ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ NHƯ UYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH HEMOPHILIA A CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LUẬN VĂN THẠC SĨ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Hướng dẫn khoa học: Học viên thực hiện: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG PHẠM THỊ NHƯ UYÊN TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2010 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI PHÒNG DI TRUYỀN BỆNH VIỆN TỪ DŨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: ………………………………………………………… (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: ………………………………………………………… (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn Thạc sĩ bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Ngày 10 tháng 08 năm 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC ĐỘC LẬP TỰ DO HẠNH PHÚC Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 07 năm 2010 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: PHẠM THỊ NHƯ UYÊN Ngày tháng năm sinh: Chuyên ngành: 14 – 07 – 1980 CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giới tính: Nữ Nơi sinh: Tp Cần Thơ MSHV: 03108152 Khóa: 2008 TÊN ĐỀ TÀI: “Xây dựng qui trình chẩn đốn đột biến gen gây bệnh Hemophilia A” NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:  Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR  Lựa chọn kỹ thuật sinh học phân tử thích hợp để chẩn đoán đột biến gen gây bệnh Haemophilia A  Xác định đột biến thường gặp  Xây dựng qui trình chẩn đốn đột biến gen gây bệnh Hemophilia A NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Tháng 06 năm 2009 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Tháng 07 năm 2010 HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Nội dung đề cương Luận văn Thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN   Tp HCM, ngày tháng năm 2010 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN   Tp HCM, ngày tháng năm 2010 GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học tạo điều kiện cho tơi hồn thành luân văn tốt nghiệp Ban Chủ nhiệm Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi để tơi hoàn thành luân văn tốt nghiệp Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp HCM hỗ trợ giúp đỡ việc thu thập mẫu ThS Nguyễn Khắc Hân Hoan PGS.TS Nguyễn Đức Lƣợng tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức quý giá chân thành động viên khoảng thời gian thực luận văn tốt nghiệp Tập thể Y – Bác sĩ, Thầy Cơ Anh Chị – Phịng Di truyền tận tâm bảo, đóng góp nhiều ý kiến q báu, hết lịng hỗ trợ cho tơi suốt khoảng thời gian thực luận văn Phòng Di truyền Tập thể lớp CH2008 với ngƣời bạn thân tôi, ngƣời bạn gắn bó, chia sẻ tơi buồn vui suốt q trình học tập tơi nhƣ hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ tơi thời gian thực luận văn Và tất lời ghi ơn sâu sắc xin đƣợc dành cho Ba Mẹ sinh thành, dƣỡng dục, dạy dỗ để có đƣợc nhƣ ngày hơm nay, với tất kính trọng, niềm tự hào lịng biết ơn chân thành Và ngƣời giúp cho lời cảm ơn thêm trọn vẹn: cảm ơn Trung – ngƣời truyền cho tự tin, niềm lạc quan sống, bên ủng hộ cho Tp HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2010 Phạm Thị Nhƣ Un i TÓM TẮT XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Mở đầu: Hemophilia A bệnh di truyền đơn gen phổ biến, liên kết với nhiễm sắc thể X, thiếu yếu tố đông máu số VIII Bệnh gặp khắp nơi giới, không phân biệt địa lý hay màu da Nguyên nhân gây bệnh đột biến gen mã hóa yếu tố đơng máu Bệnh thƣờng gặp nam Tỷ lệ mắc bệnh 1/5000 bé trai sơ sinh 1/3 khơng có tiền sử gia đình đột biến gen Phƣơng pháp PCR có hiệu việc xác định đột biến cá thể mang gen bệnh Mục tiêu: - Tối ƣu hóa điều kiện phản ứng PCR - Lựa chọn kỹ thuật sinh học phân tử thích hợp để chẩn đốn đột biến gen gây bệnh Hemophilia A - Xác định đột biến thƣờng gặp - Xây dựng quy trình chẩn đốn đột biến gen gây bệnh Hemophilia A Phƣơng pháp nghiên cứu: 40 bệnh nhân gia đình bệnh nhân nghiên cứu đƣợc xác định đột biến phân tích liên kết gen để xác định cá thể mang gen bệnh dựa phƣơng pháp PCR, điện di mao quản CEQ TM 8000 phân tích tự động phần mềm GeneMarker Kết quả: Đã xác định đƣợc 4/40 (10%) mẫu có đột biến đảo đoạn intron 22, 3/4 (75%) bà mẹ 1/2 (50%) gái gia đình có trai bị bệnh có kiểu gen dị hợp Kết luận: Xây dựng thành cơng quy trình chẩn đốn đột biến gen gây bệnh Hemophilia A Trên sở quy trình áp dụng vào chẩn đốn trƣớc sinh, xác định cá thể mang gen bệnh nhƣ cá thể mang đột biến ii SUMMARY A PROCEDURE OF DIAGNOSIS OF MUTATIONS CAUSING HAEMOPHILLIA A Introduction: Haemophillia A is an X-linked bleeding disorder caused by mutations in the F8 gene The disease often is detected in many places on the world, and in all ethnic groups The cause of pathogenesis is the mutations coding blood coagulators This disease often affects in male The prevalance is in 5000 neonatals , one third has not the family history and can be caused by mutations Polymerase Chain Reaction method is effective to determine mutations and inherited gene carriers Objective: - To optimize the conditions of performing PCR test - To choose bio-molecular technologies available to diagnose mutations causing Haemophillia A - To determine mutations frequently detected in clinical cases - To establish a procedure to diagnose multations causing Hemophillia A Method: Forty DNA samples of patient and and their relatives participating in this research are used to determine mutations and the gene linked analysing method is applied to determine Haemophillia A causing gene carriers with PCR , capillary electrophoresis with CEQTM 8000 and automated analysis method with Gene Marker software Results: There are out of 40 patients with inversion intron 22 mutation, of mothers and of daughters with heterogeneous Haemophillia A The percentage of each situation is 10 %, 75 % and 50%, respectively Conclusion: One Haemophillia A diagnosing protocol is establish succesfully It is useful for prenatal diagnosis, determination of disease causing gene carriers as well as mutation carriers iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách các chƣ̃ viế t tắ t viii Danh sách các bảng x Danh sách các hình xii Chƣơng 1: LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I GIỚI THIỆU 2.1 Lƣợc sử bệnh Hemophilia 2.2 Đặc điểm bệnh Hemophilia 2.3 Đặc điểm phân tử bệnh Hemophilia II CÁC THỂ ĐỘT BIẾN THƢỜNG GẶP 2.4 Phân loại đột biến 2.4.1 Đột biến đảo đoạn 10 2.4.2 Đột biến lặp trình tự ngắn 10 2.4.3 Đột biến ảnh hƣởng đến cấu trúc 10 iv 41 Keeney S., Mitchell M and Goodeve A (2005) The molecular analysis of Haemophilia A: a guideline from the UK haemophilia centre doctor’s organization haemophilia genetics laboratory network, 11, 1-11 42 Malacinski G M Essentials of molecular biology Indiana university, fourth edition, 193-196 43 Mori P G., Maura Aquila, et al (1997) Inversion mutation as major cause of severe Hemophilia A in Italian patients, 82, 75-76 44 Naylor J A., Nicholson P., Giannelli F., et al (1996) A novel DNA inversion causing severe Hemophilia A Blood, 87 (8), 3255-3261 45 Oldenburg J., Ananyeva N M and Saenko E L (2004) Molecular basis of haemophilia A, 10 (4), 133-139 46 Oranwiroon S., Yenchitsomanus P., et al (2001) Determination of haemophilia A carrier status by mutation analysis, 7, 20-25 47 Pecorara M., Casarino L., Cao A., Pirastu M., et al (1987) Hemophilia A: Carrier detection and prenetal diagnosis by DNA analysis Blood, 70 (2), 531-535 48 Peyvandi F., Mannucci P M et al (2006) Genetic diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders, 12 (3), 82-89 49 Poláková H., Zmetáková I and Kádasi L’ (2003) Long distance PCR in detection of inversion mutations of F8 gene in hemophilia A patients Gen Physiol Biophys, 22, 243-253 50 Pruthi K R., et al (2005) Hemophilia: A practical approach to genetic testing Genetics in clinical practice, 80 (11), 1485-1499 51 Raza S T., Husain N., Bhatt A N., Avneesh (2007) HindIII polymorphism in carrier detection of Hemophilia A in India: A new primer design Clinical and Applied Thrombosis, 13 (4), 432-434 52 Rossetti L C., Radic C P., et al (2005) Genotyping the hemophilia A inversion Hotpot by use of Inverse PCR Clinical Cheistry, 51 (7), 1154-1158 71 53 Rumena Petkova, Ivo Kremensky, et al (2004) Genetic analysis of Hemophilia A in Bulgaria BMC Blood Disorders (2) 54 Sánchez L S., Herrmann F H., et al (2004) Molecular diagnosis of hemophilia A and B Report of five famalies from Costa Rica Rev Biol Trop, 52 (3), 521-530 55 Shin-Yu Lin, Chien-Nan Lee, et al (2008) Mutation spectrum of 122 hemophilia A families from Taiwanese population by LD-PCR, DHPLC, multiplex PCR and evaluating the clinical application of HRM BMC Medical Genetics, 9, 53 56 Strauss H S (1967) The perpetuation of hemophilia by mutation Pediatrics, 39 (2), 186-193 57 Tuddenham E G D., Cooper D N., Giannelli F., Antonarakis, et al (1991) Hemophilia A: database of nucleotide substitutions, deletion, insertions and rearrangements of factor VIII gene Nucleotide Acids Research, 19 (18), 48214833 58 Youssoufian H., Antonarakis S E., Kazazian H H., et al (1988) Nonsense and missense mutations in Hemophilia A: Estimate of the relative mutation rate at CG dinucleotides The American Society of Human Genetics, 42, 718-725 72 PHỤ LỤC  Phụ lục Kiểm tra ngân hàng gen cặp mồi (ATSEA SRY) dùng để chạy phản ứng multiplex PCR xác định giới tính, thơng qua trang http://genome.ucsc.edu • ATSEA UCSC In-Silico PCR chr16:215255+215571 317bp GCG ATC TGG GCT CTG TGT TCT cagtattgga gggaaggagg ggagaagctg agtgatgggt ccgggggctt cgcaggaact cggtcgtccc cactgtcgtc gcggcctggg gttcacttgg ggggcgcctt ggggaggttc tagcccctga gcaccggagc tgcggcccgg gtggagcgga gcagtcccgg gccggcccgc ggcgtctcct ggggtccttg agtcggacgg gcgtttgtgc gtctcccggc ttcccatatc gcacaaagat tgtcacttca ctaagcgtat tggaag CG TGT CGG GGC TCA GGG AAC Primer Melting Temperatures Forward: 64.1oC gcg atc tgg gct ctg tgt tct Reverse: 69.6oC gtt ccc tga gcc ccg aca cg • SRY UCSC In-Silico PCR chrY:2655173-2655265 93bp ATA AGT ATC GAC CTC GTC GGA A ggcgaagatg ctgccgaaga attgcagttt gcttcccgca gatcccgct T CGG TAC TCT GCA GCG AAG TGC Primer Melting Temperatures Forward: 60.0oC ata agt atc gac ctc gtc gga a Reverse: 67.2oC gca ctt cgc tgc aga gta ccg a 12 • AMEL UCSC In-Silico PCR chrY:6737872-6738089 218bp ACCTCATCCTGGGCACCCTGG ttatatcaac ttcagctatg aggtaatttt tctctttact aattttgatc actgtttgca ttagcagtcc cctgggctct gtaaagaata gtgggtggat tcttcatccc aaataaagtg gtttctcaag tggtcccaat tttacagttc ctaccatcag cttcccagtt taagctCTGA TGG TTG GCC TCA AGC CT Primer Melting Temperatures Forward: 69.9oC acc tca tcc tgg gca ccc tgg Reverse: 65.9oC agg ctt gag gcc aac cat cag • IVS22 UCSC In-Silico PCR chrX:154103999+154104081 83bp TTC TAA GAA TGT AGT GTG TGT GTG tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtg taga gagagagaga g TCT ATA ATG TGG GCA TTA Primer Melting Temperatures Forward: 54.7 oC ttc taa gaa tgt agt gtg tgt gtg Reverse: 46.9 oC taatgcccacattataga 13 • VIIIBCL UCSC In-Silico PCR chrX:154129694-154130368 675bp CTA CAT GCT GGG ATG AGC acactttttc tggtgtacag caatagtgag ta gcaatgtg ggcagaggtt ccctacctac tcagcctact tctttacagc tttcttcctt tctggaatgg ttgcttgtgt caggaaataa atacaagttt acatcattat caaatttaaa atgaatattg ctggtagaaa tcatcagagt tctcagagta gggcagatat acttgaagct ttgaacactt tgtacctgaa gctctaaata attgacaaaa aaaaaatacc acctcatttt cacaacttgg taaagctcga agatctccag tagcagattt tggaatttaa tgttgattta gttaccagat aacttagaaa tactacttgg aagagtttgg agatttaacc ctaaacaagt aagagagcca ctggtctatt tatgtacgga ccccagtttc ttcagctgta aaatgtgaat cattctagca cctgttagga ttaattaaat gaactaatac agtaaaacgt tgagtacagt tcttggcaca tttaaacact aaaaaatagc atttgttgac gttctcccat tttcattgac ttacatttga gaagctgaat tttgtgcact tctagttact gtgttccacc cgtttcattt cagagtgtcA GAC TCC CCT GGG AAT GG Primer Melting Temperatures Forward: 55.0 oC cta cat gct ggg atg agc Reverse: 59.8 oC cca ttc cca ggg gag tct  Phụ lục Kiểm tra thông số cặp mồi (ATSEA SRY) dùng để chạy phản ứng multiplex PCR xác định giới tính, thơng qua phần mềm thiết kế mồi PerlPrimer v1.1 14 • ATSEA Reverse vs Reverse: -1.32 kcal/mol 5' GTTCCCTGAGCCCCGACACG 3' ││ • • • ││ 3' GCACAGCCCCGAGTCCCTTG 5' More stable non-extensible primer-dimers (at 37°C), if any Forward vs Forward: -2.05 kcal/mol 5' GCGATCTGGGCTCTGTGTTCT 3' ││ • • • • • • • ││ 3' TCTTGTGTCTCGGGTCTAGCG 5' Forward vs Reverse: -4.59 kcal/mol 5' GCGATCTGGGCTCTGTGTTCT 3' • • • • ││ •││││││ • • • • • • │ 3' GCACAGCCCCGAGTCCCTTG 5' 15 • SRY Forward vs Forward: -2.49 kcal/mol 5' ATAAGTATCGACCTCGTCGGAA 3' │ • • ││││• • • ││││ • • │ 3' AAGGCTGCTCCAGCTATGAATA 5' Forward vs Reverse: -1.45 kcal/mol 5' ATAAGTATCGACCTCGTCGGAA 3' ││││ •│ 3' AGCCATGAGACGTCGCTTCACG 5' Reverse vs Reverse: -2.07 kcal/mol 5' GCACTTCGCTGCAGAGTACCGA 3' │││ • • • • • • • • • • • • │││ 3' AGCCATGAGACGTCGCTTCACG 5' More stable non-extensible primer-dimers (at 37°C), if any Reverse vs Reverse: -4.81 kcal/mol 5' GCACTTCGCTGCAGAGTACCGA 3' • • • • • • • • ││││││ • • • • • • • • 3' AGCCATGAGACGTCGCTTCACG 5' 16  Phụ lục Thành phần ly trích DNA “High Pure PCR Template Preparation Kit” Roche Hóa chất Binding Buffer Thể tích 20 ml Thành phần • M guanidine-HCl, 10mM urea, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100 , pH 4.4 (25oC) Bột + 4,5 ml • Proteinase K dạng bột khô Proteinase K nước cất lần Inhibitor Removal Buffer 33 ml + 20 ml • M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH Ethanol 100% Washing Buffer Elution Buffer 6.6 (25oC) 20 ml + 80 ml • 20 mM NaCl, mM Tris-HCl, pH 7.5 Ethanol 100% (25oC) 40 ml • 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 (25oC)  Phụ lục Thành phần hóa chất cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính Hóa chất Buffer (Roche) Thành phần • 500 mM Tris-HCl, 100 mM KCl , 50 mM (NH4)2SO4, pH 8.3 (25oC) MgCl2 (Roche) • 100% MgCl2 dNTP’s (Roche) • dATP, dGTP, dCTP dTTP, 10 mM loại DMSO (Sigma) • 100% DMSO Fast Start Taq (Roche) • Buffer enzyme [20 mM Tris-HCl, pH 9.0 (25oC), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, mM DTT, 0.2% Tween 20, 50% glycerol] 17  Phụ lục Thành phần hóa chất dùng cho điện di gel agarose Hóa chất Thành phần Đệm Tris borate/EDTA • Tris base (0,09 M): 10,8 g • Boric acid (0,09 M): 5,5 g (TBE) 1X (Sigma) • Na2EDTA (0,002 M): 0,745 g • Nước cất vừa đủ lít Đệm tải xanh (cyanole • 10 mM Tris-HCl, pH 7.6 bromophenol blue) • 0,03% bromophenol blue (300 bp) • 0,03% xylene cyanole FF (4000 bp) (Promega) • 60% glycerol • 60 mM EDTA Agarose (Bio – Rad) • 100% agarose bromide • 100% ethidium bromide Ethidium (Nam Khoa)  Phụ lục Kết khảo sát đột biến đảo đoạn intron 22 12kb 12kb 10kb 10kb MK (marker): thang chuẩn 1kb plus H , 250…: mã số mẫu 18 12kb MK (marker): thang chuẩn 1kb plus 166…: mã số mẫu 10kb  Phụ lục - Kết điện di sản phẩm PCR phân tích liên kết gen intron 13 MK (marker): thang chuẩn 100bp 253…: mã số mẫu 141bp - Kết phân tích liên kết gen intron 13 phần mềm GeneMarker 19 20  Phụ lục - Kết điện di sản phẩm PCR phân tích liên kết gen intron 22 85bp 85bp MK (marker): thang chuẩn 100bp - mãkết sốgen mẫutại intron 22 phần mềm GeneMarker Kết phân166…: tích liên 21  Phụ lục - Kết điện di sản phẩm PCR phân tích liên kết gen intron 19 717bp MK (marker): thang chuẩn 100bp 166…: mã số mẫu 22  Phụ lục 10 Phiếu số PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN BỆNH NHÂN Mã số HS XÉT NGHIỆM HEMOPHILIA A TT HỌ TÊN NGÀY SINH D TỘC GIỚI NGHỀ NG NGÀY LM Ngày ghi phiếu ĐỊA CHỈ A Đ.THOẠI B NƠI GIỚI THIỆU C GHI CHÚ D GIA HỆ CHẨN ĐOÁN: CHỈ SỚ HUYẾT HỌC VÀ SINH HÓA HUYẾT ĐỒ A B C WBC NEU LYM MONO RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT MPV FERRITINE (ng/ul) HAEMOGLOBIN (%) HBA HBA2 HBE HBF KẾT QUẢ + GHI CHÚ D Ngày kết 23 SỞ Y TẾ TP HCM BỆNH VIỆN TỪ DŨ CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc GIẤY ĐỜNG Ý XÉT NGHIỆM TÌM ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH Sau bác sĩ giải thích tư vấn rối loạn di truyền, khả mang đột biến gen gây bệnh, nguy mang đột biến gen, cần thiết xét nghiệm DNA tìm đột biến gen Tơi đờ ng ý để bác sĩ xét nghiệm tìm đột biến gen cho tơi Tơi hồn tồn tự nguyện việc khơng khiếu nại sau Xin chân thành cảm ơn STT NGÀY HỌ TÊN 24 KÝ TÊN ... GGCCCTACAACCATTCTGCCTTTCACTTTCAGTGCAATA 3’ A 36 78,4 5’ CACAAGGGGGAAGAGTGTGAGGGTGTGGGATAAGAA 3’ B 40 77,3 5’ CCCCAAACTATAACCAGCACCTTGAACTTCCCCTCTcat a 3’ Mồi Trình tự nucleotide 3.1.4.3 Mồi cho phản ứng PCR d? ?a vào... 57,9 5’ TET-TGCATCACTGTACATATGTATCTT 3’ IVS13- 2A 22 53,4 5’ CCAAATTACATATGAATAAGCC 3’ IVS22-1B 24 54,7 5’ Hex TTCTAAGAATGTAGTGTGTGTGTG 3’ IVS22-2B 18 46,9 5’ TAATGCCCACATTATAGA 3’ 30 3.1.4.4... bị bệnh Hemophilia Albania 265 Algeria 1291 Argentina 1952 Armenia 210 Australia 1760 Austria 500 Azerbaijan 846 Bahrain 20 Bangladesh 351 Belarus 559 Belgium 831 Belize 14 Bosnia-Herzegovina