i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  LÂM THỊ THU HƯƠNG ĐẶC ĐIỂM HLA VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG HLA TRÊN BỆNH NHÂN GHÉP THẬN TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Mọi kết thu không chỉnh sửa, chép từ nghiên cứu khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả iii LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Thị Ngọc Hà, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Cô, người dành nhiều thời gian tâm huyết để hướng dẫn tận tình, giúp đỡ tơi trình học tập, nghiên cứu viết luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trường Đại học Khoa học Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học tồn thể thầy ngồi trường giảng dạy giúp trau dồi thêm nhiều kiến thức phục vụ cho việc học tập nghiên cứu thân Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập, nghiên cứu làm luận văn Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học viên Lâm Thị Thu Hương iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình suy thận mạn giới Việt Nam 1.2 Bệnh thận mạn suy thận mạn giai đoạn cuối 1.2.1 Chẩn đoán bệnh thận mạn suy thận mạn giai đoạn cuối 1.2.2 Các giai đoạn suy thận mạn 1.2.3 Các biến chứng suy thận mạn giai đoạn cuối 1.2.4 Các phương pháp điều trị thay thận 1.3 Khái quát ghép thận 1.3.1 Đại cương 1.3.2 Vai trò hòa hợp HLA ghép thận 12 1.3.3 Kiểu gen miễn dịch, hòa hợp tổ chức ghép thận 13 1.3.4 Biến chứng ghép thận 13 1.4 Phức hợp hịa hợp tổ chức (MHC) hay kháng nguyên bạch cầu người (HLA) 15 1.4.1 Giải phẫu vùng gen 15 1.4.2 Cấu trúc phân tử HLA 17 1.4.3 Chức HLA 21 1.5 Các kỹ thuật xác định HLA - MHC 22 1.5.1 Kỹ thuật huyết học – Thử nghiệm gây độc lympho bào 22 1.5.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử 23 1.5.3 Kỹ thuật PCR - SSP 24 1.5.4 Độ mẫn cảm trước ghép người nhận 24 v 1.5.5 Kỹ thuật tiền mẫn cảm kỹ thuật Miễn dịch – gắn men (ELISA) (Panel reactive antibody test by ELISA) 25 1.5.6 Kỹ thuật thực LABSCREEN kit (tìm kháng thể kháng HLA) 25 1.6 Các phương pháp theo dõi thận, đánh giá chức thận ghép 26 1.7 Tình hình nghiên cứu ghép thận Việt Nam 27 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng 28 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 28 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 28 2.2.2 Thời gian nghiên cứu: 28 2.3 Các tiêu nghiên cứu 29 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu 29 2.4.2 Phương pháp xử lý số liệu 29 2.4.3 Kỹ thuật định type HLA độ phân giải cao cho Locus (A, B, C, DR, DQ, DP) kỹ thuật PCR - SSO 29 2.4.4 Kỹ thuật thực LABSCREEN kít ONE LAMDA (Kháng thể kháng HLA) 32 2.4.5 Định lượng Creatinin máu 34 2.4.6 Định lượng ure máu 34 2.5 Sơ đồ nghiên cứu 35 2.6 Tuân thủ vấn đề đạo đức nghiên cứu 36 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 37 vi 3.1 Đặc điểm chung tuổi, giới, BMI người cho thận người nhận thận 37 3.2 Đặc điểm HLA hòa hợp HLA cặp ghép thận 39 3.3 Đặc điểm kháng thể kháng HLA người nhận thận 43 3.4 Liên quan type HLA với chức thận người nhận thận sau ghép 44 3.5 Sử dụng thuốc ức chế miễn dịch bệnh nhân ghép thận 47 3.6 Liên quan kháng thể kháng HLA với nồng độ Creatinin người nhận sau ghép 49 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Khuyến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 vii DANH MỤC VIẾT TẮT Viết đầy đủ Chữ viết chữ DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamin tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked Immunosorbent assay HLA Human Leucocyte Antigen MHC Major Histocompatibility Complex PCR Polymerase chain reaction RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SSO Sequence Specific Oligoprobes SSP Sequence Specific primers SAPE (R-Phycoerythrin-Conjugated Streptavidin) PE P-Phycoerythrin MDRD Modification of Diet in Renal Diseases BMI Body Mass Index viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giai đoạn suy thận mạn tính theo mức lọc cầu thận Bảng 3.1 Đặc điểm chung tuổi, BMI người cho thận 37 người nhận thận 37 Bảng 3.2 Đặc điểm chung giới người cho thận người nhận thận 37 Bảng 3.3 Quan hệ người cho thận người nhận thận 39 Bảng 3.4 Tỷ lệ tương thích HLA cặp ghép thận 40 Bảng 3.5 Sự hòa hợp HLA theo lớp 41 Bảng 3.6 Phân bố HLA theo huyết thống 42 Bảng 3.7 Đặc điểm kháng thể kháng HLA người nhận thận 43 Bảng 3.8 Nồng độ Creatinin Ure huyết sau ghép thời điểm 44 Bảng 3.9 Liên quan hòa hợp HLA nồng độ ure huyết sau ghép 45 Bảng 3.10 Liên quan số lượng alen HLA hòa hợp với chức thận sau ghép (nồng độ creatinin sau ghép) 46 Bảng 3.11 Liều Tac nồng độ Tac bệnh nhân ghép thận 47 Bảng 3.12 Liên quan số lượng alen HLA hòa hợp với nồng độ thuốc ức chế miễn dịch Tac cặp ghép thận 48 Bảng 3.13 Liên quan kháng thể kháng HLA với nồng độ Creatinin người nhận sau ghép 49 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh sau ghép thận 11 Hình 1.2: Vùng HLA nhiễm sắc thể (healthvietnam.vn) 16 Hình 1.3 Tóm tắt cấu trúc hệ HLA (healthvietnam.vn) 18 Hình 1.4 Phức hệ MHC loại I (vi.wikipedia.org) 19 Hình 1.5 Phức hệ MHC loại II (vi.wikipedia.org) 20 Hình 3.1 Tỷ lệ ghép thận nam nữ 37 Hình 3.2 Phân bố độ tuổi lúc ghép thận 38 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ghép thận xem phương pháp điều trị thay thận suy giai đoạn cuối hiệu nhất, thay chức tiết mà hồi phục chức nội tiết thận Ghép thận đỉnh cao tiến y học nói chung ngành thận học, niệu học, miễn dịch học nói riêng Nhờ hiểu biết chế thải ghép phát minh thuốc giảm miễn dịch mới, ghép thận có nhiều thành cơng Nguồn thận cho từ người sống người chết não Nhiều nghiên cứu giới cho thấy ghép thận giảm đáng kể nguy tử vong, bệnh tim mạch cải thiện chất lượng sống so với lọc máu chu kì [1], [15], [27] Trên 60 năm kể từ thành công hai trường hợp ghép thận Boston anh chị em sinh đôi khác trứng giới có 400.000 trường hợp ghép [15], [27] Trong ghép tạng nói chung ghép thận nói riêng, hòa hợp miễn dịch quan trọng, coi tiêu chuẩn bắt buộc định đến thành công ca ghép Để đánh giá hòa hợp mặt miễn dịch, xét nghiệm HLA (Human leucocyte antigen) - kháng nguyên bạch cầu người xét nghiệm tuyển chọn cặp ghép cho nhận HLA nhóm gen mã hố cho protein trình diện kháng nguyên bề mặt tế bào đa số động vật có xương sống Những protein đóng vai trị quan trọng tổ chức miễn dịch thể chế giao tiếp tế bào HLA protein quan trọng liên quan đến thải ghép, đặc biệt năm đầu sau ghép Việc lựa chọn cặp ghép phù hợp kết hợp dùng thuốc ức chế miễn dịch làm tăng tỷ lệ thành công ghép [1], [15], [17], [27] Trên giới có nhiều nghiên cứu HLA ghép tạng, nhiên nhiều quan điểm khác Ở Việt Nam, số lượng nghiên cứu 43 3.3 Đặc điểm kháng thể kháng HLA người nhận thận Bảng 3.7 Đặc điểm kháng thể kháng HLA người nhận thận Đặc điểm kháng thể kháng Người nhận Tỷ lệ (%) Anti HLA-A 4,0 Anti HLA-B 12,0 Anti HLA-DR 16,0 Anti HLA-DQ 12,0 Âm tính 18 72,0 HLA Kết bảng 3.7 cho thấy: Âm tính với kháng thể kháng HLA chiếm tỷ lệ cao 72,0%, có bệnh nhân xuất kháng thể kháng HLA-A số cặp bệnh nhân ghép thận, kháng thể kháng HLA-DR chiếm tỷ lệ 16,0% Hơn nửa cặp ghép khơng có kháng thể kháng HLA yếu tố thuận lợi để tiên lượng ghép tốt Việc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch hạn chế Tuy nhiên lại gần nửa số trường hợp có kháng thể kháng HLA, nguyên nhân chủ yếu bệnh nhân trước có truyền máu Nhiều nghiên cứu cho thấy kháng thể hình thành trước ghép lưu thông máu người nhận thận gây thải ghép tối cấp, gây chức thận ghép tức ghép Kháng thể hình thành người ghép tạng trước tạng ghép bị đào thải Những phụ nữ sinh đẻ nhiều lần hình thành kháng thể kháng HLA chống lại kháng ngun rời từ phơi, chống lại quan ghép lấy từ chồng con, người cho có kháng nguyên tương ứng với 44 kháng thể có sẵn Truyền máu nhiều lần từ người cho khơng đồng nhóm HLA dẫn đến hình thành kháng thể kháng HLA tiểu cầu bạch cầu nơi kháng nguyên HLA biểu nhiều Trong trường hợp này, phản ứng thải ghép xảy sau ghép kháng thể lưu hành phản ứng lắng đọng nhanh nội mô huyết quản quan ghép Một số nghiên cứu cho thấy kháng thể kháng HLA yếu tố nguy gây chức thận sớm Kháng thể kháng HLA kích hoạt thải ghép cấp dịch thể xuất sớm làm giảm chức thận nhiều so với thải ghép cấp tế bào [13], [23], [26], [39] Theo nghiên cứu Lee PC (2007) thấy kháng thể kháng HLA hình thành sớm năm đầu thời gian sống thêm năm ghép thận giảm từ 70% xuống 53% Ở nhóm bệnh nhân có kháng thể kháng HLA dương tính trước ghép tỉ lệ chức thận ghép tăng lên tháng đầu sau ghép [30] 3.4 Liên quan type HLA với chức thận người nhận thận sau ghép Bảng 3.8 Nồng độ Creatinin Ure huyết sau ghép thời điểm Chỉ số tuần Creatinin 110,3 ± (µmol/L) Ure (µmol/L) 39,1 9,7±3,6 tuần tháng tháng tháng tháng 101,8 114,7 ± 108,5 ± 106,4 ± 105,4 ± ± 39,8 21,7 22,6 7,1±2,5 6,9±1,8 10,9 ± 5,4 59,3 35,4 6,7±3,2 6,6±1,7 p >0,05 >0,05 Kết nghiên cứu cho thấy: chức thận sau ghép thông qua theo dõi nồng độ ure creatinin huyết qua thời điểm có xu hướng ổn định dần, nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (bảng 3.8) Tại thời điểm nghiên cứu sau tháng, tháng chức thận nhóm nghiên cứu giới hạn ổn định Kết có phần lớn cặp ghép nghiên cứu huyết thống 45 (19/25 cặp chiếm 76%) hầu hết bệnh nhân nghiên cứu dùng loại thuốc ức chế miễn dịch tacrolimus từ lúc khởi đầu Kết nghiên cứu tương tự kết nghiên cứu Trương Quý Kiên (2016) Yakubu (2018) [6], [55] Bảng 3.9 Liên quan hòa hợp HLA nồng độ ure huyết sau ghép Chỉ số Ure bình thường Ure1 (µmol/l) Ure (µmol/l) Ure (µmol/l) Ure (µmol/l) 2,5 - 7,5 (µmol/l) Hịa hợp ≤3 alen (n=16) Hịa hợp >3 alen (n=9) p 7,1±2,3 7,1±2,4 >0,05 7,0±1,7 6,9±2,0 >0,05 6,8±2,2 6,7±3,1 >0,05 6,9±2,7 6,1±1,1 0,05) Những cặp ghép có hịa hợp alen, nồng độ ure giảm dần sau tháng có ý nghĩa thống kê (p0,05 >0,05 3 alen (n=16) (n=9) Tac1 (µmol/l) 7,2 ± 4,7 6,8 ± 4,1 >0,05 Tac2 (µmol/l) 6,9 ± 4,1 6,7 ± 1,9 >0,05 Tac (µmol/l) 6,8 ± 3,8 5,6 ± 2,7