BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRANG THÀNH LỄ ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NHÂN TỐ KẾT TỦA LÊN QUÁ TRÌNH THU NHẬN PEPSIN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC LUẬN VĂN CAO HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG NĂM 2002 MUÏC LUÏC MỞ ĐẦU PHẦN I - TỔNG QUAN HỆ ENZYM PROTEASE 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6 1.2.7 Phân loại hệ enzym protease Protease – serine Protease – cysteine Protease – metalo Protease – aspartic ng dụng số protease Trong công nghiệp thịt Trong công nghiệp sữa Trong công nghiệp da Trong sản xuất tơ tằm Trong sản xuất chất tẩy rửa Trong mỹ phẩm Trong y học 3 4 6 6 7 7 PEPSIN 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 Lịch sử – nguồn gốc pepsin Đặc tính pepsin pepsinogen Tính chất vật lý Thành phần hóa học cấu trúc phân tử pepsin pepsinogen Thành phần hóa học Cấu trúc phân tử Sự hoạt hoạt hóa pepsinogen thành pepsin Tính đặc hiệu thủy phân pepsin 8 2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.3 2.2.4 9 11 13 14 2.2.5 2.2.5.1 2.2.5.2 2.2.6 2.3 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 nh hưởng yếu tố pH, nhiệt độ, chất hoạt hóa, chất kiềm hãm lên pepsin pepsinogen nh hưởng pH nh hưởng nhiệt độ nh hưởng chất hoạt hóa, chất kiềm hãm Thu nhận chế phẩm pepsin từ dày động vật Ứng dụng pepsin Trong công nghiệp thực phẩm Trong nông nghiệp Trong y học dược phẩm 16 16 17 18 19 20 20 20 21 PEPTON 21 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Khái niệm pepton Phân loại pepton Tính chất pepton Các dẫn xuất pepton Ứng dụng pepton 21 22 22 23 23 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ENZYM – LỌC GEL 24 4.1 4.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 Nguyên lý lọc gel Tính chất gel Ứng dụng sắc ký lọc gel Loại muối Tách chất có trọng lượng phân tử khác Cô đặc 24 25 27 27 27 27 PHẦN II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LIỆU 28 1.1 1.2 Nguyên liệu để thu enzym – dày heo Nguyên liệu dùng xác định hoạt tính pepsin theo Dược điển Việt Nam sản xuất pepton 28 28 1.3 Các hóa chất thí nghiệm 28 THIẾT BỊ SỬ DỤNG 29 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 3.2 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 Sơ đồ nghiên cứu Phương pháp tách chiết thu nhận chế phẩm pepsin Phương pháp sản xuất pepton Phương pháp tinh enzym Phương pháp thẩm tích Phương pháp lọc qua gel sephadex 30 30 33 35 35 35 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 37 4.1 4.1.1 4.1.2 4.2 4.3 4.4 4.4.1 4.4.2 4.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzym pepsin Phương pháp theo Dược điển Việt Nam Phương pháp Anson cải tiến Phương pháp xác định hoạt tính đông tụ sữa Phương pháp định lượng protein theo Lowry Xác định nitơ tổng theo phương pháp Kjeldahl Vô hóa Chưng cất đạm Xác định nitơ amin theo phương pháp Nihydrin 37 37 38 40 41 42 42 43 45 PHAÀN III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KHẢO SÁT TỶ LỆ % TRỌNG LƯNG MÀNG NHÀY SO VỚI TOÀN BỘ DẠ DÀY 47 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC TÁC NHÂN KẾT TỦA HIỆU SUẤT THU HỒI CHẾ PHẨM PEPSIN LÊN 47 2.1 2.2 Kết tủa pepsin cồn tuyệt đối (99,9%) Kết tủa pepsin aceton 49 50 2.3 2.4 2.5 Kết tủa pepsin izopropanol Kết tủa pepsin polyetylenglycol 6000 (PEG 6000) Kết tủa pepsin muối natri clorua amonsulfat 52 54 56 HOẠT TÍNH CHẾ PHẨM PEPSIN THEO DƯC ĐIỂN NAM VIỆT 62 HOẠT TÍNH ĐÔNG TỤ SỮA 63 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐÔÄ VÀ PH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA CHẾ PHẨM PEPSIN 64 5.1 5.2 nh hưởng nhiệt độ nh hưởng pH 64 68 KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA CHẾ PHẨM PEPSIN LỌC KHI QUA CỘT GEL SEPHADEX G-75 73 BƯỚC ĐẦU THỬ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM PEPSIN THU TRONG SẢN XUẤT PEPTON PHẦN IV - KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐƯC 76 Pepsin enzym protease chủ yếu dịch vị dày động vật có vú trưởng thành Trong màng nhầy dày, pepsin tồn dạng không hoạt động, gọi pepsinogen Để trích ly enzym pepsin từ màng nhầy dày, ngâm màng nhầy dày xay nhuyễn dung dịch acid clohydric 0,5% nhiệt độ 40 – 45 oC 24 Chúng sử dụng cồn tuyệt đối, aceton, izopropanol, PEG 6000, muối natri clorua, muối amôn sulfat để kết tủa enzym Các tác nhân cho hiệu suất thu hồi enzym 89,9; 72,1; 81,7; 37,8; 77,1; 89,1% phần trăm protein bị kết tủa tương ứng 32?% Chế phẩm pepsin thu có pH tối ưu 2,0 nhiệt độ 35oC bền khoảng pH từ 2,0 đến 5,0 nhiệt độ phòng pH lớn 6,0 hoạt tính pepsin giảm nhanh chóng Ngoài chế phẩm có nhiệt độ tối ưu 55oC pH 2,0 không bền nhiệt độ lớn 55oC Chế phẩm pepsin sau kết tủa cồn tuyệt đối, cho qua cột gel sephadex G-75 (1,8 x 80 cm) Kết thu ba peak, có peak thứ hai gồm 10 phân đoạn có hoạt tính protease pH 2,0 với chất hemoglobin hiệu suất thu hồi enzym sau qua cột 84,5% Sử dụng chế phẩm pepsin để thủy phân hai chất thịt bò cá thát lát Sản phẩm pepton thu có tỷ lệ Namin/Ntổng 15,4 vaø 14,7% Abstract Pepsins (EC 3.4.23) are the principal proteases in gastric secretions of adult mammals such as beef, swine, chicken, etc They are members of the family of aspartic protease In the stomach, they exist in inactived form, called pepsinogen In order to extract pepsin, minced porcine gastric mucosa is steeped in 0,5% hydrochloric acid solution in 24 hours at 40 - 45oC Absolute alcohol, aceton, izopropanol, polyetylenglycole 6000, sodium chloride and amonium sulfate were used for precipitating enzyms Retrieving productivity of those are 89,9; 72,1; 81,7; 37,8; 77,1; 89,1%, respectively Result of studying characteration of pepsins showed that maximal hemoglobin – digestive activity at around pH 2,0 at 35oC They are stable at the range of pH between 2,0 and 5,0 at the room temperature but at pH values above 6,0 activity of pepsins is decreased rapidly Besides the pepsin optimum temperature is around 55oC at pH 2,0 and they are unstable at temperature above 55oC Precipitated pepsins by absolute alcohol were gel-filtered on a Sephadex G-75 (1,8 x 80 cm) Three peaks were detected but only the second peak showed proteolitic activity against hemoglobin at pH 2,0 Retrieving productivity of enzym is 84,5% Pepsin have been used for hydrolysing protein subtracts include beef and fish The ratio of a-amino nitrogen per total nitrogen of Peptons from beef and fish are 15,4 and 14,7%, respectively MỞ ĐẦU Nước ta nước nông nghiệp, có tiềm chăn nuôi gia súc, gia cầm Vì nguồn phụ phế phẩm từ lò mổ, đặc biệt quan nội tạng dồi quan chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, có giá trị sử dụng cao nhiều so với việc dùng chúng làm thực phẩm Trong số hợp chất phải kể đến enzym tiêu hóa mà tiêu biểu enzym pepsin Trong dày, pepsin tồn màng nhầy dạng không hoạt động, gọi pepsinogen Khi gặp môi trường acid chúng chuyển hóa thành enzym pepsin Hiện pepsin ứng dụng nhiều lónh vực công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, y học dược phẩm Do để nâng cao giá trị sử dụng dày, việc nghiên cứu tách chiết, thu nhận enzym pepsin ứng dụng chúng vào sản xuất điều cần thiết Trong năm gần đây, có vài nghiên cứu việc tách chiết pepsin chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa thông số trình tự phân màng nhầy dày nhằm giải phóng hoạt hóa pepsinogen thành pepsin (Nguyễn Thị Quỳnh Anh, 1985; Vũ Ngọc Bội, 1999) công đoạn đến quy trình thu nhận enzym Trong nghiên cứu này, chủ yếu sâu khảo sát ảnh hưởng tác nhân kết tủa lên hiệu suất thu hồi enzym PHẦN I I HỆ ENZYM PROTEASE [12][13][16][18] Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng nhiều ngành sản xuất công nghiệp Hiện thủy phân protein thường thực protease có thân nguyên liệu thực động vật; enzym vi sinh vật tiết bổ sung vào môi trường phản ứng dạng chế phẩm enzym Protease enzym xúc tác thủy phân liên keát peptid (-CO-NH-) H2N-CH-CO -NH-CH-CO- -NH-CH-COOH R1 R2 H2O Rx H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO- -NH-CH-COOH R1 R2 Rx 1.1 Phân loại hệ enzym protease [15][16][17] Protease thuộc loại enzym thủy phân, vào vị trí phân cắt mạch polypeptide, người ta phân hệ thành hai nhóm sau (Bảng – 1): - Exopeptidase: có khả thủy phân liên kết hai đầu mạch, kết giải phóng acid amin cuối mạch - Endopeptidase: thủy phân liên kết mạch polypeptid, phân cắt phân tử protein có phân tử lượng lớn thành polypeptide có phân tử lượng nhỏ Bảng – Phân loại enzym protease [18] Mã số EC 3.4.11 EC 3.4.13 EC 3.4.14 EC 3.4.15 EC 3.4.16 EC 3.4.17 EC 3.4.18 EC EC EC EC 3.4.21 3.4.22 3.4.23 3.4.24 Nhóm enzym Các exopeptidase Chú thích Thủy phân protein/peptid bước từ hai đầu mạch (đầu amino đầu carboxyl) Aminopeptidase Thủy phân giải phóng amino acid từ đầu amino mạch polypeptid Dipeptidase Thủy phân dipeptid tạo amino acid Dipeptidyl tripeptidyl Thủy phân dipeptid, tripeptid từ peptidase đầu amino Peptidyl-dipeptidase Thủy phân dipeptid từ đầu carboxyl Serine carboxypeptidase Thủy phân peptid giải phóng amino acid từ đầu carboxyl, có gốc serine trung tâm xúc tác Metalo carboxypeptidase Thủy phân peptid giải phóng amino acid từ đầu carboxyl, có ion Zn2+ Co2+ trung tâm xúc tác Cysteine Thủy phân peptid giải phóng carboxypeptidase amino acid từ đầu carboxyl, có gốc cysteine trung tâm xúc tác Các endopeptidase Thủy phân liên kết protein/ peptide vị trí đầu mạch Serine peptidase Gốc serine trung tâm xúc tác Cystein peptidase Gốc cysteine trung tâm xúc tác Aspartic peptidase Hai gốc aspartic trung tâm xúc tác Metalo peptidase Các ion kim loại trung tâm xúc tác Ngoài ra, dựa vào acid amin trung tâm hoạt động phân tử enzym người ta phân hệ protease bốn nhóm nhỏ sau: kết tủa cồn tuyệt đối hòa tan lại nước cất Sau tiến hành thí nghiệm, kết trình bày bảng –20 Bảng 20 – nh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm pepsin pH 1,1 Hoạt độ (UI/ml) 22,6 Hoạt độ so với hoạt độ cực đại 71,8 1,7 28,3 90,0 2,0 31,5 100,0 2,5 29,0 92,2 3,0 22,7 72,2 4,0 4,2 13,4 Nhận xét: Từ kết bảng – 20, thấy quy luật biến đổi hoạt tính theo pH tương tự quy luật biến đổi theo nhiệt độ Hoạt tính chế phẩm tăng từ thấp lên cao pH tăng pH tăng vượt giá trị hoạt tính enzym bắt đầu giảm xuống Giá trị pH gọi pH tối ưu Khi pH 1,1 hoạt tính chế phẩm so với giá trị cực đại 71,8% Còn pH 1,7 2,0 tương ứng 90,0% 100,0% Như giá trị pH tối ưu chế phẩm thí nghiệm xấp xỉ 2,0 Bởi pH tăng từ 2,5 đến 3,0 hoạt tính giảm nhanh chóng (giảm 20% tức từ 92,2% xuống 72,2%) pH 4,0 hoạt tính lại 13,4% Để thấy rõ quy luật này, xây dựng đường cong biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm pepsin ộ tương đối (% so với cực đại) (hình – 10) 100 80 60 40 20 71 Tóm lại, với chất hemoglobin nhiệt độ 35 oC, pH tối ưu cho trình thủy phân chế phẩm pepsin xấp xỉ Như biết, môi trường pH thấp, pepsin tự xúc trình thủy phân thân nó, gọi trình “tự phân” pH trung tính hay kiềm pepsin không bền, chí chúng bị vô hoạt nhanh chóng Vì nghiên cứu ảnh hưởng pH, cần quan tâm đến độ bền enzym môi trường có pH khác theo thời gian Ở thực thí nghiệm với pH 1,1; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 khoảng thời gian theo dõi thời điểm bắt đầu (t = 0), sau Dung dịch enzym chuẩn bị sau: kết tủa enzym cồn tuyệt đối, sau hòa tan kết tủa dung dịch acid clohydric (đối với pH 1,1) dung dịch đệm Mc Ilvaine (đối với pH lớn 2,2 trở đi) Tại thời điểm bắt đầu, xác định hoạt tính sau hòa tan xong thời điểm giờ, tiến hành lấy mẫu, tiến hành xác định lại hoạt tính chế phẩm Kết thí nghiệm trình bày bảng – 21 thể đồ thị hình - 11 72 Bảng 21 – nh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm pepsin theo thời gian (Đơn vị hoạt tính/ml chế phẩm) Thời gian (giờ) PH 1,1 Hoạt tính (UI/ml) 39,0 Hoạt tính (UI/ml) 36,1 2,0 38,6 37,6 3,0 38,2 4,0 % hoạt tính lại 92,5 Hoạt tính (UI/ml) 35,5 % hoạt tính lại 91,0 97,4 36,9 95,6 37,5 98,2 37,3 97,6 37,4 37,0 98,9 36,9 98,7 5,0 37,8 37,3 97,9 37,4 97,9 6,0 37,0 33,0 89,2 28,8 77,8 7,0 12,9 11,1 86,0 10,0 77,5 8,0 4,2 0,0 0,0 - - 9,0 0,0 0,0 0,0 - - 73 Nhận xét: Kết cho thấy vùng acid mạnh, có xảy trình tự phân pepsin nên theo thời gian hoạt tính chế phẩm có giảm Tuy nhiên tốc độ giảm hoạt tính chế phẩm giá trị pH chậm chẳng hạn sau pH 1,1 hoạt tính chế phẩm giảm 9%, pH 2,0 giảm 5% Do vùng pH chế phẩm pepsin xem tương đối bền Trong đó, pH 3,0; 4,0; 5,0 chế phẩm có tốc độ giảm hoạt tính chậm, sau hoạt tính giảm khoảng – 3%, nói vùng pH chế phẩm pepsin bền Nhưng pH tăng lên tốc giảm hoạt tính tăng lên rõ rệt, sau tốc độ giảm 22,2% Cũng theo kết thu pH 7, hoạt tính chế phẩm giảm cách nhanh chóng, thời điểm ban đầu hoạt tính chế phẩm khoảng 1/3 hoạt tính pH khác, ví dụ pH 6,0 thời điểm ban đầu chế phẩm có hoạt tính 37,0 UI/ml pH hoạt tính 12,9 UI/ml Nhưng từ thời điểm ban đầu giảm hoạt tính chậm lại, cụ thể sau chế phẩm có hoạt tính 10 UI/ml, tức giảm khoảng 22,4% so với ban đầu Còn pH 8,0; 9,0 chế phẩm bị vô hoạt hoàn toàn Điều chế phẩm pepsin thu gồm nhiều loại pepsin, mà loại pepsin có pH vô hoạt khác trình bày phần tổng quan Pepsin A pepsin D bền môi trường pH trung tính kiềm pepsin B pepsin C Do pH số loại pepsin bị biến tính số chưa bị biến tính, nên hoạt tính tổng chế phẩm bị giảm 74 Tóm lại, chế phẩm pepsin bền môi trường có pH nhỏ 5, chí pH 1,1 Tuy nhiên bảo quản chế phẩm dạng lỏng, nên giữ pH chế phẩm khoảng từ –5 để đảm bảo hoạt tính giảm không đáng kể % Hoạt tính lại (%) 100 pH = 1,1 pH = 2,2 pH = 3,0 pH = 4,0 pH = 5,0 pH = 6,0 pH = 7,0 95 90 85 80 75 70 Thời gian thí nghiệm (giờ) Hình 11 – Độ bền chế phẩm môi trường pH khác theo thời gian KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA CHẾ PHẨM PEPSIN KHI LỌC QUA CỘT GEL SEPHADEX G-75 Hiện phương pháp lọc qua gel Sephadex dùng rộng rãi để tinh enzym Tùy theo trọng lượng phân tử chất cần tách mà người ta chọn loại Sephadex thích hợp Do pepsin có khối lượng phân tử khoảng 35.000 Da, loại gel chọn Sephadex G – 75 Đối với cột chọn (Φ = 1,8 cm, h=80 cm) cần khoảng 15 g Sephadex G –75 Các hạt Sephadex G – 75 ngâm 500 ml dung dịch đệm 24 để hạt gel trương nở hoàn toàn Sau tiến hành nhồi trình bày phần phương pháp Sau nhồi xong cho dung dịch đệm chảy qua cột 24 để ổn định cột, trước tiến hành cho mẫu để tách phân đoạn 75 Chế độ thực bao gồm : dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 2,2, thể tích mẫu ml, thể tích phân đoạn ml, tốc độ dòng chảy ban đầu khoảng 0,5 ml/phút Sau cho mẫu vào cột ta bắt đầu hứng lấy phân đoạn đo độ hấp thu bước sóng 280 nm Cứ tiếp tục độ hấp thu mẫu bước sóng 280 nm không thay đổi (trong thí nghiệm thu khoảng 68 phân đoạn) dừng Sau ta tiến hành xử lý số liệu để xác định peak chính, từ chọn phân đoạn tương ứng với peak đồ thị để kiểm tra lại xem có hoạt tính pepsin phân đoạn hay không kiểm tra hoạt tính pepsin pH với chất hemoglobin Qua bước thí nghiệm xác định hoạt tính pepsin số phân đoạn thu kết hình – 12 10 0.450 (II) Độ hấp thu 280 nm 0.350 Hoạt tính pepsin 0.300 (III) 0.250 0.200 0.150 (I) 0.100 0.050 0.000 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Số phân đoạn Hình 12 - Các phân đoạn chế phẩm pepsin sau lọc qua cột gel Sephadex G – 75 76 Hoạt độ pepsin (UI/ml) Độ hấp thu bước sóng 280 nm 0.400 Nhận xétù: Qua giản đồ lọc gel, ta thấy với mẫu chế phẩm pepsin ban đầu sau qua cột phân tách thành ba peak (I, II, III), đại diện cho ba nhóm hợp chất có phân tử lượng khác Peak (I) có độ hấp thu bước sóng 280 nm yếu nhất, độ hấp thu cực đại thể phân đoạn thứ 16 (OD280 nm= 0,101), bao gồm phân đoạn Tuy nhiên sau thử hoạt tính pepsin peak cho hoạt tính yếu (0,02 UI/ml) Peak (II) peak có độ hấp thu cao tất peak, độ hấp thu cực đại thể phân đoạn thứ 27 (OD280 nm= 0,391) Bao gồm 10 phân đoạn, độ hấp thu phân đoạn peak chênh lệch lớn, peak hình thành nhọn Kết xác định hoạt tính pepsin, cho thấy peak có hoạt tính enzym cao (cực đại 6,57 UI/ml) hiệu suất thu hồi enzym sau qua cột gel 84,1% Peak (III) peak có diện tích lớn ba peak, độ hấp thu cực đại thể phân đoạn thứ 49 (OD280 nm= 0,248), bao gồm đến 25 phân đoạn Sau kiểm tra hoạt tính pepsin, thấy phân đoạn thuộc peak (III) hoạt tính pepsin Trong kích thước peak lớn, có lẽ chứa lượng lớn hợp chất protein tạp pepsin Các protein tạp có phân tử lượng nhỏ pepsin Vì sau qua lọc gel ta tách bỏ phần lớn protein tạp, chế phẩm thu tương đối tinh khiết Tóm lại, sau qua cột lọc gel Sephadex G – 75, mẫu pepsin phân tách thành ba peak (I, II, III) Trong có peak (II) có hoạt tính pepsin, peak (I) có yếu peak (III) Mặc dù nghiên cứu mặt hạn chế chưa tách loại pepsin (A, B, 77 C, D) mẫu pepsin ban đầu thành peak độc lập Tuy nhiên biết loại pepsin dày động vật có phân tử lượng thường gần việc phân tách loại pepsin khó khăn BƯỚC ĐẦU THỬ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM PEPSIN THU ĐƯC TRONG SẢN XUẤT PEPTON Hiện nay, việc nghiên cứu phân lập để tìm chủng vi sinh vật có lợi để phục vụ cho đời sống công tác kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm quan tâm Trong pepton nguyên liệu thiếu việc tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển Ngoài pepton hỗn hợp peptid ngắn từ –8 acid amin, dễ tiêu hóa Vì pepton xem loại thực phẩm dinh dưỡng đặc biệt dùng cho người bị bệnh giai đoạn hồi phục, pepton bổ sung vào thực loại thực phẩm cho trẻ em suy dinh dưỡng Như biết, pepton sản phẩm thủy phân protein không hoàn toàn enzym protease Trong pepsin enzym ứng dụng để sản xuất pepton (pepton – pepsic) Hiện có nhiều loại pepton, chúng sản xuất từ nhiều loại protein từ nhiều loại enzym khác Trong nghiên cứu thử ứng dụng pepsin thu để sản xuất pepton, dựa hai chất thịt bò cá thát lát Tiến hành theo quy trình nêu phần phương pháp nghiên cứu Khối lượng nguyên liệu cho mẫu thí nghiệm 200 g, xay nhỏ máy xay thịt, sau thêm vào khoảng 800 ml nước cất, cho thêm khoảng ml acid clohydric 37% để điều chỉnh pH môi trường 2,0 Sau bổ sung khoảng g chế phẩm pepsin (bằng 1% theo khối lượng nguyên liệu loại pepsin kết tủa cồn tuyệt đối), hòa tan vào khuấy trộn cho Rồi giữ bếp cách thủy 50 oC 78 Trong trình thủy phân hai chất: thịt bò cá thát lát, xác điïnh hàm lượng nitơ amin hỗn hợp thủy phân theo phương pháp Nihydrin, sau tiến hành lấy mẫu lần, tiến hành xác định Thí nghiệm giúp xác định động học trình thủy phân theo thời gian Quá trình thủy phân chấm dứt dịch lọc không tạo kết tủa với acid nitric đậm đặc Sau chấm dứt phản ứng, hỗn hợp thủy phân trung hòa natri hydrocacbonat đến pH – 8, lấy mẫu để xác định hàm lượng nitơ tổng số nitơ amin pepton thu Chúng xác định hàm lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl hàm lượng nitơ amin theo phương pháp Ninhydrin Mỗi nguyên liệu tiến hành ba mẫu thí nghiệm song song lấy kết trung bình Sau tiến hành hai nguyên liệu thịt bò cá thác lát, từ kết thu xây dựng đường cong thể tương quan hàm lượng nitơ amin thời gian thủy phân (hình – 13) Hàm lượng nitơ amin (mg/l) 900 800 700 600 500 400 Thịt bò Cá thát laù t 300 200 100 0 10 12 Thờ i gian thủ y phân (giờ) Hình 13 – Sự tương quan hàm lượng nitơ amin thời gian thủy phân 79 Bảng 22 – Kết xác định hàm lượng nitơ tổng nitơ amin pepton thu Cơ chất thủy phân Thịt bò Cá thác lát Hàm lượng nitơ tổng số (g/lít) 5,75 Hàm lượng nitơ amin (g/lít) 0,869 Namin/Ntổng (%) 15,1 5,24 0.768 14,7 Nhận xét: Từ hình – 13, thấy trình thủy phân chất thịt bò cá thát lát pepsin chủ yếu xảy Trong giai đoạn hàm lượng nitơ amin tăng đáng kể, giai đoạn từ thứ đến thứ 10, hàm lượng nitơ amin tăng Mặt khác thời giờ, dịch thủy phân sau lọc không tạo kết tủa thử acid nitric đậm đặc Do sử dụng 1% khối lượng chế phẩm pepsin so với nguyên liệu (thịt bò hay thát lát), 50oC, pH 2,0 thời gian thủy phân thích hợp Kết bảng – 22, cho thấy pepton thu cách sử dụng pepsin để thủy phân thịt bò cá thác lát có tỷ lệ Namin/Ntổng 15,1% 14,7% Các sản phẩm pepton đạt yều cầu loại pepton – pepsic (theo Dược điển Việt Nam) 80 PHẦN V KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm trình bày phần 3, rút số kết luận sau: - Tỷ lệ khối lượng màng nhầy so với khối lượng toàn dầy thông thường dao động khoảng 33,6 – 44,8% - Trong số tác nhân kết tủa nghiên cứu, cồn tuyệt đối (tỷ lệ 85% so với thể tích hỗn hợp), muối natri clorua (bão hòa), muối amôn sulfat (bão hòa) cho hiệu suất thu hồi enzym cao (lần lượt 89,9%; 77,1%; 89,1%) ứng dụng sản xuất công nghiệp - Hoạt tính protease theo Dược điển Việt Nam chế phẩm pepsin thu kết tủa cồn tuyệt đối, aceton, izopropanol, muối natri clorua, muối amôn sulfat là: 30 phút, 50 phút, 40 phút, 40 phút, 35 phút Các chế phẩm pepsin đạt yêu cầu tiêu đạm theo Dược điển Việt Nam - Hoạt tính đông tụ sữa chế phẩm pepsin thu kết tủa cồn tuyệt đối, aceton, izopropanol, muối natri clorua, muối amôn sulfat là: 3,18; 2,60; 2,76; 2,58; 2,93 (1/mg.phút) Từ ta thấy chế phẩm pepsin kết tủa cồn tuyệt đối có hoạt tính đông tụ sữa mạnh 81 - Chế phẩm pepsin kết tủa cồn tuyệt đối có nhiệt độ tối ưu 55oC pH tối ưu 2,0 Chế phẩm bền khoảng pH từ 2,0 đến 5,0 nhiệt độ phòng pH 2,0 hoạt tính chế phẩm giảm nhanh nhiệt độ lớn 55oC - Khi cho chế phẩm pepsin qua cột gel Sephadex G –75, xác định peak có hoạt tính protease Cụ thể từ phân đoạn thứ 23 đến phân phân đoạn 33, hoạt tính protease cao thể phân đoạn thứ 27 (giá trị cực đại 6,57 UI/ml) Hiệu suất thu hồi enzym sau qua cột gel 84,1% - Bước đầu thử ứng dụng chế phẩm pepsin để sản xuất thử pepton từ thịt bò cá thát lát Lượng enzym sử dụng 1% so với trọng lượng nguyên liệu, nhiệt độ 50oC, pH 2,0 thời gian thủy phân Sản phẩm pepton từ thịt bò cá thát lát có tỷ lệ Namin/Ntổng 15,1% 14,7% đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam KIẾN NGHỊ Do thời gian thực đề tài có hạn, nên nghiên cứu nhiều hạn chế, theo cần nghiên cứu tiếp số nội dung sau: - Sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion, kết hợp phương pháp lọc gel, để phân tách loại pepsin chế phẩm - Sử dụng phương pháp điện di để xác định thành phần khối lượng phân tử pepsin chế phẩm - Tối ưu hóa pepton thông số quy trình sản xuất pepton (nồng độ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ môi trường, pH môi trường, thời gian thủy phân) 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Dược điển Việt Nam, tập 1, NXB Y học, 1966 [2] Nguyễn Thị Quỳnh Anh - Thu nhận, ứng dụng pepsin proteaza axit A Niger-70 y học chăn nuôi, Luận văn phó tiến só, 1985 [3] Trần Thị Ân cộng – Các phương pháp sinh hóa đại, NXB Khoa học kỹ thuật, 1975 [4] Vũ Ngọc Bội – Nghiên cứu tách chiết pepsin từ dày heo, Tuyển tập Công trình NCKH tập IV, 1995-1999 [5] Nguyễn Trọng Cẩn – Công nghệ enzym, NXB Nông nghiệp, TpHCM, 1998 [6] Nguyễn Hữu Chấn - Enzym xúc tác sinh học, NXB Y học, Hà Nội 1983 [7] Lâm Thị Kim Châu cộng – Thực tập lớn sinh hóa, Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM, 2000 [8] Phạm Thị Trân Châu cộng – Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo dục, 1997 [9] Nguyễn Lân Dũng cộng – Một phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 1978 [10] Trần Ích - Hóa sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội 1975 [11] Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, NXB KH&KT, Hà Nội 2001 [12] Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên – Giáo trình sinh hóa đại, NXB Giáo dục, 1998 [13] Đồng Thị Thanh Thu – Giáo trình sinh hóa bản, Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TpHCM, 1999 [14] Đồng Thị Thanh Thu – Giáo trình sinh hóa ứng dụng, Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TpHCM, 1999 [15] Nguyễn Thị Tiết – Một số nghiên cứu pepsin, pepsin không tan ứng dụng, luận văn thạc só, Đại học Khoa học Tự nhiên TpHCM, 1996 [16] Lê Ngọc Tú– Enzym vi sinh vật, NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội 1978 [17] Lê Ngọc Tú – Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội 2000 [18] The New Encyclopedia Britanica, Vol VII, William Benton Publisher, 1943 – 1973 [19] Pepsinogens and Pepsins http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/stomach/pepsin.htm [20] Belitz H D & Grosch W., Food chemistry, second edition, Springer, 1999 [21] Beatrice Kassell and Patricia A Meitner, Bovine pepsinogen and pepsin, Methods enzymol 1970;19:337-58 [22] David S Goodsell - Pepsin, PDB Molecule of the Month, http://rcsb.nist.gov/pdb/molecules/pdb12_2.html [23] Julie Hodson – Pepsin 3.4.23.1 http://www.mssc.edu/biology/b305/gts/fs98/turner/pepsin.htm [24] Lillian A.Decker, Pepsinogen : pepsin, Worthington Enzyme Manual, Freehold, New Jersey, USA 07728, 1977 [25] Lubert Stryer, Biochemistry, fourth edition, W.H Freeman and Company, New York, 1996 [26] Masaki Suzuki et al., Purification and characterization of goat pepsinogens and pepsins, Elsevier, 10 February 1999 [27] Rodney F Boyer, Modern experimental biochemistry, second edition, The Benjamin /Cummings Pulishing Company, Inc, 1992 [28] Ryle AP., The porcine pepsins and pepsinogens, Methods enzymol 1970;19:316-36 [29] Thomas E.Barman, Enzyme Handbook, Vol II, Spinger-Verlag Berlin Heidelberg, NewYork 1969 [30] Tony Godfrey and Stuart West, Industrial Enzymology, second edition, 1996 Baûng – Tính đặc hiệu enzym protease (các vị trí liên kết chuỗi insulin B oxy hoùa) STT Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 10 11 (↓) ↓ ↓ ↓ 15 16 17 18 19 (↓) (↓) (↓) (↓) ↓ (↓) (↓) (↓) ↓ (↓) (↓) ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) (↓) ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) (↓) Chú thích: Phân cắt mạnh: ↓; phân cắt yếu : (↓) 1- Trypsin (bò) 2- Chymotrypsin A (boø) 3- Chymotrypsin C (heo) 4- Aspergillopeptidase C (Aspergillus oryzae) 5- Protease từ streptomyces griseus (giống trypsin) 6- Subtilisin BPN Ala ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) Lys ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (↓) ↓ (↓) ↓ ↓ ↓ 12 13 14 (↓) ↓ Pro 7- Protease từ Asp oryzae 8- Protease từ Asp flavus 9- Papain (Papaya carica) 10- Ficin III (Ficus glabrata) 11- Chymopapain (Charica papaya) 12- Protease II từ Asp oryzae 13- Protease từ Bacillus subtilis 14- Thermolysin (B thermoproteolyticus Rokko) 15- Pepsin A (heo) 16- Rennin (bê) 17- Protease từ Candida albicans 18- Protease từ Mucor miehei 19- Protease từ Rhizopus chinesis ↓ ... pháp tách chiết thu nhận chế phẩm pepsin [2][4][15] Chúng dựa theo quy trình tách chiết thu nhận pepsin Payeba cộng Trong nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa đến hiệu suất thu hồi chế phẩm. .. III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KHẢO SÁT TỶ LỆ % TRỌNG LƯNG MÀNG NHÀY SO VỚI TOÀN BỘ DẠ DÀY 47 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC TÁC NHÂN KẾT TỦA HIỆU SUẤT THU HỒI CHẾ PHẨM PEPSIN LÊN 47 2.1 2.2 Kết tủa pepsin. .. VIỆT 62 HOẠT TÍNH ĐÔNG TỤ SỮA 63 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐÔÄ VÀ PH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA CHẾ PHẨM PEPSIN 64 5.1 5.2 nh hưởng nhiệt độ nh hưởng pH 64 68 KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA CHẾ PHẨM PEPSIN LỌC KHI