HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 62 62 01 12 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hà Viết Cường TS Trịnh Xuân Hoạt NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành i LỜI CẢM ƠN Luận án có sử dụng phần kết đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chổi rồng bệnh thán thư hại sắn” Bộ Nông nghiệp PTNT cấp kinh phí thực cho TS Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng luận án Để hoàn thành luận án này, cố gắng thân, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình quý thầy, quý cô người thân Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Hà Viết Cường TS Trịnh Xuân Hoạt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trình thực hoàn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp Tôi xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình cán Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc Tôi xin trân trọng cảm ơn nhà khoa học nhiệt tình trao đổi, góp ý cho vấn đề, giải pháp, trình thực đề tài hoàn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới cán kỹ thuật bà nông dân nhiều nơi tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực đề tài Bên cạnh đó, xin gửi lời tri ân tới tất người thân gia đình, người bên cạnh động viên, giúp đỡ trình học tập thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .2 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Cây sắn 2.1.1 Lược sử nguồn gốc phân loại sắn .5 2.1.2 Giá trị sử dụng giá trị dinh dưỡng 2.1.3 Tình hình sản xuất sắn giới 2.1.4 Tình hình sản xuất sắn Việt Nam 2.2 Phytoplasma hại thực vật .7 2.2.1 Lịch sử phát phytoplasma 2.2.2 Phân loại phytoplasma 2.2.3 Tầm quan trọng phytoplasma 12 2.2.4 Đặc điểm hình thái phytoplasma .13 2.2.5 Triệu chứng bệnh phytoplasma gây 14 2.2.6 Cơ chế gây bệnh phytoplasma 14 2.2.7 Sự đa dạng phytoplasma .15 2.2.8 Lan truyền phytoplasma 16 2.2.9 Phương pháp chẩn đoán phytoplasma .20 iii 2.2.10 Biện pháp phòng chống 26 2.3 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại sắn 27 2.4 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật Việt Nam 32 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 36 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 36 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 37 3.2 Nội dung nghiên cứu 37 3.2.1 Điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3.2.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 37 3.2.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3.2.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 38 3.2.5 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 38 3.3 Phương pháp nghiên cứu 39 3.3.1 Phương pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39 3.3.2 Phương pháp phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 40 3.3.3 Phương pháp định danh phân tử phân tích phả hệ 44 3.3.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 46 3.3.5 Phương pháp xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 47 3.4 Phương pháp tính xử lý số liệu 50 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 51 4.1 Mô tả triệu chứng điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 51 4.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh 51 4.1.2 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 54 4.2.1 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 54 iv 4.2.2 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm mô 57 4.2.3 Phát phytoplasma hại sắn kỹ thuật PCR 59 4.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4.3.1 Kết định danh giải trình tự sản phẩm PCR 65 4.3.2 Kết định danh kỹ thuật RFLP 75 4.3.3 Kết định danh phân tích đồng trình tự nucleotide 84 4.3.4 Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trình tự nucleotide .86 4.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 94 4.4.1 Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 94 4.4.2 Đánh giá khả phát phytoplasma mồi LAMP 99 4.5 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 102 4.5.1 Ảnh hưởng đất hom giống đến khả lan truyền bệnh .102 4.5.2 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép 106 4.5.3 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 107 4.5.4 Khả lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn qua số loài côn trùng .110 Phần Kết luận kiến nghị 118 5.1 Kết luận 118 5.2 Kiến nghị 119 Danh mục công trình công bố 120 Tài liệu tham khảo 121 Phụ lục 138 v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh CT Công thức µl Microliter A laidlawii Acholeplasma laidlawii BIP Backward internal primer (Mồi ngược dòng bên trong) BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm chuỗi tương đồng cục bộ) bp Base pair (Cặp bazơ) Ca Phytoplasma Candidatus Phytoplasma CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DNA Deoxy nucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtOH Ethanol FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp Lương thực Liên hiệp Quốc) FIP Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong) IRPCM International research project for comparative mycoplasmology (Dự án Nghiên cứu Quốc tế Mycoplasma) kb Kilo base LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR (Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt) M esculenta Manihot esculenta ml Mililiter nm Nanometer nts Nucleotides PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) vi RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid TAE Tris-acetate acid EDTA TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phương pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng) vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Phân loại phytoplasma dựa phân tích gen 16S RNA ribosome 2.2 Thành phần nhóm côn trùng Hemiptera môi giới truyền phytoplasma 17 2.3 Một số mồi PCR phát phytoplasma công bố 23 2.4 Danh sách nhóm phytoplasma hại sắn xác định dựa vào phân tích phân tử 32 3.1 Các cặp mồi sử dụng để phát phytoplasma sắn 42 4.1 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn điểm điều tra số tỉnh (năm 2011) 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 55 4.3 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm DAPI (năm 2014) 57 4.4 Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7R16F2n/R16R2 60 4.5 Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 63 4.6 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 66 4.7 Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 67 4.8 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 70 4.9 Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 71 4.10 Danh sách mẫu phytoplasma hại sắn đăng ký Ngân hàng Gen 74 4.11 Danh sách mẫu dùng phân tích RFLP mô 77 4.12 Mức tương đồng di truyền dựa mô hình cắt RFLP mô vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 83 4.13 So sánh mức đồng trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 85 viii Bảng Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng phân tích phả hệ Nhóm 16S Bệnh liên quan rRNA Chổi phù thuỷ hại sắn I I I II II II II III III IV IV V V VI VI VII VII VIII IX IX X X XI XI XII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XXI XXII XXII XXIII XXIV XXV XXVI XXVII 148 Chổi phù thuỷ cúc tây Biến vàng cúc tây Chổi phù thuỷ hại sắn Chổi phù thuỷ lạc Chổi phù thuỷ chanh Chổi phù thuỷ đậu Hà Lan Chổi phù thuỷ hại sắn Da cóc hại sắn Vàng gân dừa Vàng dừa Yucatan Biến vàng đu Chổi phù thuỷ táo ta Phát búi tam giác mạch Bệnh hại dâu tây Chổi phù thuỷ đinh hương Chổi phù thuỷ ngải dại Chổi phù thuỷ mướp Chổi phù thuỷ đậu triều Chổi phù thuỷ hạnh nhân Phát búi táo tây Hóa đá táo tây Vàng lụi lúa Trắng mía Biến vàng nho Trắng cỏ Chổi phù thuỷ thục địa Biến vàng động mía Chùn đu đủ Đốm héo khoai tây Chổi phù thuỷ dẻ Biến vàng thông Héo vàng dừa Héo vàng dừa Biến vàng nho Chùn lúa miến Chổi phù thuỷ liễu nhỏ Vàng mía Vàng mía Tên viết tắt CWB-WF AYWB MAY CWB-TQ PnWB WBDL FBP CWB-Br02 CFSD LYJ-C8 LDY EY JWB-G1 CP MC AshY ErWB LufWB PPWB AlWB AP ESFY RYD SCWL AUSGY BGWL GWB SYLS PBT PPPT CheWB PinP LYDM CSPW BVGY SBS WTWB D3T1 D3T2 Mã truy cập Nguồn gốc * Ngân hàng Gen AY787139 Wallis – Futuna NC_007716 Hoa Kỳ M30790 Hoa Kỳ JQ957931 Trung Quốc L33765 Đài Loan U15442 Ô-man X83432 Không rõ GU193977 Bra-xin EU346761 Bra-xin AF498307 Ja-mai-ca U18753 Mê-hi-cô AY197655 Hoa Kỳ AB052876 Nhật Bản AY390261 Ca-na-da AF190224 Ca-na-da AF092209 Hoa Kỳ AY034608 Bra-xin AF086621 Đài Loan AF248957 Hoa Kỳ AF515636 Li-băng AJ542541 Đức AJ542544 Đức AB052873 Thái Lan X76432 Không rõ L76865 Ốt-xtrây-li-a AJ550984 I-ta-li-a HQ258882 Costa Rica AY725228 Cu-ba AY725234 Cu-ba DQ174122 Hoa Kỳ AB054986 Hàn Quốc AJ310849 Đức KF751387 Mô-zăm-bíc JQ868442 Gha-na AY083605 Ốt-xtrây-li-a AF509322 Ốt-xtrây-li-a AF521672 Ốt-xtrây-li-a AJ539179 Mauritius AJ539180 Mauritius XXIX XXX XXXI XXXII XXXIII A laidlawii Chổi phù thuỷ cốt khí Chổi phù thuỷ liễu bách Lùn bụi đậu tương Lục hóa dừa cạn Biến vàng thông Đối chứng CaWB SCWB SoyST1c1 MaPV AlP - EF666051 FJ432664 HQ225630 EU371934 AY135523 M23932 Ô-man Trung Quốc Costa Rica Ma-lay-xi-a Ốt-xtrây-li-a - Ghi chú: * Tham khảo Ngân hàng Gen dựa theo tài liệu Bertaccini et al (2014) Bảng Đại diện nhóm phụ nhóm 16SrI dùng phân tích phả hệ Nhóm-nhóm phụ 16S rRNA Bệnh liên quan Tên viết tắt Mã truy cập Nguồn gốc Ngân hàng Gen* Chổi phù thuỷ hại sắn BRVT-01 JN381547 Bà Rịa-Vũng Tàu Chổi phù thuỷ hại sắn QNg-01 JN381548 Quảng Ngãi Chổi phù thuỷ hại sắn ĐN-01 JN381549 Đồng Nai Chổi phù thuỷ hại sắn KT-01 JN381550 Kon Tum Chổi phù thuỷ hại sắn KT-17 JQ973105 Kon Tum Nghiên cứu Chổi phù thuỷ hại sắn ĐN-34 JQ973106 Đồng Nai Chổi phù thuỷ hại sắn BP-01 KC295284 Bình Phước Chổi phù thuỷ hại sắn ĐN-02 KM360168 Đồng Nai Chổi phù thuỷ hại sắn YB-01 KM360166 Yên Bái Chổi phù thuỷ hại sắn YB-02 KM360167 Yên Bái I-A Chổi phù thuỷ cúc tây AYWB NC_007716 Hoa Kỳ I-A Biến vàng cúc tây NJAY HM590622 Hoa Kỳ I-A Lục hóa mã đề PVM AY265216 Đức I-A Biến vàng cà rốt CYP EU215424 Séc-bi-a I-A Chổi phù thuỷ sắn CWB-WF AY787139 Wallis - Futuna I-B Biến vàng cúc tây MAY M30790 Hoa Kỳ I-B Lục hóa dừa cạn NA HM590621 I-ta-li-a I-B Biến vàng gân báo xuân PrG HM590623 Anh I-B Lục hóa cải dầu RV HM590625 Pháp I-B Biến vàng cúc tây CY EU215426 Séc-bi-a I-B Lục hóa anh thảo PRIVC AY265210 Đức I-B Biến vàng cúc tây AY-J HM590616 Pháp I-C Biến vàng cà rốt CA HM448473 I-ta-li-a I-C Diệp hóa cỏ ba KVE AY265217 Pháp I-C Diệp hóa cỏ ba KVF HQ530150 Pháp I-C Thối khoai tây PPT HQ530151 Pháp I (chưa rõ) Biến vàng sắn CWB-Cuba EU328256 Cuba I-D Chổi phù thuỷ hông PaWB AY265206 Hoa Kỳ I-E Lùn bụi việt quất BBS3 AY265213 Hoa Kỳ I-F Biến vàng mơ ACLR-AY AY265211 Hoa Kỳ I-I Chổi phù thuỷ dâu tây STRAWB1 U96614 Hoa Kỳ 149 I-K I-N I-P I-R I-S I-U I-V I-Y III-B A laidlawii Chổi phù thuỷ dâu tây Biến vàng bìm mờ Biến vàng dương Diệp hóa dâu tây Đốm khoai tây Đốm khoai tây Đốm khoai tây Hóa gỗ cà chua Chổi phù thuỷ sắn Đối chứng STRAWB2 IOWB PopAY StrawbPhF COAH10 JAL6 SON18 BGT CWB-Br02 M23932 U96616 AY265205 AF503568 AY102275 FJ914654 FJ914650 FJ914642 EF199549 GU193977 - Hoa Kỳ Hoa Kỳ Croatia Hoa Kỳ Mê-hi-cô Mê-hi-cô Mê-hi-cô Bô-li-vi-a Bra-xin - Ghi chú: * Tham khảo Ngân hàng Gen dựa theo tài liệu Bertaccini et al (2014) 150 Bảng Đại diện nhóm phụ nhóm 16SrII dùng phân tích phả hệ Nhóm-nhóm phụ 16S rRNA Bệnh liên quan Tên viết tắt Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Nghiên cứu Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn II-A Chổi phù thuỷ sắn II-A Lục hóa màn II-A Chổi phù thuỷ lạc II-B Chổi phù thuỷ chanh II-C Chổi phù thuỷ đậu II-C Chổi phù thuỷ sắn II-E Diệp hóa hoa mơ II-F Diệp hóa III-B Chổi phù thuỷ sắn A laidlawii Đối chứng BRVT-02 QNg-19.2 BR-5 BR-7.2 BR-9.1 T7-ĐN T11-QNg T18-TN T19-BRVT CWB-TQ ClWB-Hnsy PnWB WBDL FBP CWB-Ug PEY CoP CWB-Br02 M23932 Mã truy cập Ngân hàng Gen* KC295285 KM360169 KM360170 KM360171 KM360172 KM280679 KM280680 KM280681 KM280682 JQ957931 EU513212 L33765 U15442 X83432 EU315317 Y16393 EF186827 GU193977 - Nguồn gốc Bà Rịa-Vũng Tàu Quảng Ngãi Bà Rịa-Vũng Tàu Bà Rịa-Vũng Tàu Bà Rịa-Vũng Tàu Đồng Nai Quảng Ngãi Tây Ninh Bà Rịa-Vũng Tàu Trung Quốc Trung Quốc Đài Loan Ô-man không rõ Uganda I-ta-li-a Burkina Faso Bra-xin - Ghi chú: * Tham khảo Ngân hàng Gen dựa theo tài liệu Bertaccini et al (2014) Bảng Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tiếp xúc học (Đồng Nai, 2013) STT Cây thí nghiệm Sắn KM94 Sắn KM937-26 Thầu dầu Dừa cạn Tỷ lệ phát bệnh (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 Thời kỳ tiềm dục 0 0 Kiểm tra PCR – – – – Ghi chú: N = 30 cây; (–) tức phản ứng PCR âm tính 151 PHỤ LỤC Danh sách mẫu phytoplasma dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII Bảng Danh sách 92 mẫu trình tự 16S RNA ribosome dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII STT Nhóm Mẫu* Số mẫu 16SrI I-Y-EF199549; I-D-AY265206-PaWB; I-B-M3079013 MAY; I-N-AY265205-IoWB; I-B-NC005303-OY-M; IM-AY265209-AVUT; I-L-AY180957-AV2192; I-EAY265213-BBS3; I-A-NC007716-AYWB; I-FAY265211-A-AY; I-C-AF222065-CPh; I-A-L33760-BB; I-P-AF503568-PopAY 16SrII II-A-L33765-PnWB; II-KM280680-CWBT11.QNg; II16 KM280681-CWBT18.TN; II-C-X83432-FBP; II-BU15442-WBDL; II-D-Y10096-PpM; II-KM280682CWBT19.BRVT; II-KM280679-CWBT7.DN; IIKC295285-CWB.BR02; II-KM360172-CWB.BR9.1; IIKM360171-CWB.BR7.2; II-KM360170-CWB.BR5; IIKM360169-CWB.QNg19.2; II-JQ957931-Alp4; II-FEF186827-CoP; II-E-Y16393-PEY 16SrIII III-L-EU346761-CFSD; III-J-AF147706-ChWBIII; III-P9 AF370119-DanV; III-V-GU292082-PassWB-Br4; III-MFJ226074-PPT-MT117; III-F-AF510724-MW1; III-BAF173558-CYE; III-N-GU004365-PPT-AK6; III-AJQ044393-PX11Ct1 16SrIV IV-A-AF498307-LYJ-C8; IV-B-MOU18753-LDY; IV-C3 X80117-LDT 16SrV V-C-X76560-FDC; V-D-AJ548787-FD1487; V-F6 AB689678-BltWB; V-B-AB052876-JWBG1; V-AAY197655-EY; V-E-AY197648-RusS 16SrVI VI-D-AF228053-PLLBd; VI-E-AY270156-CSVI; VI-A7 AY390261-CP; VI-B-AF190224-MC; VI-C-AF409069EY-Il1; VI-F-EF186819-CPS; VI-I-GU292081-PassWB 16SrVII VII-B-AY034608-ErWB; VII-A-AF092209-AshY; VII-C3 AY147038-ArAWB 16SrVIII VIII-A-AF086621-LufWB; VIII-A-AF086621-LufWB 16SrIX IX-C-HQ589191-NAXOS: IX-A-AF248957-PPWB; IX4 B-AF515636-CPPA4; IX-D-AF515637-AlWB 16SrX X-D-X92869-SpaWB; X-E-X76431-BAWB; X-A3 AJ542541-AP15 10 16SrXI XI-B-X76432-SCWL; XI-A-AB052873-RYD; XI-C3 X76429-BVK 11 16SrXII XII-A-AF248959-STOL11; XII-C-AJ243045-StrawLY; XII-H-JN833705-BYS57; XII-D-AB010425-JHP 12 16SrXIII XIII-A-AF248960-MPV 13 16SrXIV XIV-A-AJ550984-BGWL-C1; XIV-B-EF4444852 F.BGWL 152 STT 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Nhóm Mẫu* 16SrXV 16SrXVI 16SrXVII 16SrXVIII 16SrXIX 16SrXX 16SrXXI 16SrXXII 16SrXXIII 16SrXXV 16SrXXVIII 16SrXXX 16SrXXXI 16SrXXXII Tổng XV-A-AF147708-HibWB; XV-B-HQ258882-GWB XVI-A-AY725228-SYLS XVII-A-AY725234-PBT XVIII-A-DQ174122-APPTW XIX-A-AB054986-CPC XX-JQ868449-RhCa XXI-A-AJ310849-PinP; XXI-A-AJ310849-PinP XXII-A-KF751387-LYDM178; XXII-B-JQ868442-CLYP XXIII-A-AY083605-BVGY XXV-A-AF521672-WTTW XXVIII-A-AY744945-DP XXX-A-FJ432664-SaCW XXXI-A-HQ225630SST1 XXXII-A-EU371934-MaPV Số mẫu 1 1 2 1 1 1 92 Các mẫu trình bày theo thứ tự Nhóm - Nhóm phụ - Mã truy cập Ngân hàng Gen - Mẫu 153 PHỤ LỤC Đề xuất quy trình chẩn đoán, giám định phytoplasma hại sắn Thu thập bảo quản mẫu bệnh a Thu thập mẫu bệnh Thu thập, chụp ảnh, mô tả triệu chứng sắn nghi ngờ nhiễm bệnh có biểu triệu chứng đặc trưng mọc nhiều chồi chồi thân phần thân chính; nhỏ lại, biến màu vàng nhạt, tím nhạt thô cứng, đốt thân ngắn lại, thân sắn ngả mầu thâm đen, phần lõi có màu nâu nhạt, chồi bị chết khô, nhiều bị thấp lùn lại b Xử lý bảo quản mẫu Đối với cách bảo quản tươi: chọn phận (lá, thân cành) có biểu triệu chứng điển hình bệnh chổi phù thuỷ giữ ẩm giấy thấm ướt bọc giấy báo, bọc vải ẩm đựng vào thùng xốp Đối với cách bảo quản khô: chọn phận (lá, gân lá, thân cành) cho vào túi nilon có chứa hạt silicagel tự thị Thay hạt silicagel tự thị mẫu bảo quản khô, giòn Cất giữ bảo quản mẫu nhiệt độ phòng tủ lạnh sâu –20oC Chẩn đoán, giám định bệnh a Chẩn đoán Chẩn đoán bệnh kỹ thuật nhuộm mô với DAPI (4’,6-diamidino-2phenylindole dihydrochloride) phương pháp kính hiển vi điện tử Chẩn đoán bệnh kỹ thuật LAMP-PCR b Giám định bệnh Áp dụng kỹ thuật PCR lồng cặp mồi P1/P7, R16mF2/R16mR1 R16F2n/R16R2 Phân tích kỹ thuật phân tích đa hình thông thường (RFLP) sản phẩm PCR, phân tích đa hình RFLP thực mô trình tự nucleotide chương trình pDRAW32 c Giải trình tự phân tích phả hệ Tinh sản phẩm PCR kit theo hướng dẫn nhà sản xuất Gửi đọc trình tự mẫu phân tích sở nước nước Trình tự nucleotide so sánh mức độ tương đồng với chương trình tin sinh học ClustalW2, BioEdit 7.0.0, dùng chương trình trực tuyến BLAST để tìm kiếm chuỗi nucleotide tương đồng có sẵn Ngân hàng Gen NCBI địa https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining (N-J) với khoảng cách di truyền chuỗi xác định dựa mô hình thay Kimura tham số, giá trị thống kê kỹ thuật bootstrap (%) với 1.000 lần lặp lại MEGA 5.0 Sau đó, xác định danh tính loài phytolasma gây hại sắn bị bệnh 154 PHỤ LỤC Kết xử lý thống kê 1) Tỷ lệ bệnh sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (%) - thí nghiệm xác định khả lan truyền qua hom chậu vại, Hưng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, năm 2012 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) VARIATE V003 TLB LN aye Cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 7769.34 2589.78 181.23 0.000 * RESIDUAL 114.320 14.2900 * TOTAL (CORRECTED) 11 7883.66 716.696 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ CT1 CT2 CT3 CT4 NOS 3 3 TLB 43.3000 0.000000 56.7000 0.000000 SE(N= 3) 2.18251 5%LSD 8DF 7.11693 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 25.000 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 26.771 3.7802 15.1 0.0000 | | | | 155 2) Thí nghiệm xác định khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) VARIATE V003 TLB LN ndthanhf SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1077.74 538.870 273.54 0.000 * RESIDUAL 11.8201 1.97001 * TOTAL (CORRECTED) 1089.56 136.195 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ CT1 CT2 CT3 NOS 3 TLB 11.3000 26.7000 0.000000 SE(N= 3) 0.810352 5%LSD 6DF 2.80314 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLB 156 GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 12.667 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 11.670 1.4036 11.1 0.0000 | | | | 3) Tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ sắn (%) thời điểm thu hoạch, Hưng Thịnh - Trảng Bom Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 VARIATE V003 TLB LN aye, Cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= GIONG$ 580.301 193.434 78.71 0.000 * RESIDUAL 19.6608 2.45760 * TOTAL (CORRECTED) 11 599.962 54.5420 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 MEANS FOR EFFECT GIONG$ GIONG$ KM94 KM419 SM937-26 NOS 3 TLB 7.36000 19.2000 6.08000 SE(N= 3) 0.905097 5%LSD 8DF 2.95143 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 8.1600 STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 7.3853 1.5677 19.2 0.0000 | | | | 157 4) Ảnh hưởng bệnh chổi phù thuỷ sắn đến chiều cao thời điểm thu hoạch, Hưng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCC FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 VARIATE V003 CCC LN aye, cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= GIONG$ 37.7048 12.5683 124.12 0.000 * RESIDUAL 116 11.7464 101262 * TOTAL (CORRECTED) 119 49.4513 415557 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 MEANS FOR EFFECT GIONG$ GIONG$ KM94 KM419 SM937-26 HL-S11 NOS 30 30 30 30 CCC 3.33067 1.78567 2.75933 2.84533 SE(N= 30) 0.580983E-01 5%LSD 116DF 0.162717 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE CCC 158 GRAND MEAN (N= 120) NO OBS 120 2.6802 STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.64464 0.31822 11.9 0.0000 | | | | 5) Năng suất, số thu hoạch hàm lượng tinh bột giống sắn thời điểm thu hoạch (Hưng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013) BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTL FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V003 NSTL anh nho em nhieu TfK LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 2.16365 1.08182 0.25 0.786 CT$ 805.085 268.362 62.58 0.000 * RESIDUAL 25.7294 4.28823 * TOTAL (CORRECTED) 11 832.978 75.7253 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSCT FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V004 NSCT cu chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 127.042 63.5212 4.12 0.075 CT$ 845.280 281.760 18.28 0.003 * RESIDUAL 92.4868 15.4145 * TOTAL (CORRECTED) 11 1064.81 96.8009 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTB FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V005 NSTB ndt LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 8.23852 4.11926 3.84 0.084 CT$ 90.7119 30.2373 28.17 0.001 * RESIDUAL 6.44142 1.07357 * TOTAL (CORRECTED) 11 105.392 9.58108 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HLTB FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V006 HLTB aye, Cu Chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 1.82000 910000 0.46 0.656 CT$ 32.9767 10.9922 5.53 0.037 * RESIDUAL 11.9333 1.98889 - 159 * TOTAL (CORRECTED) 11 46.7300 4.24818 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CSTH FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V007 CSTH LN aye, Cu Chuoi SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 65.0964 32.5482 8.38 0.019 CT$ 135.067 45.0222 11.59 0.007 * RESIDUAL 23.3076 3.88461 * TOTAL (CORRECTED) 11 223.471 20.3155 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) MEANS FOR EFFECT NLAI NLAI NOS 4 SE(N= 5%LSD 4) 6DF NLAI NOS 4 NSTL 26.8125 26.1875 27.2200 NSCT 32.5650 28.5950 36.5650 NSTB 8.68750 7.40000 9.40250 HLTB 26.2000 25.8000 25.2500 1.03540 3.58162 1.96306 6.79055 0.518066 1.79207 0.705140 2.43919 CSTH 54.9700 52.1475 57.8525 SE(N= 4) 0.985470 5%LSD 6DF 3.40890 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS NSTL NSCT NSTB HLTB KM94 24.8333 34.9633 8.83000 25.2667 KM419 18.2100 25.3333 6.42333 25.5000 SM937-26 23.6667 24.7100 5.88000 23.8333 HL-S11 40.2500 45.2933 12.8533 28.4000 SE(N= 5%LSD 3) 6DF CT$ KM94 KM419 SM937-26 HL-S11 1.19558 4.13570 NOS 3 3 2.26675 7.84105 0.598211 2.06931 0.814225 2.81654 CSTH 58.4867 58.0533 50.7367 52.6833 SE(N= 3) 1.13792 5%LSD 6DF 3.93626 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE 160 Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE NSTL NSCT NSTB HLTB CSTH GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 26.740 12 32.575 12 8.4967 12 25.750 12 54.990 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.7020 2.0708 7.7 0.7862 9.8387 3.9261 12.1 0.0747 3.0953 1.0361 12.2 0.0843 2.0611 1.4103 5.5 0.6564 4.5073 1.9709 3.6 0.0189 |CT$ | | | 0.0002 0.0026 0.0010 0.0373 0.0073 | | | | 161 PHỤ LỤC Một số hình ảnh thí nghiệm 162 Điều tra, thu thập mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đồng Theo dõi, thu thập rầy ruộng trồng sắn bẫy ánh sáng Cây sắn bệnh mọc từ hạt Cây dừa cạn bệnh mọc từ hạt Máy điện di gel agarose Nồi hấp khử trùng đất thí nghiệm ... chống 26 2.3 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại sắn 27 2.4 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật Việt Nam 32 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 36 3.1 Vật... bệnh Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn bệnh Việt Nam nên cần phải thực nghiên cứu bệnh, đặc biệt tỉnh trọng điểm có dịch Đông Nam Bộ 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Chẩn đoán phân loại phytoplasma gây hại sắn. .. phát phytoplasma hại sắn Việt Nam Thiết kế thành công mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn Đông Nam Bộ Đề xuất quy trình chẩn đoán phytoplasma hại sắn cho số tỉnh Đông