5 Tác dụng tim mạch 20 1.3.6 Tác dụng hệ tiêu hóa 21 1.3.7 Tác dụng kháng viêm 21 1.3.8 Tác dụng kháng ung thư 21 1.3.9 Tác dụng kháng HIV 21 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM ACTISÔ 22 1.4.1 Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV 22 1.4.2 Tiêu chuẩn Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu 22 .iii 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOL TRONG ACTISƠ BẰNG HPLC 24 1.5 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÀ TÚI LỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG 28 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 1.6 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30 1.6.1 Nguyên liệu 30 1.6.2 Dung mơi, hóa chất 31 1.6.3 Thiết bị, dụng cụ 31 1.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 1.7.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid Actisô UPLC 32 1.7.2 Đánh giá quy trình định lượng 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 2.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CY, AC, SCO, CR TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG UPLC-PDA 41 2.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký UPLC 41 2.1.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất Actisô 48 2.1.3 Quy trình định lượng CY, AC, CR SCO 53 2.2 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 54 2.2.1 Khảo sát độ tinh khiết chất đối chiếu 54 2.2.2 Tính tương thích hệ thống 57 2.2.3 Tính tuyến tính 59 2.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 61 2.2.5 Khảo sát tính chọn lọc 62 2.2.6 Khảo sát độ lặp lại 63 2.2.7 Khảo sát độ 66 2.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AC, CY, SCO, CR TRONG ACTISÔ 68 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75 3.1 KẾT LUẬN 75 3.2 ĐỀ NGHỊ 75 CHƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 .iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số loài chi Cynara 10 Bảng 1.2 Các đặc điểm hình thái kiểu gen lồi Actisơ trồng 12 Bảng 1.3 Chương trình HPLC phân tích hợp chất phenol 25 Bảng 1.4 Một số điều kiện định lượng hợp chất Actisô HPLC 26 Bảng 2.5 Một số chế phẩm thị trường 30 Bảng 2.6 Đánh giá độ xác theo nồng độ chất phân tích 38 Bảng 2.7 Mối liên quan tỷ lệ phục hồi nồng độ chất phân tích 39 Bảng 3.8 Chương trình chạy tiệm tiến lựa chọn 45 Bảng 3.9 Bảng so sánh điều kiện HPLC UPLC 48 Bảng 3.10 Bảng độ tan AC, CY, SCO, CR 49 Bảng 3.11 Kết khảo sát nhiệt độ chiết AC, CY, SCO, CR 50 Bảng 3.12 Bảng khảo sát thời gian chiết AC, CY, SCO, CR 51 Bảng 3.13 Bảng khảo sát số lần chiết AC, CY, SCO CR 52 Bảng 2.14 Kết đánh giá độ tinh khiết hợp chất phân lập 55 Bảng 2.15 Kết đánh giá độ tinh khiết cynarosid phân lập 56 Bảng 3.16 Độ tinh khiết chất chuẩn 57 Bảng 3.17 Kết giá trị trung bình thông số pic mẫu thử 57 Bảng 3.18 Kết giá trị trung bình thơng số pic mẫu chuẩn 58 Bảng 3.21 Kết khảo sát LOD LOQ AC, CY, SCO, CR 62 Bảng 3.22 Độ lặp lại acid clorogenic 64 Bảng 3.23 Độ lặp lại cynarin 64 Bảng 3.24 Độ lặp lại scolymosid 65 Bảng 3.25 Độ lặp lại cynarosid 65 Bảng 3.26 Tóm tắt độ lặp lại hàm lượng chất định lượng 65 Bảng 3.27 Kết độ acid clorogenic 66 Bảng 3.28 Kết độ cynarin 66 Bảng 3.29 Kết độ scolymosid 67 Bảng 3.30 Kết độ cynarosid 67 Bảng 31 Tóm tắt tỷ lệ phục hồi quy trình định lượng 67 .v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí phân loại Actisơ 10 Hình 1.2 Vị trí phân loại Actisơ lồi Cynara cardunculus L 11 Hình 1.3 Các hệ lai F1 Cynara Cardunculus L 13 Hình 1.4 Dẫn xuất acid caffeoylquinic 16 Hình 1.5 Dẫn xuất Flavonoid 17 Hình 1.6 Dẫn xuất Sesquiterpen lacton 17 Hình 1.7 Sắc ký đồ dịch chiết hoa đầu Actisô 25 Hình 1.8 Sắc ký đồ dịch chiết hoa Actisô 26 Hình 1.9 Một số chế phẩm thị trường 29 Hình 3.10 Sắc ký đồ AC, CY, SCO, CYR chuẩn bước sóng 323 nm 41 Hình 3.11 Sắc ký đồ AC,CY, SCO, CYR chuẩn bước sóng 349 nm 41 Hình 3.12 Phổ hấp thu UV acid clorogenic, cynarin, scolymosid cynarosid 42 Hình 3.13 SKĐ khảo sát dung mơi pha động 42 Hình 3.14 SKĐ khảo sát chương trình chạy 44 Hình 3.15 SKĐ khảo sát tốc độ dòng 45 Hình 3.16 SKĐ khảo sát nhiệt độ cột 46 Hình 3.17 SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR phương pháp HPLC 47 Hình 3.18 SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR phương pháp UPLC 47 Hình 3.19 Biểu đồ độ tan AC, CY, SCO CR 48 Hình 3.20 SKĐ dung môi chiết EtOH 70% Nước 49 Hình 3.21 Biểu đồ nhiệt độ chiết AC, CY,SCO CR 50 Hình 3.22 SKĐ nhiệt độ chiết 60 oC 100 oC 50 Hình 3.23 Biểu đồ thời gian chiết AC, CY, SCO CR 51 Hình 3.24 Biêu đồ lần chiết AC, CY, SCO CR 52 Hình 2.25 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết acid clorogenic phân lập 55 Hình 2.26 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết cynarosid phân lập 56 Hình 3.28 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu thử 57 Hình 3.29 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn 57 Hình 3.30 Đường tuyến tính acid clorogenic 59 Hình 3.31 Đường tuyến tính cynarin 60 .vi Hình 3.32 Đường tuyến tính scolymosid 60 Hình 3.33 Đường tuyến tính cynarosid 61 Hình 3.34 sắc ký đồ acid clorogenic nồng độ LOD 62 Hình 3.35 Sắc ký đồ cynarin nồng độ LOD 62 Hình 3.36 Sắc ký đồ cynarosid nồng độ LOD 62 Hình 3.37 Sắc ký đồ acid scolymosid nồng độ LOD 62 Hình 3.38 Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc 62 Hình 3.39 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc acid clorogenic 63 Hình 3.40 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc cynarin 63 Hình 3.41 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc scolymosid 63 Hình 3.42 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc cynarosid 63 Hình 3.43 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại acid clorogenic cynarin 64 Hình 3.44 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại scolymosid cynarosid 64 Hình 3.45 Ảnh hưởng phận dùng lên hàm lượng tím 69 Hình 3.46 Ảnh hưởng phận dùng lên trắng 69 Hình 3.47 Ảnh hưởng điều kiện phơi đến hàm lượng tím 70 Hình 3.48 Ảnh hưởng điều kiện phơi đến hàm lượng trắng 70 Hình 3.49 Ảnh hưởng tháng thu hoạch đến hàm lượng tím 71 Hình 3.50 Ảnh hưởng tháng thu hoạch đến hàm lượng trắng 71 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ nguyên ACN Acetonitril MeOH Methanol EtOH Ethanol DĐVN Dược điển Việt Nam LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) PDA Photo Diod Array Detector (Đầu dò dãy diod quang) to Nhiệt độ UV-Vis Ultraviolet and Visible (Tử ngoại khả kiến) SKĐ Sắc ký đồ AC Acid clorogenic CY Cynarin SCO Scolymosid CYR,CR Cynarosid iii ĐẶT VẤN ĐỀ Actisô (Cynara scolymus L.) loại thảo sống nhiều năm có nguồn gốc từ miền nam Châu Âu Diện tích trồng Actisơ khoảng 125.000 ha/năm sản lượng hàng năm 1,42 triệu Trong đó, Tây Ban Nha (25.000 ha), Ý (50.000 ha) Pháp (13.000 ha) đóng góp vào khoảng 75% tổng diện tích trồng [40] Trên giới, Actisô dùng làm thuốc thực phẩm chức để trị bệnh gan, mật Ngoài ra, theo nghiên cứu gần đây, dịch chiết Actisơ cịn có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng u, kháng HIV… Nhìn chung, nước ngồi có nhiều cơng trình nghiên cứu Actisơ, điển hình có nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng dược lý, phương pháp định tính, định lượng hợp chất (các flavonoid dẫn xuất acid caffeoyl quinic), số thử nghiệm lâm sàng hiệu làm giảm triệu chứng khó tiêu hạ cholesterol [41] Tại Việt Nam, nhiều chế phẩm từ Actisô với số lượng chất lượng khác nhau, đa dạng hình thức từ trà túi lọc đến dạng thuốc viên, thuốc sủi, thuốc nước để uống Do đó, việc kiểm tra chất lượng sản phẩm cần quan tâm Dược điển Việt Nam IV định lượng cynarin phương pháp đo phổ tử ngoại (UV) Tuy nhiên phương pháp có độ chọn lọc khơng cao Actisơ ngồi cynarin cịn có đồng phân khác có phổ UV Vì vậy, cần phương pháp định lượng xác hàm lượng hoạt chất có Actisơ Ngoài ra, cần định lượng acid clorogenic, scolymosid cynarosid – chất chứa hàm lượng đáng kể Actisơ mà cịn có tác dụng đáng ý Actisơ tác dụng chống oxy hố hạ cholesterol Nhóm nghiên cứu có cơng trình công bố định lượng đồng thời chất phương pháp PDAHPLC [44] Tuy nhiên, ngày hệ thống máy UHPLC đời với nhiều ưu điểm so với HPLC tốc độ phân tích nhanh, độ nhạy độ phân giải tốt hơn, tiết kiệm dung môi Gần đây, với nhu cầu phân tích ngày nhiều nên số nơi trung tâm kiểm nghiệm, viện kiểm nghiệm tỉnh thành số xí nghiệp bắt đầu có nhu cầu sử dụng hệ thống tăng dần tương lai Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL18 Phụ Lục 10 Dữ liệu uplc mẫu trắng tháng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL19 Phụ Lục 11 Dữ liệu uplc mẫu tím tháng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL20 Phụ Lục 12 Dữ liệu uplc mẫu tím tháng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL21 Phụ Lục 13 Dữ liệu uplc mẫu tím tháng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL22 Phụ Lục 14 Dữ liệu uplc mẫu tím tháng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL23 Phụ Lục 15 Dữ liệu uplc mẫu hoa trắng SKĐ mẫu bước sóng 323nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL24 Phụ Lục 16 Dữ liệu uplc mẫu hoa tím SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL25 Phụ Lục 17 Dữ liệu uplc mẫu rễ trắng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL26 Phụ Lục 18 Dữ liệu uplc mẫu rễ tím SKĐ bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL27 Phụ Lục 19 Dữ liệu uplc mẫu trắng phơi nắng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL28 Phụ Lục 20 Dữ liệu uplc mấu trắng sấy 50 độ SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL29 Phụ Lục 21 Dữ liệu uplc mẫu trắng phơi âm can SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL30 Phụ Lục 22 Dữ liệu uplc tím phơi nắng SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL31 Phụ Lục 23 Dữ liệu uplc mẫu tím sấy 50 độ SKĐ mẫu bước sóng 323nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL32 Phụ Lục 24 Dữ liệu uplc tím phơi âm can SKĐ mẫu bước sóng 323 nm SKĐ mẫu bước sóng 349 nm ... tài ? ?Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin, scolymosid cynarosid Actisô phương pháp UPLC -PDA? ?? thực với mục tiêu sau: Xây dựng qui trình định tính, định lượng. .. TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC- PDA Mã số: