HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 62 01 12 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hà Viết Cường TS Trịnh Xuân Hoạt NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành i LỜI CẢM ƠN Luận án có sử dụng phần kết đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chổi rồng bệnh thán thư hại sắn” Bộ Nông nghiệp PTNT cấp kinh phí thực cho TS Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng luận án Để hoàn thành luận án này, cố gắng thân, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình q thầy, q người thân Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Hà Viết Cường TS Trịnh Xuân Hoạt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp Tôi xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình cán Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc Tôi xin trân trọng cảm ơn nhà khoa học nhiệt tình trao đổi, góp ý cho vấn đề, giải pháp, q trình thực đề tài hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới cán kỹ thuật bà nông dân nhiều nơi tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực đề tài Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời tri ân tới tất người thân gia đình, người ln bên cạnh động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .2 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Cây sắn 2.1.1 Lược sử nguồn gốc phân loại sắn .5 2.1.2 Giá trị sử dụng giá trị dinh dưỡng 2.1.3 Tình hình sản xuất sắn giới 2.1.4 Tình hình sản xuất sắn Việt Nam 2.2 Phytoplasma hại thực vật .7 2.2.1 Lịch sử phát phytoplasma 2.2.2 Phân loại phytoplasma 2.2.3 Tầm quan trọng phytoplasma 12 2.2.4 Đặc điểm hình thái phytoplasma .13 2.2.5 Triệu chứng bệnh phytoplasma gây 14 2.2.6 Cơ chế gây bệnh phytoplasma 14 2.2.7 Sự đa dạng phytoplasma .15 2.2.8 Lan truyền phytoplasma 16 2.2.9 Phương pháp chẩn đoán phytoplasma .20 iii 2.2.10 Biện pháp phòng chống 26 2.3 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại sắn 27 2.4 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật Việt Nam 32 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 36 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 36 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 37 3.2 Nội dung nghiên cứu 37 3.2.1 Điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3.2.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 37 3.2.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3.2.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 38 3.2.5 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 38 3.3 Phương pháp nghiên cứu 39 3.3.1 Phương pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39 3.3.2 Phương pháp phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 40 3.3.3 Phương pháp định danh phân tử phân tích phả hệ 44 3.3.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 46 3.3.5 Phương pháp xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 47 3.4 Phương pháp tính xử lý số liệu 50 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 51 4.1 Mô tả triệu chứng điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 51 4.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh 51 4.1.2 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mơ PCR 54 4.2.1 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 54 iv 4.2.2 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm mô 57 4.2.3 Phát phytoplasma hại sắn kỹ thuật PCR 59 4.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4.3.1 Kết định danh giải trình tự sản phẩm PCR 65 4.3.2 Kết định danh kỹ thuật RFLP 75 4.3.3 Kết định danh phân tích đồng trình tự nucleotide 84 4.3.4 Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trình tự nucleotide .86 4.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 94 4.4.1 Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 94 4.4.2 Đánh giá khả phát phytoplasma mồi LAMP 99 4.5 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 102 4.5.1 Ảnh hưởng đất hom giống đến khả lan truyền bệnh .102 4.5.2 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép 106 4.5.3 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 107 4.5.4 Khả lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn qua số lồi trùng .110 Phần Kết luận kiến nghị 118 5.1 Kết luận 118 5.2 Kiến nghị 119 Danh mục cơng trình cơng bố 120 Tài liệu tham khảo 121 Phụ lục 138 v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh CT Cơng thức µl Microliter A laidlawii Acholeplasma laidlawii BIP Backward internal primer (Mồi ngược dòng bên trong) BLAST Basic local alignment search tool (Cơng cụ tìm kiếm chuỗi tương đồng cục bộ) bp Base pair (Cặp bazơ) Ca Phytoplasma Candidatus Phytoplasma CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DNA Deoxy nucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtOH Ethanol FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp Lương thực Liên hiệp Quốc) FIP Forward internal primer (Mồi xi dịng bên trong) IRPCM International research project for comparative mycoplasmology (Dự án Nghiên cứu Quốc tế Mycoplasma) kb Kilo base LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR (Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt) M esculenta Manihot esculenta ml Mililiter nm Nanometer nts Nucleotides PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) vi RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid TAE Tris-acetate acid EDTA TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phương pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng) vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Phân loại phytoplasma dựa phân tích gen 16S RNA ribosome 2.2 Thành phần nhóm trùng Hemiptera môi giới truyền phytoplasma 17 2.3 Một số mồi PCR phát phytoplasma công bố 23 2.4 Danh sách nhóm phytoplasma hại sắn xác định dựa vào phân tích phân tử 32 3.1 Các cặp mồi sử dụng để phát phytoplasma sắn 42 4.1 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn điểm điều tra số tỉnh (năm 2011) 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 55 4.3 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm DAPI (năm 2014) 57 4.4 Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7R16F2n/R16R2 60 4.5 Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 63 4.6 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 66 4.7 Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 67 4.8 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 70 4.9 Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 71 4.10 Danh sách mẫu phytoplasma hại sắn đăng ký Ngân hàng Gen 74 4.11 Danh sách mẫu dùng phân tích RFLP mơ 77 4.12 Mức tương đồng di truyền dựa mơ hình cắt RFLP mơ vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 83 4.13 So sánh mức đồng trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 85 viii ... án: Nghiên cứu bệnh phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) số tỉnh Đông Nam Bộ Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 62 01 12 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên. .. học thực Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc; nghiên cứu chẩn đoán, phân loại phytoplasma hại sắn thực Viện Bảo vệ thực vật Trung tâm Nghiên cứu bệnh nhiệt đới Thời gian thực. .. bệnh Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn bệnh Việt Nam nên cần phải thực nghiên cứu bệnh, đặc biệt tỉnh trọng điểm có dịch Đông Nam Bộ 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán phân loại phytoplasma gây hại sắn