ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH THANH THÚY NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT TRONGQ TRÌNH LÊN MEN XÚC XÍCH BÁN KHÔ VÀ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ VI SINH VẬT KHÔNG MONG MUỐN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH THANH THÚY NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT KHƠNG MONG MUỐNTRONGQ TRÌNH LÊN MEN XÚC XÍCH BÁN KHƠ VÀ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ VI SINH VẬT KHÔNG MONG MUỐN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số:60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Phạm Văn Ty PGS.TS Phan ThanhTâm Hà Nội - Năm 2017 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm quốc gia, người tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phan ThanhTâm - người ln tận tình hướng dẫn, bảo cặn kẽ cho suốt trình nghiên cứu thực nghiệm hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Văn Ty Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, người thầy hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cán bộ, nhân viên phòng thí nghiệm mơn Cơng nghệ thực phẩm - Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội phòng phân tích vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an tồn thực phẩm quốc gia quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực thực nghiệm phân tích số liệu Tơi xin cảm ơn chân thành tới thầy giáo, cô giáo, Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội bảo, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khích lệ tạo điều kiện vật chất lẫn tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 26 tháng 04 năm 2017 Học viên Trịnh Thanh Thúy MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Xúc xích lên men 1.2 Phân loại xúc xích lên men 1.3 Hệ vi sinh vật thịt 10 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hệ vi sinh vật thịt 12 1.5 Ảnh hưởng hệ vi sinh vật thịt đến trình lên men 13 1.6 Các thay đổi sinh hóa cấu trúc thịt q trình lên men xúc xích 16 1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men xúc xích 18 1.8 Mối nguy vi sinh vật xúc xích lên men bán khơ 20 1.9 Ngộ độc thực phẩm xúc xích lên men bán khô 21 1.10 Quy trình sản xuất xúc xích lên men bán khô 23 CHƢƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Nguyên liệu 28 2.2 Hóa chất môi trường 29 2.3 Thiết bị - Dụng cụ 30 2.4 Phương pháp nghiên cứu 31 2.5 Kiểm sốt, đánh giá chất lượng xúc xích lên men bán khô 37 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chế độ nhiệt lên men, làm khô làm chín độ ẩm tương đối khơng khí đến chất lượng xúc xích lên men bán khô 39 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng biến đổi độ ẩm tương đối không khí đến chất lượng xúc xích lên men bán khô 44 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chế độ gia nhiệt sơ đến chất lượng xúc xích lên men bán khô 47 BÀN LUẬN 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 I.KẾT LUẬN 52 II.KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC A:KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG XÚC XÍCH LÊN MEN BÁN KHÔ 57 PHỤ LỤC B:HÌNH ẢNH MINH HỌA 58 CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALOA: Agar Listeria Ottavani and Agost aw: nước hoạt tính BG: Brilliant Green BGA: Brilliant Green agar BHI: Brain Heart Infusion BPW: Pepton Buffer Water CDC: Centers for Disease Control and Prevention CFSA: CommunityFinancial Services Association of America CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc - Colony Forming Unit 10 CNC: cầu khuẩn có coagulase âm tính 11 ECDC: European Centre for Disease Prevention and Control 12 FDA: Foof and Drug Administration 13 FSANZ: Food Standards Australia and New Zealand 14 LAB: vi khuẩn lactic Lactobacillus 15 LC: làm chín 16 LK: làm khơ 17 LM: lên men 18 M:P: tỷ lệ hàm ẩm/protein 19 MKTTn: Muller Kauffmann Tetrathionate Novobiocin 20 MRS: Man Rogosa and Sharpe 21 RH: Relative Humidity - Độ ẩm tương đối 22 STEC: Shiga toxin E coli 23 TBX: Trypton Bile Glucoronic 24 TCVN: Tiêu chuẩn Việt nam 25 TSBT M - M: Tổng số bào tử men - mốc 26 TSVKHK: Tổng số vi khuẩn hiếu khí 27 TSYEA: Tryptic Soy Yeast Extract Agar 28 TSYEB: Tryptic Soy Yeast Extract Broth 29 VRBG: Violet Red Bile Glucose 30 VRBL: Violet Red Bile Lactose 31 VSV: vi sinh vật 32 XLD: Xylose Lysin Deoxycholate 33 XXLMBK: xúc xích lên men bán khơ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số chủng khởi động sử dụng sản xuất xúc xích lên men Bảng 1.2 Nhiệt độ phát triển tối ưu cho số chủng khởi động phổ biến Bảng 1.3 Tác động vi sinh vật sản xuất xuất xích lên men 15 Bảng 1.4 Tỷ lệ nhiễm Salmonella Montevidio Salami kiểu Ý hạt tiêu xay 23 Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật chế độ gia nhiệt sơ (sấy) khác 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.2 Một số sản phẩm xúc xích lên men bán khơ 10 Hình 1.3 Số ca ngộ độc Salmonella Montevidio (N = 272) [6] 23 Hình 1.4 Quytrình cơng nghệ sản xuất XXLM bán khô 25 Hình 3.1.Biến đổi pH (a) NH3 (b) chế độ LM, LK, LC 40 Hình 3.2 Biến đổi hàm ẩm chế độ LM, LK, LC 40 Hình 3.3 Biến đổi số lượng Enterob (a) S aureus (b) chế độ LM, LK, LC 41 Hình 3.4 Biến đổi số lượng Coliform (a) E coli (b) chế độ LM, LK, LC 43 Hình 3.5 Biến đổi số lượng Lactobacillus chế độ LM, LK, LC 43 Hình 3.6 Biến đổi số lượng nấm mốc (a) men (b) chế độ LM, LK, LC 44 Hình 3.7 Biến đổi pH (a) NH3 (b) chế độ RH khác 45 Hình 3.8 Biến đổi hàm ẩm xúc xích chế độ RH khác 45 Hình 3.9 Biến đổi số lượng Enterobacteriaceae (a) S aureus (b) theo %RH 46 Hình 3.10 Biến đổi số lượng Lactobacillus chế độ RH khác 47 MỞ ĐẦU Xúc xích lên men sản phẩm phổ biến giới hương vị thơm ngon có giá trị dinh dưỡng cao Xúc xích lên men sản xuất cách phối trộn thịt lợn thịt bò theo tỷ lệ định, xay nhỏ, trộn với gia vị, phụ gia lên men làm chín dài ngày Nhóm sản phẩm có mặt nhiều quốc gia giới với nhiều loại tên gọi khác tùy thuộc vào trình sản xuất Salami, xúc xích lên men khơ bán khơ Tuy nhiên thị trường Việt Nam nay, nhóm sản phẩm chủ yếu nhập với giá thành cao cơng nghệ sản xuất sản phẩm địi hỏi kiểm sốt nghiêm ngặt q trình lên men làm khơ, làm chín dài ngày Chất lượng nhóm sản phẩm xúc xích lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố nguồn nguyên liệu thịt thông số công nghệ (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian lên men, làm khơ, làm chín, ) Việc kiểm sốt thơng số q trình lên men dài ngày để đạt chất lượng sản phẩm mong muốn vấn đề lớn cho nhà sản xuất Ngoài vấn đề chung, thực tế sản xuất Việt Nam lại có thêm đặc thù khó khăn riêng Nguồn nguyên liệu thịt có nguy nhiễm cao q trình giết mổ gia súc, gia cầm, vận chuyển bảo quản nguyên liệu thịt phần lớn thực thủ công Điều kiện khí hậu nóng ẩmthích hợp cho phát triển nhiều loại vi sinh vật khơng mong muốn… Vì vậy, việc tìm giải pháp đồng bộ, lựa chọn thơng số cơng nghệđể sản xuất xúc xích lên men có ý nghĩa định đến chất lượng, đặc biệt làan tồn cho người sử dụng Q trình lên men có sử dụng chủng giống khởi động (Starter culture) điều khiển yếu tô công nghệ cho phù hợp có tác động ức chế tiêu diệt số loại vi sinh vật không mong muốn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, hay số loại nấm mốc sinh độc tố Trong giới hạn luận văn áp dụng chủng giống lựa chọn nghiên cứu trước [33,34] chủ yếu tập trung vào việc kiểm sốt yếu tố cơng nghệ cho phù hợp để ức chế tốt số lượng vi sinh vật không mong muốn q trình sản xuất xúc xích lên men bán khơ 3.2.2 Đánh giá mặt vi sinh vật Nghiên cứu tập trung vào số vi sinh vật có nguy vi sinh vật chiếm ưu trình lên men họ Enterobacteriaceae, S aureus Lactobacillus  Enterobacteriaceae S aureus Giai đoạn lên men đầu tiên, số lượng Enterobacteriaceae gần chế độ RH Sau ngày đầu giai đoạn làm khơ làm chín, số lượng Enterobacteriaceae bắt đầu có thay đổi giữ ổn định từ ngày 12 đến ngày thứ 16, sau giảm dần tương ứng vào ngày thứ 20 hai chế độ RH1 RH2 nghiên cứu Như vậy, để làm giảm số lượng Enterobacteriaceae, chế độ RH [92, 90, 87, 84, 80%] lên men, làm khô làm chín 220C/160C dường thích hợp để bất hoạt Enterobacteriaceae độ ẩm cao kết hợp với nhiệt độ thúc đẩy trình lên men làm giảm độ pH (Hình 3.9 a) Sự biến đổi số lượng S aureus theo % RH biểu thị hình 3.9 (b) Số lượng S aureus chế độ RH giảm nhiều chế độ RH Điều việc giảm từ từ RH chế độ thuận lợi cho phát triển sinh bacteriocin chủng vi khuẩn khởi động Sự biến đổi số lƣợng Enterobacteriaceae theo %RH Log CFU/% RH /CĐ Log CFU/% RH /CĐ Log CFU/% RH /CĐ 4.5 3.5 2.5 1.5 Log CFU/% RH /CĐ Log CFU/g SP Log CFU/g SP 4.5 3.5 2.5 Sự biến đổi số lƣợng S.aureus theo %RH Ngày 12 16 20 Ngày 12 16 20 (a) (b) Hình 3.9 Biến đổi số lƣợng Enterobacteriaceae (a) S aureus (b) theo %RH  Lactobacillus spp Ở chế độ RH nghiên cứu, số lượng Lactobacillus khơng có biến động lớn 46 Sự biến đổi số lƣợngLactobacillus theo %RH LogCFU/% RH /CĐ Log CFU/% RH /CĐ Log CFU/g SP 11 10.5 10 9.5 8.5 7.5 Ngày 12 16 20 Hình 3.10 Biến đổi số lƣợng Lactobacillus chế độ RH khác Các yếu tố môi trường thuận lợi giúp cho vi khuẩn trì phát triển tương đối tốt Tuy nhiên, chế độ RH 1, Lactobacillus phát triển ổn định chế độ RH Điều có nghĩa chế độ RH 1, tác dụng bất hoạt vi sinh vật khơng có lợi Lactobacillus tốt chế độ RH 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng chế độ gia nhiệt sơ đến chất lƣợng xúc xích lên men bán khơ 3.3.1 Lựa chọn chế độ gia nhiệt sơ (sấy) Để lựa chọn chế độ gia nhiệt cho xúc xích khơ nhanh, rút ngắn thời gian sản xuất tăng tính an tồn cho sản phẩm, mẫu xúc xích sau 16 ngày làm khơ, làm chín gia nhiệt nhiệt độ 700C, 600C 550C với thời gian khác cho xúc xích có đường kính 30mm Kết đánh giá cho thấy mức nhiệt cao trung bình/thời gian vừa phải (550C /30 phút)có hiệu sấy nhiệt độ thấp/thời gian kéo dài (400C/45 phút) nhiệt độ cao/thời gian ngắn (700C/15 phút) hàm ẩm số lượng vi sinh vật Nó có ý nghĩa mặt an tồn cho giai đoạn bảo quản nhiệt độ thấp Bảng3.1 Số lƣợng vi sinh vật chế độ gia nhiệt sơ (sấy) khác Hàm ẩm Chế độ gia nhiệt Số lƣợng vi sinh vật (Log CFU/g) sau sấy (%) Enterobacteriaceae S aureus Lactobacillus 40 C/45 phút ф30mm 40,62 ±0,15 2,07± 0,17 1,87 ±0,22 8,78 ±0,33 550C /30 phút ф30mm 38,23 ±0,14 1,73 ±0,19 1,17 ±0,22 8,57 ±0,23 700C/15 phút ф30mm 34,3 ±0,12 2,14±0,22 1,45 ±0,15 7,12 ±0,26 47 3.3.2 Kiểm nghiệm đánh giá chất lượng xúc xích lên men bán khơ Sản phẩm cuối đóng gói chân khơng, bảo quản nhiệt độ - 40C gửi kiểm nghiệm đánh giá chất lượng theo TCVN 7050:2009  Đánh giá yêu cầu cảm quan Màu sắc Đánh giá: Đạt yêu cầu kỹ thuật Yêu cầu Đặc trưng sản phẩm Mùi vị Mùi thơm đặc trưng sản phẩm, khơng có mùi, vị lạ Tên tiêu Chua dịu, có vị mặn Trạng thái Đặc trưng sản phẩm, mềm, kết cấu tốt, không bở, khô  Đánh giá yêu cầu vi sinh vật Tên tiêu Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/g Đánh giá: đạt yêu cầu kỹ thuật Giới hạn cho phép Kết 3,0 log CFU/g Coliform, CFU/g 50 Không phát E coli, CFU/g Không phát Không có Khơng phát Khơng phát Listeria monocytogenes, CFU/g Khơng có Khơng phát Clostridium perfringens,CFU/g 10 Không phát Salmonella/ 25 g sản phẩm S aureus,CFU/g  Đánh giá yêu cầu về hóa lý Đánh giá:Đạt yêu cầu kỹ thuật Tên tiêu Giới hạn cho phép 4,5 đến 5,4 Độ pH Kết 5,0 Phản ứng Kreiss âm tính Phản ứng định tính hydro sullfua (H2S) âm tính âm tính Hàm lượng amoniac, mg/100 g < 40,0 < 40mg/100g 134