HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THANH HOA PHÂN LẬP, PHÁT HIỆN VI KHUẨN Bacillus cereus SINH ĐỘC TỐ GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Hoa i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Bộ môn Thương phẩm, Khoa Quân nhu – Học viện Hậu cần giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Hoa ii MỤC LỤC Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Danh mục từ viết tắt VI Danh mục bảng VII Danh mục hình VIII Trích yếu luận văn IX Thesis abstract X Phần Mở đầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 2.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm 2.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 2.2 Đặc điểm chung Bacillus cereus 2.2.1 Vị trí phân loại nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus 2.2.2 Đặc điểm hình thái Bacillus cereus 2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 2.2.5 Đặc điểm huyết học 2.3 Đặc điểm gen Bacillus cereus 2.3.1 Hệ gen Bacillus cereus 2.3.2 Sự phân bố gen mã hoá độc tố vi khuẩn B cereus 2.4 Ngộ độc thực phẩm Bacillus cereus 2.4.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Bacillus cereus 2.4.2 Nguồn gốc lây nhiễm 11 2.4.3 Triệu chứng lâm sàng 11 2.4.4 Các yếu tố gây độc Bacilus cereus 12 2.4.5 Cơ chế gây ngộ độc liều lượng 14 2.5 Phương pháp phát Bacillus cereus 16 2.5.1 Phương pháp dựa đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa 16 iii 2.5.2 Phương pháp miễn dịch 17 2.5.3 Phương pháp dựa đặc điểm gen 18 2.6 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu Bacillus cereus 19 2.6.1 Kỹ thuật PCR 19 2.6.2 Giải mã trình tự gen (Sequencing) 21 2.6.3 Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên đoạn DNA đa hình (RAPD) 21 2.6.4 Kỹ thuật RFLP (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) 21 Phần Vật liệu phương pháp 22 3.1 Vật liệu 22 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22 3.1.2 Hóa chất mơi trường 23 3.2 Phương pháp nghiên cứu 26 3.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus cereus 26 3.2.2 Phương pháp kiểm tra chủng phân lập đặc điểm hình thái số phản ứng sinh hóa 26 3.2.3 Định danh chủng vi khuẩn 27 3.2.4 Xác định số gen mã hóa độc tố chủng vi khuẩn phương pháp PCR 29 3.2.5 Xác định độ nhạy phát gen mã hóa độc tố chủng vi khuẩn phương pháp PCR 29 3.2.6 Phát B cereus chứa gen mã hóa độc tố thực phẩm giả định 31 Phần Kết thảo luận 32 4.1 PHÂN LẬP Bacillus cereus 32 4.2 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn chọn lọc 34 4.2.1 Khả sinh Catalase 34 4.2.2 Khả sinh axetoin (Phản ứng V-P) 35 4.2.3 Khả sinh gelatinase 35 4.2.4 Khả phân giải thạch huyết 36 4.3 Định danh chủng D1.7 phân tích trình tự 16S rDNA 37 4.4 Phát gen mã hóa độc tố chủng B cereus D1.7 39 4.5 Xác định độ nhạy phản ứng PCR 43 iv 4.6 Phát Bacillus cereus chứa gen mã hóa độc tố thực phẩm giả định 45 Phần Kết luận đề nghị 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 Tài liệu tham khảo 48 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt bp : base pair CTAB : Cethyltrim ethylammonium bromide DNA : Deoxyribonucleotide acid dNTP : Deoxynucleotide triphosphate ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay EtBr : Ethidium bromide LB : Luria – Bertani MPA : Meat – Pepton – Agar MPB : Meat – Peptone – Broth MYP : Manitol – Yolk – Polimyxin PCR : Polymerase chain reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rDNA : ribosome deoxyribonuclease RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse : Ribonuclease rRNA : ribosome ribonuclease SDS : Sodium dodecyl sulfate TAE : Tris Acetate Ethylendiamin Tetraacetic Acid TE : Tris Ethylendiamin Tetraacetic Acid UV : Ultra violet VP : Voges – Prokauer VSATTP : Vệ sinh an toàn thực phẩm vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa lồi nhóm Bacillus cereus [27] Bảng 2.2 Các loại độc tố B cereus [21] 14 Bảng 2.3 Đặc trưng hai loại bệnh vi khuẩn B cereus gây 15 Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen 16S rDNA 28 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 29 Bảng 4.1 Kết kiểm tra số đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng phân lập 37 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus kính hiển vi Hình 2.2 Khuẩn lạc vi khuẩn B cereus môi trường MYP, môi trường thạch máu Hình 2.3 Cấu trúc hố học độc tố gây nôn 13 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc chủng D1.7 phân lập môi trường MYP môi trường MPA sau 24h nuôi cấy 37oC 32 Hình 4.2 Hình thái tế bào chủng D1.7 sau 24h nuôi cấy 37oC quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 13000 lần 33 Hình 4.3 Hình thái bào tử chủng phân lập C1.1 sau ngày nuôi cấy 37 oC kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần 34 Hình 4.4 Khả sinh Catalase 11 chủng phân lập Lần lượt từ đến C1.1, B1.5, D1.7, C1.3 CV1.6 34 Hình 4.5 Khả sinh axetoin 11 chủng nghiên cứu Lần lượt từ đến CV1.6, D1.7, C1.3, C1.1 B1.5 35 Hình 4.6 Khả sinh gelatinase 11 chủng phân lập 36 Hình 4.7 Khả phân giải thạch huyết chủng phân lập 36 Hình 4.8 Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gel agarose 1,2% 38 Hình 4.9 Cây phân loại dựa trình tự 16S rDNA chủng vi khuẩn D1.7 39 Hình 4.10 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi NheA, HblA, HblD, Bcet, CytK, EntFM gel agarose 1,5% 40 Hình 4.11 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblA, HblD, BceT, CytK, EntFM gel agarose 1,5% 44 Hình 4.12 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblD gel agarose 1,5% 45 viii Như vậy, 11 chủng B cereus phân lập tuyển chọn môi trường chọn lọc dựa hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử thu nhận tiến hành nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy, phản ứng sinh lý sinh hố để so sánh chúng với lồi cịn lại nhóm chi Bacillus Kết tổng hợp bảng 4.1: Bảng 4.1 Kết kiểm tra số đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng phân lập Đặc tính Các chủng phân lập C1.3 C1.1 CV1.6 B1.5 D1.7 C B1 B2 B3 B4 Đ Gram + + + + + + + + + + + Catalase + +/- + + + + + + + + + Sinh Gelatin +/- + + + + + + + + + + Phản ứng VP + + + + + + + + + + + Tan máu (cừu) - - - - + - + - - + + Chú thích: + : dương tính ; - : âm tính; +/-: dương tính, yếu; Căn vào kết bảng 4.1, số 11 chủng phân lập tuyển chọn chủng D1.7, B1, B4, Đ có đặc tính giống với chủng B cereus Do tơi chọn số chủng (chủng D1.7) cho nghiên cứu 4.3 ĐỊNH DANH CHỦNG D1.7 BẰNG PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ 16S rDNA Để định danh chủng D1.7 trước hết tiến hành tách chiết ADN tổng số để làm khuôn DNA tổng số từ chủng D1.7 tách chiết theo mô tả nội dung phương pháp Sử dụng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen vùng 16S rDNA, nhân đoạn gen có kích thước khoảng 1,5kb tương ứng (hình 4.8) 37 M ~1500 bp Hình 4.8 Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gel agarose 1,2% Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder; giếng 1: Chủng D1.7 Sản phẩm PCR tinh giải trình tự Tiến hành so sánh với trình tự 16S khác GenBank nhờ cơng cụ blast, xây dựng phân loại cho chủng D1.7 (hình 4.9) Dựa vào phân loại thấy chủng D1.7 nằm nhánh với B cereus HN001, B thuringinensis KNU07, B thuringinensis serovar coreanensis ST7 với giá trị bootstrap 100 Bên cạnh đó, kết trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng 16S rDNA chủng D1.7 chủng 99% Xét mặt giá trị tin cậy mức độ tương đồng cho thấy D1.7 nằm nhóm với chủng Kết hợp đặc điểm hình thái, sinh hóa phương pháp sinh học phân tử, khẳng định D1.7 thuộc chủng B cereus đặt tên cho chủng B cereus D1.7 38 Hình 4.9 Cây phân loại dựa trình tự 16S rDNA chủng vi khuẩn D1.7 4.4 PHÁT HIỆN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ CỦA CHỦNG B cereus D1.7 ADN tổng số tách chiết sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại gen mã hóa độc tố B cereus D1.7 Phát gen nheA (hình 4.10A) 39 M 500bp 400bp 300bp 600bp 500bp 400bp 300bp 500bp B M M 1000bp 500bp 500bp 250bp 600bp 500bp 400bp 400bp D C M M 1500bp 1200bp 1000bp 750bp 500bp 1300bp 600bp 250bp F E Hình 4.10 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi NheA (A), HblA (B), HblD (C), Bcet (D), CytK (E), EntFM (F) gel agarose 1,5% Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 1kb DNA ladder (C, E), Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder (A, B, D, F); Giếng 1: B cereus D1.7; giếng 2: Đối chứng âm: B subtilis 40 B cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy chúng có khả sinh độc tố ruột chế gây bệnh Trong loại độc tố có liên quan tới vụ ngộ độc gây tiêu chảy HBL, NHE loại độc tố phổ biến NHE có chất protein thành phần, gồm chuỗi A, B C Hoạt động NHE mạnh có đầy đủ protein Các gen nheA, nheB, nheC mã hoá cho protein NHEA, NHEB, NHEC gen nằm operon Trong giới hạn đề tài, tơi tiến hành phát có mặt gen nheA chủng B cereus D1.7 phân lập Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen nheA có kích thước dự kiến 480bp Kết điện di hình 4.10A có xuất sản phẩm gen có kích thước khoảng 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi NheA mà sử dụng vi khuẩn đối chứng B subtilis có phản ứng âm tính Như khẳng định chủng B cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố NHEA Phát gen hblA hblD (hình 4.10B 4.10C) B cereus gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy chúng có khả sinh độc tố ruột chế gây bệnh Trong loại độc tố có liên quan tới vụ ngộ độc gây tiêu chảy HBL loại độc tố phổ biến, HBL hoạt động mạnh có thành phần protein L2, L1, B Các tiểu phần B, L1, L2 mã hóa ba gen hblD, hblC, hblA Cặp mồi HblA khuếch đại vạch băng có kích thước 319bp Hansen Hendriksen (2000) sử dụng thành công việc phát độc tố chủng B cereus F837/76 Jackson et al., 2008 sử dụng cặp mồi HblD khuếch đại vạch băng 429bp Trong đề tài này, tiến hành phát có mặt gen hblA, hblD chủng B cereus D1.7 Phản ứng PCR tiến hành với cặp mồi HblA, HblD với kích thước sản phẩm dự kiến 319bp 429bp Kết điện di hình 4.10B 4.10C có xuất sản phẩm gen với kích thước khoảng 300bp 500bp, cho thấy chủng D1.7 có phản ứng đặc hiệu với mồi HblA, HblD mà sử dụng vi khuẩn đối chứng B subtilis có phản ứng âm tính Như khẳng định chủng B cereus D1.7 có mang gen mã hóa thành phần B, L2 độc tố HBL Phát gen bceT (hình 4.10D) Độc tố bc-D-ENT nhân tố có liên quan đến ngộ độc gây 41 tiêu chảy Là độc tố có hoạt động sinh học tương tự Nhe có chất protein thành phần Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để phát độc tố T chủng B cereus D1.7 với cặp mồi BceT có kích thước sản phẩm dự kiến 428bp Mồi BceT khuếch đại vạch băng có kích thước 428bp mẫu có gen (Agata et al., 1995) Mồi Graham Burgess Paul Horwood sử dụng để phát gen mã hóa hóa độc tố bc-D-ENT chủng B cereus có khả gây ngộ độc thực phẩm Dựa theo cơng trình nghiên cứu kết điện di hình 4.10D, có xuất vạch băng có kích thước khoảng 400bp với chủng B cereus D1.7 có phản ứng âm tính với đối chứng âm B subtilis Vì khẳng định chủng B cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố bc-D-ENT Phát gen cytK (hình 4.10E) CytK loại độc tố có khả gây tử vong cao loại độc tố khác B cereus Theo Ngamwongsatit el al (2008), gần 90% chủng B cereus mang gen Trong đề tài tơi tiến hành PCR với cặp mồi CytK với kích thước sản phẩm dự kiến 605bp Cặp Mồi CytK khuếch đại vạch băng có kích thước 605bp (Lund Cs 2000) Graham Burgess Paul Horwood sử dụng cơng trình nghiên cứu phát gen mã hóa độc tố vi khuẩn B cereus gây ngộ độc thực phẩm Qua kết điện di hình 4.10E dựa vào cơng trình nghiên cứu thấy có xuất vạch băng có kích thước khoảng 600bp với chủng B cereus D1.7 có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ chủng B cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố CytK gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy Phát gen mã hóa độc tố entFM (hình 4.10F) Độc tố FM (entFM) độc tố có chất protein với vai trị đặc tính chưa biết đến Bằng chứng cho tồn enterotoxin B cereus lần phát Granum et al (1996) Các nghiên cứu tỷ lệ cho thấy entFM phát hầu hết chủng liên quan đến bùng phát dịch bệnh Graham Burgess Paul Horwood sử dụng cặp mồi entFM khuếch đại đoạn gen mã hóa độc tố entFM có kích thước 1269bp [12] Trong đề tài tiến hành thực phản ứng PCR với cặp mồi entFM với kích thước sản phẩm dự kiến 1269bp Qua hình ảnh điện di 4.10F thấy có xuất vạch băng có kích thước khoảng 1300bp với chủng B cereus D1.7 có phản ứng âm tính với chủng vi khuẩn đối chứng, chứng tỏ 42 chủng B cereus D1.7 có mang gen mã hóa độc tố EntFM gây ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy Ngộ độc thực phẩm B cereus mối quan tâm lớn tồn giới [35] Do đó, phương pháp đơn giản, nhanh chóng để phát tế bào thuộc chủng B cereus mẫu thực phẩm quan trọng Vì vậy, tơi muốn xây dựng phương pháp đáng tin cậy cho việc xác định nhanh có mặt B cereus có khả gây ngộ độc thực phẩm Việt Nam Kỹ thuật PCR cho nhanh đơn giản để nhận biết thực phẩm có khả gây ngộ độc thực phẩm độc tố từ B cereus [35] Hansen et al (2001) sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát trình tự 16S rDNA đặc trưng cho nhóm B cereus Nooratiny, I and Sahilah, A M (2013) sử dụng kỹ thuật để phát gen entFM hblA mã hóa độc tố B cereus BC1 Monika Ehling – Schulz et al (2006) sử dụng kỹ thuật để phát gen mã hóa độc tố HBL, NHE, cytK Trong nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR để phát thành công gen hblA, hblD, nheA, cytK, entFM mã hóa độc tố thành phần độc tố gây ngộ độc thực phẩm B cereus thời gian (4-5 giờ) ngắn so với phương pháp truyền thống (ít ngày) Đây chứng cho thấy kỹ thuật nhanh chóng đơn giản để nhận biết thực phẩm có khả gây ngộ độc B cereus Việt Nam 4.5 XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY CỦA PHẢN ỨNG PCR Độ nhạy phản ứng giới hạn phát phản ứng Đó nồng độ vi khuẩn (hoặc nồng độ DNA) tối thiểu mà phương pháp phát Nooratiny, I and Sahilah, A M (2013) sử dụng kỹ thuật PCR để phát gen entFM hblA mã hóa độc tố B cereus BC1 Giới hạn phát gen 0.1 ng DNA [35] Để xác định độ nhạy phản ứng, tiến hành định lượng vi khuẩn/ml ban đầu 3,5x108 vi khuẩn/ml Lượng vi khuẩn pha loãng bậc 10 tới nồng độ pha loãng 10-6 sử dụng để thực phản ứng PCR với cặp mồi chạy điện di gel agarose 1,5% Kết điện di cặp mồi (hình 4.11) cho thấy nồng độ pha loãng vi khuẩn từ 10 -1 đến 10-5, xuất vạch gọn, bờ đều, phân tách rõ ràng Điều chứng tỏ sử dụng phương pháp PCR để phát gen độc tố B cereus lượng vi khuẩn B cereus D1.7 tối thiểu để phát 43 gen độc tố B cereus phương pháp PCR 3,5x103 vi khuẩn/ml M 500bp 300bp A M M 500bp 500bp 400bp 500bp M C B M 500bp 1300bp 500bp 600bp D E Hình 4.11 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblA (A), HblD (B), BceT (C), CytK (D), EntFM (E) gel agarose 1,5% Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 1kb DNA ladder (B, D); Marker O GeneRuler' TM 100bp DNA ladder (A, C, E); Giếng 1, 2, 3, 4, 5, tương ứng nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 B cereus D1.7 44 4.6 PHÁT HIỆN Bacillus cereus CHỨA GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TRÊN THỰC PHẨM GIẢ ĐỊNH Nooratiny, I and Sahilah, A M (2013) sử dụng kỹ thuật PCR để phát gen entFM hblA mã hóa độc tố B cereus BC1 số thực phẩm giả định nồng độ DNA thấp 0.1 ng/µl Yang et al (2005), Omboi et al (2008) phát trực tiếp số gen mã hóa độc tố B cereus thực phẩm giả định cách sử dụng multiplex PCR [35] Trong nghiên cứu này, tiến hành gây nhiễm thực nghiệm cách trộn huyền phù vi khuẩn B cereus loại vi khuẩn khác B subtilis biết trước nồng độ với thực phẩm sau tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi HblD Kết điện di hình 4.12 cho thấy nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 104 , 10-5 vi khuẩn B cereus xuất vạch gọn, bờ đều, phân tách rõ ràng Điều chứng tỏ sử dụng phương pháp PCR để phát gen mã hóa chuỗi L2 độc tố HBL B cereus trực tiếp từ thực phẩm giả định nồng độ vi khuẩn 3,5x103 vi khuẩn/ml M 500bp 500bp Hình 4.12 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblD gel agarose 1,5% Giếng M: Marker O GeneRuler' TM 100bp plus DNA ladder; Giếng 1, 2, 3, 4, tương ứng nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 B cereus D1.7 B subtilis; Giếng 6: B subtilis; Giếng 7: Nước 45 Để xác định diện B cereus nói chung B cereus D1.7 nguồn thực phẩm dựa phương pháp truyền thống gồm phân lập, kiểm tra đặc tính hóa sinh phải ngày Trong thử nghiệm phát B cereus D1.7 trực tiếp từ thực phẩm giả định dựa vào kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho thấy khả rút ngắn thời gian phát B cereus lên nhiều (3 giờ) khả áp dụng kỹ thuật phát B cereus gây ngộ độc thực phẩm từ nguồn thực phẩm Việt Nam Tuy nhiên cần phát thêm gen độc tố B cereus trực tiếp từ thực phẩm giả định thử nghiệm quy trình để phát gen mã hóa độc tố chúng số thực phẩm để đưa kết luận cuối 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đã xác định chủng vi khuẩn phân lập thuộc lồi B cereus dựa đặc điểm hình thái, sinh hóa phân tích trình tự 16S rDNA Đã phát gen mã hóa độc tố gây ngộ độc thực phẩm chủng B cereus D1.7 phân lập nhờ sử dụng kỹ thuật PCR Đã xác định độ nhạy phản ứng PCR phát gen mã hóa độc tố gây ngộ độc thực phẩm B cereus D1.7 3,5x103 vi khuẩn/ml Đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát gen hblD B cereus D1.7 trực tiếp từ thực phẩm giả định nồng độ 3,5x103 vi khuẩn/ml 5.2 ĐỀ NGHỊ Trên số kết phát gen độc tố của vi khuẩn B cereus, cần có nghiên cứu hồn thiện - Tiến hành phát gen mã hoá độc tố HBLD, HBLA, cytK, bc-D-ENT B cereus D1.7 thực phẩm giả định - Thử nghiệm quy trình để phát gen mã hóa độc tố B cereus số thực phẩm Việt Nam 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Mạnh Hà (2006) Thống kê ngộ độc thực phẩm Việt Nam Truy cập ngày 10/12/2016 http://trungtamnghiencuuthucpham.vn/thong-ke-ngo-doc-thuc-phamtai-viet-nam/ Duy Phan (2016) 15 loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp Truy cập ngày 10/12/2016 http://www.baomoi.com/15-loai-vi-khuan-gay-ngo-doc-thucpham-thuong-gap-nhat/c/20108041.epi Ngơ Đình Bính, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Thanh Hạnh (2005) Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Bacillus cereus phân lập Việt Nam Báo cáo khoa học Hội nghị Vệ sinh an toàn thực phẩm, tháng 11- 2005 Tr 120-125 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003) Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội Nguyễn Thúy Hương (2011) Phân tích vi sinh thực phẩm Nhà xuất đại học công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh Trần Đáng (2002) Công tác truyền thông đạo tuyến hoạt động bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà xuất Thanh Niên, Hà Nội Trần Linh Thước (2006) Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc kiểm tra giám sát Vệ sinh an toàn thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học Phát triển Công nghệ cấp Nhà nước Tiếng Anh: Agata N., M Ohta, Y Arakawa, and M Mori (1995) The bceT of Bacillus cereus encodes an enterotoxic protein Micro 141: 983-988 Agata N., Ohta, M., Mori, M., Isobe, M (1995) A novel dodecadepsipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus FEMS Microbiology Letters 129:17-20 10 Amano, K., Hazama, S., Akarari, Y., (1977) Isolation and characterization of structural composents of Bacillus cereus AHU 1356 cell walls European journal of Biochemistrey.pp 445-449 11 Andersson, A., Granum, P.E., and Ronner, U (1998) The adhesion of Bacillus cereus spores to epithelial cells might be an additional virulence mechanism International Journal of Food Microbiology 39(1-2) pp 93-99 48 12 Andersson, A., Ronner, U and Granum, P E (1995) What problem does the food industry have the spore - forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? International Journal of Food Microbiology 28 pp 145-155 13 Anita Tewari and Swaid Abdullah (2015) Bacillus cereus food poisoning: international and Indian perspective Joural of Food Science and Technology 14 AOAC (1995) Differentiation of members of Bacillus cereus group: Microbiological method Sec 17.8.02, Method 983.26 In Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th ed., P.A Cunniff (Ed.), 54-55 AOAC International, Gaithersburg, MD 15 Ash, C., and M.D Collins (1992) Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus antharacis and emetic Bacillus cereus determined by PCR direct sequencing FESM Microbiol Lett 73 pp 75- 80 16 Christiansson, A., Bertilsson, J and Svensson, B (1999) Bacillus cereus spores in raw milk: factors affecting the contamination of milk during the grazing period Journal of Dairy Science 82, pp 305- 314 17 Corry, D Roberts, and F.A Skiner (ed.) Isolation and indenfication methods for food poisoning organisms Academic Press, London 18 Drobniewski, F A (1993) Bacillus cereus and related species Clin Microbiol Rev 6, 324- 338 19 Ehling, S.M, Flicker, S and Scherer S (2004) Identification of emetic toxin producing Bacillus cereus strains by nouvel molecular assay FEMS Micro Lett 232; 189-195.determined by PCR direct sequencing FESM Microbiol Lett pp.73, 75- 80 20 Fernandez, A., Ocio, M J., Fernandez P S., Rodrigo, M and Martinez, A (1999) Application of non- linear regression analysis to the estimation of kinetic parameters for two enterotoxigenic strains of Bacillus cereus spores Food Microbiology 16 pp 607- 613 21 Graham Burgess, Paul Horwood (2006) Development of Improved Molecular Detection Methods for Bacillus cereus Toxins 2006 Rural Industries Research and Development Corporation 22 Guinebretiere, M.H and Nguyen- The, C (2003) Sources of Bacillus cereus Contamination in a pasteurized zucchini puree processing plant, differentiated by two PCR- based method FEMS Microbiology Ecology 43 pp 207-215 23 GuinebretiÌre MH, Broussolle V, Nguyen-The C (August 2002) "Enterotoxigenic Profiles of Food-Poisoning and Food-Borne Bacillus cereus Strains" 49 J Clin Microbiol 40 (8): 3053-6.doi:10.1128/JCM.40.8.3053056.2002 PMC 120679 PMID 12149378 24 Hansen,B.M and Hendriksen N.B.2001.Detection of Enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strain by PCR Analysis App & Environ Micro 67 pp 185- 189 25 Helgason, E Okstad, O.A Caugant, D.A.Johansen, H.A Fouet, A.Mock, M.Hegna, I and Kolsto, A.B (2000) Bacillus cereus, Bacillus anthracis and Bacillus thuringiensis – one species on the basis of genetic evidence App & Environ Micro 66: 2627-2630 26 Investigating the genome diversity of B cereus and evolutionary aspects of B anthracis emergence 27 Jeffery, E Rhodehamel and Stanley, M Harmon (1998) Bacillus cereus Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A Chapter 14 28 Johnson, K M (1984) Bacillus cereus foodborne illness-an update J Food Prot 47:145-153 29 Kenneth Todar Issue preview: Bacillus cereus Food Poisoning Retrieved on 17 september 2016 at http://textbookofbacteriology.net/B.cereus.html 30 Kramer, J.M and Gilbert, J.M (1989) Bacillus cereus and other Bacillus species Ch 2, In Foodborne Bacterial Pathogens, M.P.Doyle (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, p 21-70 31 Lotte P Stenfors Arnesen, Annette Fagerlund & Per Einar Granum, (2008), From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins FEMS Microbiol Rev 32:579-606 32 Murray R.E., Don J Brenner Jonh G Holt, Noel R Krieg, et al Bergey s Manual of Systematic Bacteriology Vol2 pp 529- 575 33 Notermans, S., and C.A Batt (1998) A rick assessment approach for food borne Bacillus cereus and its toxins J Appl Microbiol Symp Suppl 84: 51S- 61S 34 N.A Logan, (2011) Bacillus and relatives in foodborne illness Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072 35 Nooratiny, I and Sahilah, A M (2013) Detection of enterotoxin targeted entFM and hblA genes by inoculating Bacillus cereus (Strain BC1) into ready-to-eat food (RTF) and drink samples using polymerase chain reaction (PCR) International Food Research Journal 20(4): pp 1895-1899 50 36 Ombui JN, Nduhiu JG and Macharia JK (2005) Immuno assay and polymerase chain reaction techniques for detection of enterotoxigenic Bacillus cereus E.Afr.Med J.82: pp 422-426 37 Opinion of the Scientific Panel on Biological Hazards on Bacillus cereus and other Bacillus spp in foodstuffs The EFSA Journal (2004) 175, 1- 49 38 Ron S Ronimus, Lynne E.Parker, Hugh W Morgan (1996) The utilization of RAPD-PCR for identifying thermophilic and mesophilic bacillus specsies FEMS Microbiology Letters 147: pp 75-79 39 Svenson, B., Ekelund, K., Ogura, H and Christiansson, A (2004) Charactetisation of Bacillus cereus isolated from milk silo tanks at eight different dairy plants International Dairy Journal 14, pp 17- 27 40 Wijanands, L.M., Dufrenne, J.B., Van Leusden, F.M (2001) The pathogenic mechanism of the diarrheal syndrome caused by Bacillus cereus RIVM report 250912001/2002 41 Yamada, S., Ohashi, E., Agata, N., Venkateswaran, K., (1999) Cloning and nudeotide sequence analysis of gyrB of Bacillus cereus, B thuringiensis, B mycoides, and B anthracis and their application to the detection of B cereus in rice Appl Environ Microbiol 65(4), pp 1483- 1490 51 ... độc thực phẩm B cereus Do đó, tơi tiến hành thực đề tài: ? ?Phân lập, phát vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm Vi? ??t Nam? ?? Đề tài đặt nhằm đạt mục tiêu sau: Phát vi khuẩn B cereus. .. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblD gel agarose 1,5% 45 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Đề tài nghiên cứu ? ?Phân lập, phát vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm Vi? ??t Nam? ?? tiến hành... vong Ngộ độc thực phẩm nhiều nguyên nhân khác gây ra, số thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49% [1] Ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật có dạng gây bệnh: vi sinh vật tiết độc tố