HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ ĐÔNG ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN CÚM VÔ HOẠT TÁI TỔ HỢP H5 NHỊ GIÁ CHỦNG RE-6 + RE-8 SỬ DỤNG Ở GÀ, VỊT CHỐNG LẠI VIRUS CÚM A/H5N6 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM NĂM 2016 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Lan TS Tô Long Thành NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng: - Đây cơng trình nghiên cứu riêng - Các kết nghiên cứu luận văn trung thực, khách quan chưa sử dụng để bảo vệ học vị - Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Đông i LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập hoàn thành luận văn, nỗ lực thân, nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, cho phép tơi tỏ lịng biết ơn cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo, Ban Chủ nhiệm Khoa Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương, thầy cô giáo khoa Thú y giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập, tiếp thu kiến thức chương trình học Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học: PGS.TS Tô Long Thành PGS.TS Nguyễn Thị Lan Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ vượt qua khó khăn suốt q trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Một lần nữa, xin bày tỏ lòng biết ơn lời cảm ơn chân thành tới tập thể, cá nhân tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2017 Tác giả luận văn Trần Thị Đông ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần 1: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Sơ lược bệnh cúm gia cầm 2.1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 2.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 2.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm giới 2.1.4 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm Việt Nam 2.1.5 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 10 2.1.6 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm 10 2.1.7 Miễn dịch chống bệnh gia cầm 11 2.1.8 Phương pháp chẩn đoán cúm gia cầm 16 2.2 Virus cúm gia cầm 16 2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc virus cúm type A 17 2.2.2 Đặc tính kháng nguyên virus cúm 19 2.2.3 Độc lực virus 20 2.2.4 Sức đề kháng virus 20 2.2.5 Sự tiến hóa virus cúm 21 2.3 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm gia cầm 24 2.3.1 Các loại vacxin dùng 24 iii 2.3.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm giới 24 2.3.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm Việt Nam 25 Phần 3: Nội dung phương pháp nghiên cứu 27 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 27 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27 3.2 Nguyên liệu, đối tượng dùng nghiên cứu 27 3.2.1 Đối tượng, vật liệu 27 3.2.2 Các loại dung dịch, môi trường 27 3.3 Trang thiết bị máy móc, dụng cụ phịng thí nghiệm 27 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 28 3.4.1 Nội dung 28 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 28 3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 35 Phần 4: Kết thảo luận 36 4.1 Tình hình dịch cúm gia cầm năm gần 36 4.1.1 Nguyên nhân dịch Việt Nam 36 4.2.1 Phân bố chủng virus cúm gia cầm 39 4.2.2 Lưu hành virus 40 4.3 Kết xác định hiệu giá kháng thể vacxin tiêm cho đàn gà, vịt thí nghiệm 41 4.3.1 Hiệu giá kháng thể gà tiêm vacxin Re-6 + Re-8 41 4.3.2 Hiệu giá kháng thể vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 44 4.4 Kết theo dõi lâm sàng sau công cường độc 47 4.4.1 Kết theo dõi lâm sàng 47 4.4.2 Kết xét nghiệm virus thải cơ, quan nội tạng, não 58 4.4.4 So sánh hiệu giá kháng thể trung bình tỷ lệ bảo hộ lâm sàng gà vịt sử dụng vacxin Cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 62 Phần 5: Kết luận kiến nghị 65 5.1 Kết luận 65 5.2 Kiến nghị 66 Tài liệu tham khảo 67 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADN or DNA (Acid Deoxyribo Nucleic) : Axit deoxyribonucleic AI (Avian influenza) : Bệnh CGC ARN or RNA (Acid Ribonucleic) : Axit ribonucleic ATSH : An toàn sinh học Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn CEF (Chicken Embryo Fibroblast) : Tế bào sơ phôi gà CT (Cycle threshold ) : Giá trị ngưỡng vòng phản ứng ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent assay) : Xét nghiệm miễn dịch gắn men FAO (Food and Agriculture Organnization) : Tổ chức Nông Lương giới GMT (Geometric Mean Titre) : Hiệu giá Trung bình lượng giác HA (Haemagglutination assay) : Phản ứng ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination inhibition) : Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI (Highly pathogenic avian influenza) : Cúm gia cầm thể độc lực cao LPAI (Low pathogenic avian influenza) : Cúm gia cầm thể độc lực thấp MDCK cell (Madin-Darby Cannie Kidney cell) : Tế bào thận chó OIE (Office Internationale des Epizooties) : Tổ chức Thú y giới PBS (Phosphate-Buffered Saline) : Dung dịch đệm phôt phát rRT-PCR (Reverse Trancription Polymerase Chain Reaction) : Phản ứng chuỗi polyme phiên mã ngược theo thời gian thực TCID50 (Tissue Culture Infective Dosage) : Liều gây nhiễm 50% tế bào TW : Trung ương WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế giới v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin 29 Bảng 4.1 Tình hình dịch cúm gia cầm từ năm 2014 - 2016 37 Bảng 4.2 So sánh tình hình cúm gia cầm năm từ 2015 đến 2016 38 Bảng 4.3 Phân bố mức hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 42 Bảng 4.4 Phân bố mức hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 43 Bảng 4.5 Phân bố mức hiệu giá kháng thể nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 44 Bảng 4.6 Phân bố mức hiệu giá kháng thể nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 45 Bảng 4.7 Kết theo dõi lâm sàng đàn gà thí nghiệm sau cơng cường độc với H5N6 clade 2.3.4.4 49 Bảng 4.8 Kết theo dõi lâm sàng đàn vịt thí nghiệm sau cơng cường độc với H5N6 clade 2.3.4.4 51 Bảng 4.9 Kết phát virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4 gà 54 Bảng 4.10 Kết phát virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4 vịt 56 Bảng 4.11 Kết mổ khám gà 58 Bảng 4.12 Kết mổ khám vịt 60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc virus cúm type A 17 Hình 2.2 Sự tiến hóa clade virus H5N1 theo thời gian 21 Hình 2.3 Gia hệ virus cúm gia cầm năm 2015 - 2016 23 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh diện tích cúm gia cầm 37 Hình 4.2 Phân bố dịch cúm gia cầm 40 Hình 4.3 Mức phân bố hiệu giá kháng thể gà với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 42 Hình 4.4 Mức phân bố hiệu giá kháng thể gà với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 43 Hình 4.5 So sánh hiệu giá kháng thể gà 44 Hình 4.6 Mức hiệu giá kháng thể nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 45 Hình 4.7 Phân bố mức hiệu giá kháng thể nhóm vịt tiêm vacxin Re-6 + Re8 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 46 Hình 4.8 So sánh hiệu giá kháng thể vịt 46 Hình 4.9 Tỉ lệ sống sót gà sau cơng cường độc 50 Hình 4.10 Tỉ lệ sống sót vịt sau cơng cường độc 52 Hình 4.11 Mức độ thải virus nhóm gà 54 Hình 4.12 Mức độ thải virus nhóm vịt 57 Hình 4.13 So sánh hiệu giá kháng thể trung bình tỉ lệ bảo hộ gà vịt 62 Hình 4.14 So sánh mức độ thải gà vịt 63 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Trần Thị Đông Tên luận văn: “Đánh giá hiệu lực vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 sử dụng gà, vịt chống lại virus cúm A/H5N6 phân lập Việt Nam năm 2016’’ Chuyên ngành : Thú y Mã số: 60.64.01.01 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá hiệu lực vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 sử dụng gà, vịt để chống lại chủng virus cúm gia cầm cường độc H5N6 clade 2.3.4.4B (Lao-like) Phương pháp nghiên cứu a Hồi cứu tình hình dịch cúm gia cầm Việt Nam từ 2014 đến b.Thí nghiệm cơng cường độc đánh giá hiệu lực vacxin Re-6 + Re-8 chống lại virus H5N6 clade 2.3.4.4 Gà, vịt chọn từ đàn bệnh, chưa tiêm phòng vacxin CGC khơng có kháng thể kháng kháng ngun cúm H5 Gà, vịt lấy máu trước tiêm vacxin (khoảng 30% tổng đàn) để kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm phương pháp HI với kháng nguyên H5N1 Bố trí tiêm vacxin cho gà sau: Tổng số 50 gà chia thành lô Vacxin (30 con) lô Đối chứng (20 con) Tiêm vacxin cho 30 gà lô Vacxin với liệu trình mũi lúc 03 tuần tuổi với liều 0,3ml/con Gà thuộc lô Đối chứng không tiêm Bố trí tiêm vacxin cho vịt sau: Tổng số 50 vịt chia thành lô Vacxin (30 con) lô Đối chứng (20 con) Tiêm vacxin cho 30 vịt lơ Vacxin với liệu trình mũi lúc tuần tuổi với liều 0,3 ml/con nhắc lại lúc tuần tuổi với liều 0,5ml/con Vịt thuộc lô Đối chứng không tiêm Ba tuần sau tiêm vacxin, gà vịt lấy máu đánh giá hiệu giá kháng thể phương pháp HI với kháng nguyên tương đồng với chủng vacxin Công cường độc vào lúc tuần tuổi gà tuần tuổi vịt, tức 03 tuần sau hồn tất liệu trình vacxin, liều 106TCID50/100µl/con Theo dõi lâm sàng 10 ngày sau gây nhiễm, lấy mẫu swab họng vào ngày thứ thứ 10 gia cầm chết để định lượng virus thải phương pháp rRT-PCR Đối với gà chết, vịt mổ khám để đánh giá bệnh tích đại thể viii Kết - Tình hình dịch bệnh cúm đàn gia cầm Việt Nam từ năm 2014 đến - Sự phân bố lưu hành chủng virus cúm gia cầm địa bàn nước - Đánh giá đáp ứng miễn dịch gia cầm tiêm vacxin - Đánh giá mức độ bảo hộ lâm sàng vacxin gia cầm tiêm phòng thử thách cường độc với virus H5N6 clade 2.3.4.4B - Đánh giá tác dụng làm giảm thải virus gia cầm tiêm phòng Kết luận Từ nghiên cứu cho thấy: bệnh cúm gia cầm diễn biến phức tạp, xảy liên tục nước ta từ năm 2014 đến nay, đặc biệt có xuất chủng virus H5N6 Virus cúm H5N1 clade 2.3.2.1c chủ yếu lưu hành tỉnh phía Nam Các virus H5N6 thuộc clade 2.3.4.4 phân thành nhánh phụ 2.3.4.4A (dòng Trung Quốc) 2.3.4.4B (dòng Lào) lưu hành chủ yếu tỉnh Phía Bắc Bắc Trung Thử nghiệm hiệu lực vacin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re8 cho thấy: Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) gà tiêm vacxin Re-6 + Re-8 5,2 log2 với kháng nguyên 2.3.2.1 đạt 3,7 log2với kháng nguyên 2.3.4.4; vịt tiêm vacxin Re-6 + Re-8 7,2 log2 với kháng nguyên 2.3.2.1 đạt 4,3 log2với kháng nguyên 2.3.4 Tỉ lệ bảo hộ lâm sàng vacxin Re-6 + Re-8 gà vịt đạt mức 90%, gà đối chứng không tiêm vacxin tỷ lệ chết 100% sau ngày, vịt đối chứng tỷ lệ chết 40% sau 10 ngày theo dõi Đến thời điểm 10 ngày sau công cường độc, gà vịt thuộc lô vacxin không thải virus thải (gà 39,95, vịt 40) Vì vậy, sử dụng vacxin Re-6 + Re-8 để phòng bệnh cúm gia cầm virus Lao- like A/H5N6 2.3.4.4 gây ix Lô vịt đối chứng: + Phổi phù nề, tụ huyết + Xuất huyết tim, viêm hoại tử tim + Xuất huyết màng treo ruột + Bờ tuyến tụy không hoại tử 4.4.3 So sánh hiệu giá kháng thể trung bình tỷ lệ bảo hộ lâm sàng gà vịt sử dụng vacxin Cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re-6 + Re-8 Từ kết bảng 4.3; 4.4; 4.5 4.6, tiến hành so sánh hiệu giá kháng thể tỷ lệ bảo hộ lâm sàng nhóm gà vịt sau: Hình 4.13 So sánh hiệu giá kháng thể trung bình tỉ lệ bảo hộ gà vịt Từ minh họa hình 4.11 ta thấy sau tiêm vacxin Re-6 + Re-8 Trung Quốc sản suất hiệu giá kháng thể vịt đạt mức cao gà Cụ thể vịt HGKT với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 đạt 7,2 log2, HGKT với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 đạt 4,3 log2 gà HGKT với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 đạt 5,2 log2, HGKT với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 đạt 3,7 log2 Tuy nhiên tỷ lệ bảo hộ nhóm gà vịt đạt mức 90% Điều chứng tỏ vacxin Re-6 + Re-8 Trung Quốc sản xuất có hiệu tương đương nhóm gà vịt 62 Tuy nhiên vịt tiêm mũi (mũi vào tuần tuổi, mũi vào tuần tuổi) trường hợp vịt khơng đươc tiêm phịng tiêm phịng mũi mức độ thải virut giảm nhiều Có thể giải thích chế hình thành kháng thể tiêm vacxin, khác tiêm mũi nhắc lại mũi vacxin Re-6 + Re-8 sau: Việc tiêm mũi vacxin H5N1 tạo đáp ứng miễn dịch sơ cấp, kháng thể xuất chậm, sau vacxin đưa vào thể, hiệu giá kháng thể thấp Sau tiêm nhắc lại tạo đáp ứng miễn dịch thứ cấp, kháng thể xuất nhanh hơn, hiệu giá kháng thể cao nhiều so với đáp ứng miễn dịch tiên phát, thời gian sản xuất kháng thể kéo dài Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch sơ cấp thứ cấp vai trò tế bào nhớ miễn dịch (lympho T “nhớ”, lympho B “nhớ”) Ở miễn dịch thứ phát tế bào “nhớ” miễn dịch phát triển nhanh mạnh tạo lớp tế bào sản xuất kháng thể đặc hiệu Vì thế, kháng thể xuất sớm hơn, cường độ đáp ứng miễn dịch dài hơn, mạnh Từ kết bảng 3.10 3.11 tiến hành so sánh mức độ thải nhóm gà vịt sau: Hình 4.14 So sánh mức độ thải gà vịt Từ hình 4.14 ta thấy: Ở ngày thứ sau cơng cường độc, nhóm gà có mức thải virus gần tương đương với vịt (chỉ chênh 0,26 đơn vị) Đến ngày thứ 10 sau cơng cường độc mức độ thải virus ngồi mơi trường hai nhóm vacxin khơng đáng kể gần khơng có virus thải Kết cho thấy sau tiêm vacxin Re-6 + Re-8 thải virus đạt mức 63 thấp ngày thứ 3, sau giảm dần đến ngày 10 nhóm gà vịt, lượng kháng thể máu sau tiêm vacxin Re-6 + Re-8 cao hơn, đủ để ngăn cản virus nhân lên, có tác dụng bảo hộ tốt cho gà, vịt với virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4 Kết cho thấy rõ hiệu việc tiêm vacxin việc hạn chế lượng virus thải từ thể gà, vịt mang virus CGC ngồi mơi trường, đồng thời tăng tỷ lệ bảo hộ, giảm tỷ lệ chết gà, vịt bị nhiễm virus cúm Mức độ thải nhóm điều cho thấy vacxin Re-6 + Re-8 Trung Quốc sản xuất có tác dụng làm giảm lượng virut thải rõ rệt ta so sánh với nhóm khơng tiêm phịng Ở nhóm đối chứng lồi cơng lượng virut nhóm gà sau ngày tỷ lệ chết 100% vịt sau 10 ngày tỷ lệ chết đạt 40% tất vịt bị nhiễm virut (kết PCR cho thấy có virut) Theo chúng tơi có khác do: - Độ tuổi loài khác (gà tuần tuổi, vịt tuần tuổi) Vịt có độ tuổi lớn gà tuần nên sức đề kháng với virus vịt cao gà Mặc dù lô vịt đối chứng 100% vịt nhiễm virus (theo kết PCR) nhiên điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc tốt nên có 40% vịt đối chứng chết Cịn lơ gà đối chứng, cơng cường độc thời điểm tuần tuổi 100% gà nhiễm virus 100% gà chết sau ngày công cường độc - Tính chất thích ứng lồi khác Loài thủy cầm mà vịt đại diện loài có khả mang trùng tự nhiên virus Mang virus khơng có biểu triệu chứng; điều kiện chăm sóc ni dưỡng kém, thời tiết thay đổi…sức đề kháng thể giảm dịch cúm gia cầm bùng phát So sánh kết theo dõi lâm sàng gà vịt ta thấy: gà ốm chết đột ngột vịt ốm dai dẳng chết chậm chí khơng chết Cần đặc biệt lưu ý đến điều cơng tác phịng chống dịch cúm gia cầm 64 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trình bày trên, chúng tơi rút số kết luận sau: (1) Bệnh CGC diễn biến phức tạp, xảy liên tục nước ta từ năm 2014 đến nay, đặc biệt có xuất chủng virus H5N6 (2) Virus cúm H5N1 clade 2.3.2.1c chủ yếu lưu hành tỉnh phía Nam Các virus H5N6 thuộc clade 2.3.4.4a (dòng Trung Quốc) 2.3.4.4B (dòng Lào) lưu hành chủ yếu tỉnh Phía Bắc Bắc Trung (3) Với gà: + Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) gà tiêm vacxin Re 6-8 5,2 log2 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 đạt 3,7 log2 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 + Khi công cường độc tỷ lệ bảo hộ lô vacxin đạt 90%, lô đối chứng không tiêm tỷ lệ chết 100% sau ngày + Gà thuộc nhóm tiêm vacxin thải lượng virus thấp giảm dần 10 ngày thí nghiệm Gà thuộc nhóm đối chứng khơng tiêm nhiễm bệnh thải lượng virus lớn Lượng virus thải nhóm tiêm vacxin nhóm đối chứng chênh lệch lơn (4) Với vịt: + Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) gà tiêm vacxin Re 6-8 7,2 log2 với kháng nguyên H5N1 calde 2.3.2.1 đạt 4,3 log2 với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4 + Khi công cường độc tỷ lệ bảo hộ lô vacxin đạt 90%, lô đối chứng không tiêm tỷ lệ chết 40% sau 10 ngày + Gà thuộc nhóm tiêm vacxin thải lượng virus thấp giảm dần 10 ngày thí nghiệm Gà thuộc nhóm đối chứng khơng tiêm nhiễm bệnh thải lượng virus lớn Lượng virus thải nhóm tiêm vacxin nhóm đối chứng chênh lệch lớn 65 5.2 KIẾN NGHỊ (1) Có thể sử dụng vacxin Re-6 + Re-8 để phịng bệnh CGC virus Laolike A/H5N6 clade 2.3.4.4B gây (2) Thường xuyên đánh giá hiệu lực loại vacxin hành với chủng virus cúm lưu hành xuất 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Ban Chỉ đạo Quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm (2005), Báo cáo tổng kết công tác năm (2004-2005) phòng chống dịch cúm gia cầm, Hội nghị Tổng kết năm phòng chống dịch cúm gà, Hà Nội Bùi Quang Anh Văn Đăng Kỳ (2004) Bệnh CGC: lưu hành bệnh, chẩn đoán kiểm sốt dịch bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y 11(3) tr 69 -75 Cục Thú y (2004) Bệnh cúm gia cầm biện pháp phòng chống Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Cục Thú y (2005) Sổ tay hướng dẫn phòng chống bệnh CGC bệnh cúm người Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Cục Thú y (2014), Báo cáo tóm tắt kết công tác thú y 2014 kế hoạch công tác năm 2015, Hà Nội Cục Thú y (2015), Báo cáo tóm tắt kết cơng tác thú y 2015 kế hoạch công tác năm 2016, Hà Nội Cục thú y (2016), Báo cáo tóm tắt kết công tác thú y 2016 kế hoạch công tác năm 2017, Hà Nội Cục thú y (2017), Thông tin dịch cúm gia cầm tai xanh Truy cập ngày 1/4/2017, http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/thong-tin-ve-tinh-hinh-dich-cumgia-cam-lmlm-va-tai-xanh-ngay-31-3-2017.aspx Đào Yến Khanh (2005) Kiểm nghiệm khảo nghiệm vacxin CGC ngoại nhập Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 10 HNCTY (2008), Hội nghị tổng kết công tác năm 2008 triển khai kế hoạch năm 2009, Cục Thú y 11 HNCTY (2013), Hội nghị tổng kết công tác năm 2013 triển khai kế hoạch năm 2014, Cục Thú y 12 HNCTY (2015), Hội nghị tổng kết công tác năm 2015 triển khai kế hoạch năm 2016- Cục Thú y 13 Lê Văn Năm (2004) Bệnh cúm gà Khoa học Kỹ thuật Thú y 12 tr 81- 86 14 Lê Văn Năm (2007) Đại dịch CGC nguyên tắc phòng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 14 tr 91-94 67 15 Nguyễn Hoài Tao Nguyễn Tuấn Anh (2004) Một số thông tin dịch cúm gia cầm Chăn nuôi tr 27 16 Nguyễn Tiến Dũng (2004) Nguồn gốc virus CGC H5N1 Việt Nam năm 2003 – 2004 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 11(3) tr - 14 17 Phạm Sỹ Lăng (2004) Diễn biến bệnh CGC Châu Á hoạt động phịng chống bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 11(2) tr 91 - 94 18 Tô Long Thành (2004) Thông tin cập nhật tái xuất bệnh cúm gia cầm nước Châu Á Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y 11(4) tr 87- 93 19 Tơ Long Thành (2005) Kinh nghiệm phịng chống CGC sử dụng vacxin CGC Trung Quốc Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 12 tr 87-90 20 Tô Long Thành (2007) Các loại vaccine cúm gia cầm đánh giá hiệu tiêm phịng Tạp chí KHKT thú y 15(2) tr 84-90 21 Tống Xuân Độ (2009) Giám sát lưu hành Virus cúmA/H5N1 đánh giá hiệu sử dụng vaccine CGC địa bàn tỉnh Quảng Ninh Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 22 Trần Hữu Cổn Bùi Quang Anh (2004) Bệnh cúm gia cầm biện pháp phòng chống Hà Nội 23 Trương Văn Dung (2008) Những Kết nghiên cứu đạt đợc bệnh cúm gia cầm Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 15(4) tr 5-8 24 Trương Văn Dung Nguyễn Viết Không (2004) Một số hoạt động nghiên cứu khoa học Viện Thú y Quốc gia bệnh cúm gia cầm giải pháp khoa học cơng nghệ thời gian tới Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 11(3) tr 62-68 Tiếng Anh: 25 Alexander D J (1996) A review of avian in different bird species Vet Microbiol (74) pp 3–13 26 Capua I & Marrangon S (2000) “Review article: "The avian influenza epidermic in Italy”, 1999-2000 Avian Pathol., 29 pp 289-294 27 Franklin and Wecker (1950) Innactivation of some animal viruses by hydroxylamine and the structur of ribonucleic acid Nature 84 tr 343 – 345 28 Guan Y, Peiris JS, Lipatov AS, Ellis TM, Dyrting KC, Krauss S (2002) Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR Proc Natl Acad Sci USA 99 pp 8950-8955 68 29 Horimoto, Taisuke, Kawaoka and Yoshihiro (2001) Pandemic threat posed by avian influenza A viruses Clinical microbiology reviews 14(1) pp 129-149 30 Klenk, Hniemann R and Geyer R T Schwarz (1983) The characterization of influenza viruses by carbohydrate analysis Curr top Microbiol Immuno 104 pp 247-257 31 Matrosovich M, Zhou N, Kawaoka Y, Webster R (1999) The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties J Virol 73 pp 1146-1155 32 OIE (1992) Council of European Communities, Council Directive 92/40/Eec of 19 th May 1992 introducing Community measures for the control of avian influenza Official Journal of European Communities pp 1-15 33 Wallace, R.G., Hodac, H., Lathrop, R.H., Fitch,W.M (2007) A statistical phylogeography of influenza A H5N1 Proc Natl Acad Sci 104 4473–4478 34 Wu C, Cheng X, He J, Lv X, Wang J, Deng R, Long Q, Wang X (2008a) A multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and subtypes H5 and N1 J Virol Methods 148(1-2) pp 81-88 69 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần chuẩn bị dung dịch thuốc thử a Dung dịch kháng sinh đậm đặc Penicillin 1.000.000 IU Streptomycin 1g Nystatin 500.000 IU Nước cất 10 ml Lắc cho tan, lọc vơ trùng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm Sử dụng tốt tuần, bảo quản +4 oC b Dung dịch hồng cầu gà 1% Hồng cầu gà đặc Dung dịch PBS pH ~ 7,2 ml 99 ml Lắc đều, sử dụng đến ngày Bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC c Dung dịch RDE – Xử lý RDE c1 Dung dịch RDE RDE 20 ml Nước muối sinh lý 20 ml Lắc chia nhỏ ống ml bảo quản tủ –20 oC c2 Xử lý mẫu với dung dịch RDE Nhỏ phần huyết cần xét nghiệm vào phần RDE, lắc ủ nồi cách thủy 37 oC thời gian từ 18 h đến 20 h, sau chuyển sang ủ nồi cách thủy 56 oC thời gian từ 30 đến 60 Kết thúc trình ủ, giữ oC 30 sau nhỏ thêm phần dung dịch PBS pH ~7,2 Sau xử lý RDE, huyết xét nghiệm pha loãng 10 lần d Xử lý huyết chống tượng gây ngưng kết hồng cầu giả Hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu giả xử lý cách hấp phụ huyết kiểm tra với hồng cầu gà Thêm 25 l hồng cầu đặc vào 500 l huyết thanh, lắc 70 nhẹ để nhiệt độ phịng 30 min, sau ly tâm tốc độ 1500 đến 2500 g/giây – giây Thu lấy huyết hấp phụ để xét nghiệm Phụ lục 2: Trình tự số cặp mồi, hỗn hợp phản ứng chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng rRT-PCR để phát vi rút cúm A H5N6 a.Trình tự mồi-mẫu dị phát gen M, H5, N1 rRT-PCR Tên mồi (Ng.gốc) Kí hiệu mồi/probe Trình tự (5’-3’) Dùng tốt cho phát virus cúm gia cầm độc lực cao M-4 (CDC) M (AAHL) H5-3S (AAHL+ Probe HA 2-3) H5-3 (AAHL) H5-A (CDC) InfA Probe FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1 InfA xuôi GACCRATCCTGTCACCTCTGAC InfA ngược AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA IVA-MA-P Dùng tốt cho phát virus cúm gia cầm độc lực thấp TET-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-BHQ1 IVA-D161MF IVA-D162MR AGA TGAGYCTTCTAACCGAGGTCG TGC AAA NAC ATC YTC AAG TCT CTG Probe Dùng tốt cho phát virus cúm gia cầm H5 thuộc clade 2.3.4 HEX-TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA-BHQ1 Probe TET-TCAACAGTTGCGAGTTCTCTAGCA-BHQ1 Xuôi ACGTATGACTACCCGCAGTATTCA Ngược AGACCAGCTACCATGATTGC IVA-H5a-P Dùng tốt cho phát virus cúm gia cầm H5 thuộc clade TET-CAACAGTG GCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1 IVAD148H5-F AAA CAGAGAGGAAATAAGTGG AGTAAA ATT IVAD149H5-R AAA GATAGACCAGCTACCATGATTGC Dùng tốt cho phát virus cúm gia cầm H5 clade 2.3.2 a AH5a Probe1 TGACTACCC 2* GCAG”T”ATTCAGAAGAAGCAAGACTAA 71 H5-B (CDC) AH5a Probe2 2* CAACTATCCGCAG”T”ATTCAGAAGAAGCAAGATT AA AH5a xuôi TGGAAAGTRTAARAAACGGAACGT AH5a ngược YGCTAGGGARCTCGCCACTG Dùng tốt cho phát virus cúm gia cầm H5 clade 2.3.2 b AH5b Probe2 TACCCA TACCAACCA“T”CT ACCATTCCCTGCCAT AH5b xuôi GGAATG YCCCAAATATGTGAAATCAA AH5b ngược CCACTCCCCTGCTCRTTGCT Probe FAM-TGGTCT TGGCCAGACGGTGC-BHQ1 Xuôi TGGACTAGTGGGAGCAGCAT Ngược TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC N6-2 (Lao) b Hỗn hợp phản ứng chuẩn bị ống 0,2 ml với lượng cụ thể cho phản ứng Hỗn hợp phản ứng (Theo hương dẫn Kít Invitrogen Superscript qRT-PCR Kit) Lượng dùng cho phản ứng, µl 2x Reaction buffer 12,5 Mồi xi 20 μM 0,5 Mồi ngược 20 μM 0,5 Taqman probe μM 0,5 Enzyme mix 0,5 Nước cất nuclease 5,5 Mẫu ARN Tổng 25 c Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime RT-PCR phát virus cúm gia cầm H5N1 Chu trình Chu trình (95 oC 10 s 50 oC 15 58 oC 50 s) o 95 C lặp lại 40 lần 72 Phụ lục Phương pháp mổ khám - Nhúng ướt lơng gia cầm nước có pha dung dịch sát trùng - Đặt gia cầm nằm ngửa bàn mổ, dùng kéo dao cắt da vùng bụng bẹn hai bên chân, lật chân sang hai bên đồng thời kéo da bộc lộ hai đùi - Cắt da vùng lỗ huyệt xương lưỡi hái, tay cầm hai chân tay cầm phần da xương hái kéo ngược chiều lên tận vùng diều bộc lộ ngực - Kiểm tra ngực, đùi, xương lưỡi hái tình trạng khô cơ, xuất huyết, biến dạng - Dùng kéo dao rạch da từ phần diều lên tận phía mỏ bộc lộ diều, thực quản, khí quản, tuyến Thymus để kiểm tra bên - Dùng kéo cắt ngang phần lỗ huyệt xương lưỡi hái , cắt tiếp lên phía hai bên sụn sườn qua xương đòn, xương quạ, loại tổ chức dính, nhấc bỏ xương lưỡi hái ngồi bộc lộ xoang bụng xoang ngực - Quan sát túi khí phía ngồi quan nội tạng xoang bụng xoang ngực - Lấy máu tim tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm - Lấy gan, mật, lách để kiểm tra màu sắc, kích thước, hoại tử - Kiểm tra tuyến tụy - Cắt đứt phía dày tuyến, lật tồn dày, ruột phía sau để kiểm tra sau tránh nhiễm bẩn dụng cụ tổ chức khác - Kiểm tra toàn quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dịch hoàn, ống dẫn tinh) - Kiểm tra thận, ống dẫn niệu - Kiểm tra túi Fabricius bên bên hình dáng, kích thước, màu sắc, dịch - Dùng kéo mở bên cạnh mỏ quan sát xoang miệng Cắt ngang mỏ trên, kiểm tra xoang - Dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa mùi bên - Dọc khí quản kiểm tra dịch, xuất huyết, hoại tử bên - Kiểm tra xoang bao tim, dịch bên trong, mở tim kiểm tra cơ, xoang 73 van - Tách phổi khỏi xương sườn kiểm tra màu sắc, độ xốp - Bộc lộ dây thần kinh cánh trước xương sườn thứ nhất, dây thần kinh hông đùi xoang chậu thận để kiểm tra sưng - Rạch khớp gối kiểm tra dịch, bẻ xương đùi kiểm tra độ cứng mềm, chẻ dọc xương đùi kiểm tra tuỷ - Cắt đầu gia cầm đốt sống atlas, lột da, dùng kéo cắt xương cắt sang hai bên từ lỗ chẩm đến cạnh trước xương đỉnh, lật hộp sọ bộc lộ não Dùng kéo cong vô trùng tách màng não, cắt dây thần kinh lấy não - Dùng kéo rạch ruột rạch từ dày tuyến xuống tận hậu môn, kiểm tra tổn thương, hoại tử, xuất huyết, ký sinh trùng - Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm phịng thí nghiệm - Ghi báo cáo mổ khám phiếu gửi bệnh phẩm - Xử lý hấp tiêu độc xác gia cầm Phụ lục : Phương pháp Realtime PCR - Chiết tách ARN Sau xử lý mẫu, chiết tách ARN dịch bệnh phẩm kit thương mại ARN thu sau trình chiết tách dùng làm mẫu xét nghiệm - Tiến hành phản ứng + Phản ứng realtime RT-PCR phát vi rút cúm gia cầm sở phát đoạn gen M, H5 N1 thực sau: + Lựa chọn mồi mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR: cần tham khảo báo cáo giám sát để biết để lựa chọn mồi mẫu dò phù hợp với chủng vi rút lưu hành Các mồi mẫu dò để phát chủng vi rút H5N1 lưu hành liệt kê phụ lục + Chuẩn bị mồi nồng độ 20 µM mẫu dị nồng độ µM với nước Dnase/Rnase + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng Realtime RT-PCR phát đoạn gen M, H5, N1 theo hướng dẫn kit sử dụng phụ lục - Đọc kết 74 + Điều kiện phản ứng công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) có giá trị Ct ≤ 25 (± Ct), mẫu đối chứng âm tính khơng có Ct + Với điều kiện trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 coi dương tính Mẫu khơng có Ct âm tính Mẫu có giá trị 35< Ct ≤ 40 coi nghi ngờ + Những mẫu nghi ngờ cần xét nghiệm lại phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định Phụ lục 5: Một số hình ảnh trình thực tập 75 Phụ lục 6: Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm (TTCĐ) Đặc điểm dịch tễ học Kiểm tra lâm sàng Lấy mẫu bệnh phẩm (Huyết thanh, Phủ tạng, …) Phát kháng thể Phát kháng nguyên Phân lập virus (+) PCR, RTPCR (-) (-) Giám định (HI) Phân lập lần Kết luận bệnh 76 Phân lập virus (+) ... Việt Nam năm 20 16? ??’ 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Đánh giá hiệu lực vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re- 6 + Re- 8 sử dụng gà, vịt để chống lại chủng virus cúm gia cầm cường độc H5N6 clade 2.3.4.4B... phù hợp Xuất phát từ u cầu thực tế đó, chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Đánh giá hiệu lực vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re- 6 + Re- 8 sử dụng gà, vịt chống lại virus cúm A/H5N6 phân... Mục đích nghiên cứu Đánh giá hiệu lực vacxin cúm vô hoạt tái tổ hợp H5 nhị giá chủng Re- 6 + Re- 8 sử dụng gà, vịt để chống lại chủng virus cúm gia cầm cường độc H5N6 clade 2.3.4.4B (Lao-like) Phương