ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU Chuyên ngành : Hố Phân Tích Mã số : 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2015 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm LỜI CẢM ƠN! Sau thời gian học tập nghiên cứu tơi hồn thành luận văn cao học với đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu” dƣới hƣớng dẫn, bảo PGS.TS Nguyễn Văn Ri thầy cô, anh chị em, bạn mơn Hóa phân tích Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ri, ngƣời giao đề tài tận tình dẫn tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tất quý Thầy Cô mơn hóa Phân tích khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Cơng Tuấn – phịng máy HPLC tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Cuối tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể anh chị, bạn phịng thí nghiệm Hố phân tích, bạn cao học K23 giúp đỡ thời gian thực đề tài Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN! MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Khái quát chung hợp chất glycoside tim 1.1.1 Cấu tạo, tên gọi 1.1.2 Tác dụng hợp chất glycoside tim 1.1.3 Liên quan cấu trúc tác dụng 1.1.4 Tính chất glycoside tim 10 1.1.5 Phân bố tự nhiên 12 1.1.6 Một số loại thuốc chứa glycoside tim 13 1.2 Khái quát digoxin digitoxin 13 1.2.1 Digoxin 14 1.2.2 Digitoxin .15 1.3 Các phƣơng pháp xác định glycoside tim 15 1.3.1 Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim 15 1.3.2 Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim 17 1.3.3 Phƣơng pháp chiết tách glycoside tim khỏi mẫu thực 20 1.3.4 Phƣơng pháp định tính định lƣợng .21 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23 2.1 Mục tiêu đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu .23 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 24 2.2.1 Chất chuẩn 24 2.2.2 Hoá chất 24 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 24 2.3 Phƣơng pháp phân tích 25 2.3.1 Phƣơng pháp xử lý mẫu 25 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 2.3.2 Phƣơng pháp phân tích 26 2.4 Thực nghiệm 26 2.4.1 Khảo sát điều kiện tối ƣu 26 2.4.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 27 2.4.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng .27 2.4.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tối ƣu hoá điều kiện chạy sắc ký 30 3.1.1 Van bơm mẫu 30 3.1.2 Cột tách 30 3.1.3 Detector 31 3.1.4 Bƣớc sóng hấp thụ cực đại glycoside tim .31 1.1.5 Khảo sát chọn thành phần pha động tốc độ dòng 32 3.1.6 Khảo sát độ lặp lại thiết bị .39 3.1.7 Điều kiện tối ƣu cho q trình phân tích glycoside tim 40 3.2 Đƣờng chuẩn glycoside tim 42 3.2.1 Khảo sát phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất .42 3.2.2 Dựng đƣờng chuẩn 43 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 45 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 46 3.3.1 Đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích 46 3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 47 3.4 Phân tích mẫu thực tế .48 KẾT LUẬN .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Tiếng Việt: .53 Tiếng Anh: .53 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 3.1: Phổ UV glycoside tim .32 Hình 3.2: Sắc đồ tách glycoside tim tỉ lệ dung môi pha động khác 37 Hình 3.3: Sắc đồ tách glycoside tim tốc độ dòng pha động khác 38 Hình 3.4: sắc đồ digoxin điều kiện tối ƣu 40 Hình 3.5: Sắc đồ digitoxin điều kiện tối ƣu .41 Hình 3.6: Sắc đồ tách chất glycoside tim ở điều kiện tối ƣu 42 Hình 3.8: Đƣờng chuẩn 02 glycoside tim nghiên cứu luận văn 45 Hình 3.9: Sắc đồ mẫu thực 51 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo số glycoside tim [21] Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch chuẩn glycoside tim 24 Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động digoxin 34 Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động digoxin 34 Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động digitoxin .35 Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động digitoxin 35 Bảng 3.5: Độ lặp lại thời gian lƣu Glycoside tim 39 Bảng 3.6: Độ lặp lại diện tích píc Glycoside tim 40 Bảng 3.7: Các dung dịch đƣờng chuẩn .44 Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu đƣợc glycoside tim 44 Bảng 3.9: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng Glycoside tim 45 Bảng 3.10: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp 46 Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi glycoside tim 48 Bảng 3.13: Kết thu đƣợc mẫu 49 Bảng 3.14: Kết thu đƣợc mẫu 49 Bảng 3.15: Kết thu đƣợc mẫu 49 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ACN: Acetonitrin DD: dung dịch HPLC: High performance liquid chromatography LC-MS: liquid chromatography – spectrometry LOD: Limit of detection LOQ: Limit of quantity RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography RSD: Relative standard deviation PDA: Photo-diode – array SD: Standard deviation UV: Ultraviolet UV- VIS: Ultraviolet visible Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỞ ĐẦU Ra đời từ sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào cuối kỉ 20 Vào năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh đạt đƣợc thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc hỗn hợp chất giống nhƣ nguyên tố đất hiếm, ankaloid, hydrocacbon mẫu dầu Ngày nhiều cải tiến đƣợc thực để nâng cao độ nhạy phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao HPLC (sắc kí lỏng hiệu cao) kỹ thuật khơng thể thiếu phân tích để quản lí mảng chất phân tích mà phƣơng pháp khác đáp ứng đƣợc Với việc áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ khơng phân cực nhƣ: chất thơm PAHs, axit béo, dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), mẫu sinh học phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline, ) đến phân cực nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao hiệu tách cao, pic cân đối Thêm vào pha động thƣờng hỗn hợp nƣớc dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế Đây phƣơng pháp thành công [6,7] Glycoside tim nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng y học bác sĩ ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, glycoside tim có vị trí quan trọng thuốc điều trị bệnh tim Trong số nhiều loại glycoside tim có tự nhiên digoxin digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim đƣợc nghiên cứu nhiều Tuy nhiên các chất glycoside tim thƣờng độc, sử dụng hàm lƣợng cho phép dẫn đến ngộ độc, chí dẫn tử vong cho ngƣời [18] Chính cần xác định xác hàm lƣợng glycoside tim loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt hiệu cao không sử dụng liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đƣợc trọng Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Yêu cầu đặt phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng glycoside tim dƣợc liệu, dƣợc phẩm cách nhanh chóng xác Việc ứng dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc dƣợc phẩm đƣợc làm nhiều giới nhƣng Việt Nam tƣơng đối mẻ chƣa có nhiều cơng trình lĩnh vực Chính lí chúng tơi xin lựa chọn thực đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu” Trong đề tài sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng số glycoside tim dƣợc phẩm dƣợc liệu Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 3.1.7.2 Điều kiện tối ưu cho trình phân tích digitoxin  Cột tách: cột C18 inertsil ODS-3 250mm ì 2,1mm ì 5àm Detector :PDA Bƣớc sóng hấp thụ: 225 nm  Nhiệt độ cột 30oC  Tốc độ dòng 0,7 ml/phút  Thành phần pha động: ACN/H2O 60/40  Thể tích van bơm mẫu: 20 µl Và hình ảnh sắc đồ nó: 7.377 mAU(x10) 225nm4nm (1.00) 8.0 Độ hấp thụ, mAu 7.0 Digitoxin 6.0 5.0 4.0 3.0 5.483 5.764 4.683 4.907 0.0 4.512 3.332 1.0 3.688 2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Thời gian, phút Hình 3.5: Sắc đồ digitoxin điều kiện tối ƣu 3.1.7.3 Điều kiện tối ưu cho trình tách hỗn hợp glycoside tim  Cột tách: cột C18 inertsil ODS-3 250mm ì 2,1mm ì 5àm Detector :PDA  Bƣớc sóng hấp thụ: 225 nm  Nhiệt độ cột 30oC  Tốc độ dòng 0,7 ml/phút  Thành phần pha động: ACN/H2O 55/45  Thể tích van bơm mẫu: 20 µl Và dƣới sắc đồ điều kiện tối ƣu 41 Bùi Thị Tâm 4.383 mAU(x10) 5.5 225nm,4nm (1.00) 9.224 Luận văn thạc sĩ 5.0 4.5 4.0 3.5 Digitoxin Digoxin 3.0 2.5 2.0 1.5 0.5 0.0 5.689 2.446 1.0 3.445 3.665 4.084 Độ hấp thụ, mAu -0.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Thời gian, phút Hình 3.6: Sắc đồ tách chất glycoside tim ở điều kiện tối ƣu 3.2 Đƣờng chuẩn glycoside tim 3.2.1 Khảo sát phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ khảo sát qua dung dịch chuẩn glycoside đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 1000ppm (trình bày bảng 2.1) Các dung dịch đƣợc pha với nồng độ 10, 20, 50, 100, 150, 200, 300, 400 ppm (định mức dung dịch pha động điều kiện tối ƣu) cho glycoside tim Mỗi dung dịch đƣợc bơm lần hệ sắc kí, kết đƣợc biểu diễn hình 3.7: 4000000 3500000 Diện tích pic 3000000 Digoxin 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ chất, ppm 42 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 6000000 Diện tích pic 5000000 4000000 Digitoxin 3000000 2000000 1000000 0 100 200 300 400 500 Nồng độ chất, ppm Hình 3.7: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ glycoside tim Qua kết ta thấy, glycoside tim có phụ thuộc diện tích pic nồng độ khác Cụ thể, với digoxin diện tích pic tỉ lệ tuyến tính với nồng độ tới nồng độ khoảng 150pm, nồng độ lớn hơn, diện tích pic khơng cịn tuyến tính Cịn với digitoxin diện tích pic tỉ lệ tuyến tính vào nồng độ khoảng nồng độ rộng (khoảng 200ppm), Lớn nồng độ này, diện tích pic khơng cịn tuyến tính 3.2.2 Dựng đường chuẩn Chúng dựa vào kết qủa khảo sát phụ thuộc diện tích pic nồng độ mục 3.2.1 để tiến hành dựng đƣờng chuẩn glycoside Các dung dịch đƣờng chuẩn 100 ppm, 70ppm, 50ppm đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm, dung dịch chuẩn từ 5ppm đến 30 ppm đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm Tất dung dịch đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng sử dụng pipetman, định mức 10ml dung môi pha động điều kiện tối ƣu Sau bảng dung dịch đƣờng chuẩn: 43 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Bảng 3.7: Các dung dịch đường chuẩn C (ppm) DD1 DD2 DD3 DD4 DD5 DD6 DD7 Digoxin 10 20 30 50 70 100 Digitoxin 10 20 30 50 70 100 Mỗi dung dịch đƣờng chuẩn đƣợc bơm hệ sắc ký lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc số liệu để dựng đƣờng chuẩn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu glycoside tim STT Digoxin 103278 202614 403091 613457 1035322 1397073 2020239 Digitoxin 90288 1237266 1809730 180347 361395 565455 898430 Đƣờng chuẩn 02 glycoside tim thể hình 3.8: Digoxin: Y = A + B * X Parameter Value Error 2000000 -Dien tich pic 1500000 A 4880.60534 8278.26228 B 22143.54303 159.63228 1000000 -500000 0 R SD N P -20 40 60 80 100 C (ppm) 0.99984 44 10565.38955