BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Ảnh hưởng acid boric lên số đặc tính sinh học tế bào gốc dây chằng nha chu người – in vitro Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Tp Hồ Chí Minh, 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Ảnh hưởng acid boric lên số đặc tính sinh học tế bào gốc dây chằng nha chu người – in vitro Mã số: Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Phạm Anh Vũ Thụy Tp Hồ Chí Minh, 2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm nha chu là bệnh nhiễm kh̉n mạn tính có liên quan đến phá hủy cấu trúc nâng đỡ gồm nướu, dây chằng nha chu và xương ổ Bệnh khởi phát tích tụ vi khuẩn sát cổ răng, ảnh hưởng tới hay nhiều răng, không điều trị dẫn tới răng, đặc biệt người trưởng thành Việc loại bỏ vi khuẩn gây viêm nha chu tái tạo mô nha chu bị bệnh mục tiêu lý tưởng quan trọng điều trị [65] Lấy cao và xử lý mặt chân coi là phương pháp điều trị Tuy nhiên, nhiều báo cáo việc lấy cao và xử lý mặt chân thường loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn nằm sâu túi nha chu [8], [80] Sự hình thành lớp mùn học sau ức chế gắn lại tế bào vào bề mặt chân gây hại cho lành thương mơ nha chu [14] Do đó, bên cạnh việc lấy cao và xử lý mặt chân cần thiết phải có phương pháp điều trị hỗ trợ để tiến trình điều trị viêm nha chu hiệu Các phương pháp điều trị hỗ trợ hiện sử dụng phổ biến kháng sinh toàn thân hay chỗ, dung dịch có tính kháng kh̉n bơm rửa hay súc miệng Trong đó, lấy cao và xử lý mặt chân kết hợp với dung dịch sát khuẩn bơm rửa túi nha chu phương pháp sử dụng phổ biến điều trị viêm nha chu để loại bỏ vi khuẩn gây bệnh cải thiện khả tương thích sinh học bề mặt chân [36], [49], [75] Vì vậy, việc nghiên cứu dung dịch bơm rửa có khả kháng khuẩn, khơng có tác dụng phụ khơng gây độc cho mô nha chu là điều đáng quan tâm Acid Boric acid nguyên tố Boron từ lâu sử dụng y học chất kháng khuẩn nhẹ cho vết thương và nhiều lĩnh vực khác Hiệu cơng nhận lĩnh vực nha khoa nói chung đặc biệt điều trị hỗ trợ viêm nha chu nói riêng Luan cộng (2008) chứng minh hợp chất có chứa Boron có khả kháng lại số vi khuẩn liên quan đến bệnh nha chu Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Eubacterium nodatum Treponema denticola [59] Trong nghiên cứu khác Saglam cộng (2013) cho thấy Acid Boric có hiệu làm giảm độ sâu túi giảm chảy máu nướu điều trị viêm nha chu mạn nồng độ 0,75% [70] Những hiệu lâm sàng mà Acid Boric mang lại là điều công nhận, nhiên nghiên cứu in vitro ảnh hưởng dung dịch dòng tế bào khác mơ nha chu cịn hạn chế, đặc biệt tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs) hPDLSCs nuôi cấy từ mô dây chằng nha chu người, biểu hiện dấu ấn phân tử (marker) tế bào gốc trung mô CD44, CD73, CD90 sở hữu đặc tính đa tiềm biệt hóa thành loại tế bào khác nguyên bào xương, tế bào tạo mô mỡ tế bào sụn [26], [74] Các tế bào khơng quan trọng hình thành, trì mơ mà cịn có khả sửa chữa, tu bổ, cung cấp nguồn tế bào để tái tạo mô khác bị viêm nha chu (dây chằng nha chu, xê măng và xương ổ răng) [38], [74] Chính vậy, hPDLSCs thường lựa chọn ưu tiên hàng đầu công nghệ tái tạo sửa chữa mô nha chu điều trị viêm nha chu Hiện chưa có nghiên cứu nào đánh giá độc tính ảnh hưởng Acid Boric lên đặc tính sinh học tăng sinh, di cư và khả bám dính bề mặt chân xử lý hPDLSCs Với mong muốn bổ sung thêm chứng khoa học ảnh hưởng Acid Boric tế bào mô nha chu, cụ thể hPDLSCs việc hỗ trợ điều trị viêm nha chu cách toàn diện tiến hành thực hiện nghiên cứu “Ảnh hưởng Acid Boric lên số đặc tính sinh học tế bào gốc dây chằng nha chu người – in vitro” Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Ở nồng độ Acid Boric không gây độc lên hPDLSCs nồng độ an tồn Acid Boric có ảnh hưởng đến đặc tính sinh học tăng sinh, di cư và khả bám dính bề mặt chân xử lý hPDLSCs hay không? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định nồng độ Acid Boric an tồn (khơng gây độc) lên hPDLSCs Xác định ảnh hưởng nồng độ Acid Boric an toàn đến tăng sinh hPDLSCs Xác định ảnh hưởng nồng độ Acid Boric an toàn đến di cư hPDLSCs Xác định ảnh hưởng nồng độ Acid Boric an toàn đến bám dính bề mặt chân xử lý hPDLSCs Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU VÀ DÒNG TẾ BÀO NGHIÊN CỨU Dung dịch Acid Boric 6% chuẩn bị cách hòa tan 1,2g Acid Boric nguyên chất (công ty Merck - Đức) 20ml mơi trường tiêu ch̉n lọc qua màng lọc 0,22µm vơ trùng Dung dịch này tiếp tục pha lỗng mơi trường để đạt nồng độ thí nghiệm Nguồn hPDLSCs hệ P3 cung cấp từ phịng thí nghiệm Kỹ nghệ mơ Vật liệu Y Sinh (TEBM Lab) thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguồn tế bào này chứng minh biểu hiện dấu ấn phân tử (marker) tế bào gốc trung mô CD44, CD73, CD90 và sở hữu đặc tính đa tiềm biệt hóa thành loại tế bào khác nguyên bào xương và tế bào tạo mỡ in vitro [6] 2.3 HÓA CHẤT 2.3.1 Môi trường tiêu chuẩn nuôi cấy tế bào Gồm thành phần: DMEM/F12 (Sigma - Aldrich, Mỹ) FBS (Fetal bovine serum) 10% (Sigma - Aldrich, Mỹ) Kháng sinh 100IU/ml Penicillin, 100µg/ml Strepomycin (Sigma - Aldrich, Mỹ) 2.3.2 Các hóa chất khác ✓ Dung dịch PBS 1X (1000ml) PBS 10X (Gibco, Mỹ) 100ml Nước cất lần 900ml Dung dịch hấp vô trùng 121ºC, 1atm 20 phút, bảo quản 4ºC ✓ Enzyme tách tế bào Trypsin - EDTA 0,25% (Sigma - Aldrich, Mỹ) ✓ Thuốc nhuộm tế bào Trypan blue (Sigma, Mỹ) ✓ Dung dịch MTT (5mg/ml) (10ml) MTT (Sigma, Mỹ) 50mg Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PBS 1X 10ml Dung dịch lọc vơ trùng, sau bảo quản -20ºC, tránh sáng ✓ Dung dịch DMSO/Ethanol Ethanol (Merck) 50ml DMSO (Sigma, Mỹ) 50ml ✓ Dung dịch DMSO 20% DMSO (Sigma, Mỹ) Môi trường tiêu chuẩn 5ml 20ml 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu, thời gian địa điểm nghiên cứu 2.4.1.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng 2.4.1.2 Thời gian thực nghiên cứu: Thời gian huấn luyện từ tháng 10/2017 đến tháng 11/2017 Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2017 đến tháng 6/2018 2.4.1.3 Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Kỹ nghệ mô Vật liệu Y sinh (TEBM Lab) thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh 2.4.2 Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Q trình nghiên cứu tóm tắt theo sơ đồ Hình 2.2 Acid Boric (0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3%; 6%) hPDLSCs (thế hệ P4) Đánh giá độc tính in vitro (Thử nghiệm MTT) Xác định nồng độ Acid Boric an toàn Ảnh hưởng lên hPDLSCs Đánh giá tăng sinh (Phương pháp đếm số lượng tế bào) Đánh giá di cư (Phương pháp đường rạch mô tổn thương) Đánh giá bám dính bề mặt chân xử lý (Thử nghiệm MTT và Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét - SEM) Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt nghiên cứu 2.4.3 Quy trình nghiên cứu 2.4.3.1 Chuẩn bị tế bào Nguồn hPDLSCs hệ P3 cấy chuyền đến hệ P4 (các tế bào đạt đồng hình dạng) Theo dõi tăng sinh tế bào chúng trải thành lớp đơn phủ kín bề mặt bình Roux (đạt độ bao phủ khoảng 80%) Lúc này tế bào sẵn sàng để tiến hành thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng Acid Boric lên khả sống tăng sinh, di cư và khả bám dính bề mặt chân xử lý hPDLSCs ✓ Quy trình cấy chuyền từ bình Roux sang bình Roux - Dùng pipette hút bỏ mơi trường ni cấy cũ bình Roux Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Rửa với 3ml dung dịch PBS - Tách tế bào bình Roux với 1ml Trypsin - EDTA 0,25%, ủ tủ 37ºC, CO2 5% khoảng phút - Bổ sung 2ml môi trường tiêu chuẩn để bất hoạt Trypsin - Chuẩn bị - bình Roux mới, cho vào bình 3ml mơi trường và lượng huyền phù tế bào chia cho bình - Ni tế bào tủ 37ºC, CO2 5% - Môi trường thay cách ngày - hPDLSCs hệ P4 ni bình Roux đạt mật độ khoảng 80% thực hiện nghiên cứu ✓ Phương pháp xác định số lượng tế bào bình Roux - Dùng pipette hút bỏ mơi trường ni cấy cũ bình Roux - Rửa với 3ml dung dịch PBS - Tách tế bào giếng với 1ml Trypsin - EDTA 0,25%, ủ phút, đợi tế bào nuôi cấy bong tách hết - Bổ sung 2ml môi trường nuôi cấy để bất hoạt Trypsin Huyền phù dịch bình Roux - Cho hết dung dịch vào ống Falcon 15ml, đem quay ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút phút để thu cặn tế bào - Bổ sung 2ml môi trường nuôi cấy, huyền phù - Hút 20µl dịch huyền phù có tế bào vào Eppendorf 1,5ml, pha lỗng với 0,4% Trypan blue theo tỉ lệ 1:1 trộn - Phủ buồng đếm với lamelle cho giọt huyền phù tế bào vào buồng đếm cách nhỏ sát vị trí tiếp xúc lamelle buồng đếm Nhờ hệ thống mao dẫn mà giọt huyền phù tràn đầy buồng đếm - Đếm số lượng tế bào vùng đếm bốn góc (vùng 1, 2, 3, 4) Đếm tất tế bào to, tròn, sáng rõ Đếm theo nguyên tắt cạnh - bên phải: Nếu tế bào nằm vạch ranh giới, đếm cách tế bào nằm phía bên phải ô đếm, không đếm tế bào nằm phía bên trái (Hình 2.3) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Đếm mẫu lấy số lượng tế bào trung bình A, xây dựng cơng thức tính mật độ tế bào A B Hình 2.2 Buồng đếm tế bào A: hình ảnh minh họa, B: hình chụp từ nghiên cứu ✓ Cơng thức tính mật độ tế bào - Trong buồng đếm có vùng đếm Chỉ đếm số lượng tế bào vùng đếm xung quanh Số lượng tế bào trung bình vùng đếm A/4 - Mỗi vùng đếm có 25 vng lớn, vng lớn có 16 vng nhỏ, vng nhỏ tích: 1/20 × 1/20 × 1/10 = 1/4000mm3 - Thể tích vùng đếm: 400 × 1/4000 = 1/10mm3 = 10-4ml - Suy mật độ tế bào trung bình 1ml dung dịch mơi trường: (A/4) × 104 × độ pha lỗng (tế bào/ml) - Vì nhuộm với Trypan blue theo tỉ lệ 1:1 nên độ pha loãng Vậy lượng tế bào 1ml huyền phù (N) là: N = (A/4) × 104 × (tế bào/ml) 2.4.3.2 Đánh giá ảnh hưởng Acid Boric lên khả sống hPDLSCs ✓ Cơ sở khoa học Đánh giá ảnh hưởng Acid Boric lên khả sống hPDLSCs dựa phương pháp MTT theo tiêu chuẩn ISO10993-5:2009 ISO là liên đoàn tiêu chuẩn quốc tế nhằm nâng cao phát triển tiêu chuẩn hóa đặt Thụy Sĩ ISO hoạt động là trình quản lý hài hòa để 33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh dần vào ngày thứ (11600±1696 tế bào/giếng) Số lượng tế bào ngày thứ thứ cao có ý nghĩa thống kê so với ngày thứ A B C D E Hình 3.11 Sự tăng sinh hPDLSCs sau ủ Acid Boric 0,75% 24 A: hình ảnh tế bào ngày thứ 1, B: hình ảnh tế bào ngày thứ 3, C: hình ảnh tế bào ngày thứ 5, D: hình ảnh tế bào ngày thứ 7, E: kết đếm số lượng tế bào *** Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ngày thứ (p