HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯỜNG VĂN HẢO ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC VẮC XIN CÚM VÔ HOẠT NAVET – VIFLUVAC (H5N1 CLADE 1) CHỐNG LẠI CÚM GIA CẦM H5N6 CLADE 2.3.4.4 Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Tô Long Thành TS Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: - Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi - Các kết nghiên cứu luận văn trung thực, khách quan chưa sử dụng để bảo vệ học vị - Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lường Văn Hảo i LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập hoàn thành luận văn, nỗ lực thân, nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, cho phép tơi tỏ lịng biết ơn cảm ơn chân thành tới: Ban Giám đốc Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo, Ban Chủ nhiệm Khoa Thú Y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương, thầy cô giáo khoa Thú y giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập, tiếp thu kiến thức chương trình học Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học: PGS.TS Tô Long Thành TS Lê Văn Phan Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn suốt q trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Một lần nữa, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn lời cảm ơn chân thành tới tập thể, cá nhân tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lường Văn Hảo ii MỤC LỤC Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Danh mục từ viết tắt VI Danh mục bảng VII Danh mục hình VIII Trích yếu luận văn IX Thesis abstract XI Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Sơ lược bệnh cúm gia cầm 2.1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 2.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm .3 2.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm giới 2.1.4 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm việt nam 2.1.5 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 10 2.1.6 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm 12 2.1.7 Miễn dịch chống bệnh gia cầm 13 2.1.8 Phương pháp chẩn đoán cúm gia cầm 18 2.2 Vi rút cúm gia cầm 18 2.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc vi rút cúm type a 18 2.2.2 Nguồn gốc, cấu trúc phân bố vi rút cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4 22 2.2.3 Đặc tính kháng nguyên vi rút cúm 23 2.2.4 Sự tiến hóa vi rút cúm 23 2.2.5 Độc lực vi rút 26 2.2.6 Sức đề kháng vi rút 27 2.2.7 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh vi rút cúm A tế bào vật chủ 28 iii 2.2.8 Nuôi cấy lưu trữ vi rút 29 2.3 Phòng bệnh cúm gia cầm 29 2.3.1 Các loại vắc xin dùng 29 2.3.2 Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm giới 30 2.3.3 Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm việt nam 31 2.3.4 Những điểm ý sử dụng vắc xin cúm gia cầm 32 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 33 3.1 Nội dung nghiên cứu 33 3.2 Địa điểm nghiên cứu 33 3.3 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 33 3.3.1 Nguyên liệu 33 3.3.2 Bố trí thí nghiệm 34 3.3.3 Phương pháp điều tra hồi cứu 34 3.3.4 Phương pháp lấy mẫu bảo quản bệnh phẩm 35 3.3.5 Phương pháp phát vi rút 36 3.5.4 Phương pháp realtime RT-PCR 38 3.3.6 Phương pháp phát kháng thể 42 3.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 43 Phần Kết thảo luận 44 4.1 Tình hình dịch cúm gia cầm nước năm gần 44 4.1.1 Tình hình dịch cúm gia cầm việt nam qua năm 44 4.2 Sự phân bố lưu hành chủng cúm gia cầm địa bàn nước qua năm 49 4.2.1 Phân bố chủng cúm gia cầm 49 4.2.2 Lưu hành vi rút 51 4.3 Xác định hiệu giá kháng thể gà, vịt sau tiêm phòng 54 4.3.1 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể gà tiêm phòng vắc xin Navetvifluvac 54 4.3.2 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể vịt tiêm phòng vắc xin Navetvifluvac 56 4.3.3 Khả độ bảo hộ mặt huyết học vắc xin tiêm phòng cho đàn gà, vịt 58 iv 4.4 Xác định khả bảo hộ lâm sàng vắc xin chống lại vi rút cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4 58 4.4.1 Kết thí nghiệm cơng cường độc với vi rút cúm H5N6 gà 58 4.4.2 Kết thí nghiệm công cường độc với vi rút cúm H5N6 vịt 61 4.4.3 Kết thải vi rút 63 Phần Kết luận kiến nghị 68 5.1 Kết luận 68 5.2 Kiến nghị .68 Tài liệu tham khảo 69 Phụ lục 72 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADN DNA (Acid Deoxyribo Nucleic) Axit deoxyribonucleic AI (Avian influenza) Bệnh Cúm gia cầm ARN RNA (Acid Ribonucleic) Axit ribonucleic ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Phản ứng miễn dịch gắn men assay) GMT (Geometic Mean Titer ) Hiệu giá kháng thể trung bình HA (Haemagglutination assay) Phản ứng ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination inhibition assay) Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI (Highly pathogenic avian influenza) Cúm gia cầm thể độc lực cao LPAI (Low pathogenic avian influenza) Cúm gia cầm thể độc lực thấp MDCK cell (Madin-Darby Cannie Kidney Tế bào thận chó Madin-Darby cell) PBS (Phosphate-Buffered Saline) Dung dịch đệm phôt phát RDE (Receptor destroying enzyme) Enzim phá huỷ điểm tiếp nhận Realtime RT- PCR (Reverse Trancription - Phản ứng chuỗi Polyme phiên mã Polymerase Chain Reaction) ngược theo thời gian thực vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vắc xin 34 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm cơng cường độc 34 Bảng 3.3 Primer probe để phát vi rút cúm gia cầm A/H5N6 40 Bảng 3.4 Lượng chất phản ứng Real time RT - PCR dùng cho cặp mồi phát gen MA (Cúm A), H5 41 Bảng 4.1 So sánh tình hình cúm gia cầm năm từ 2014 đến 2016 47 Bảng 4.2 Các tỉnh, thành phố có dịch năm 2016 48 Bảng 4.3 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể trước tiêm vắc xin gà, vịt .54 Bảng 4.4 Phân bố hiệu giá kháng thể nhóm gà tiêm vắc xin Navet-vifluvac .54 Bảng 4.5 Phân bố hiệu giá kháng thể nhóm vịt tiêm vắc xin Navetvifluvac 56 Bảng 4.6 So sánh phân bố hiệu giá kháng thể loài gà, vịt sau tiêm phòng 57 Bảng 4.7 Khả bảo hộ mặt huyết học loại vắc xin sau tiêm phòng 58 Bảng 4.8 Kết công cường độc với vi rút cúm H5N6 gà thí nghiệm 59 Bảng 4.9 Kết công cường độc với vi rút cúm H5N6 vịt thí nghiệm 61 Bảng 4.10 Bảng điểm lâm sàng tỷ lệ bảo hộ đàn gà, vịt sau công cường độc 63 Bảng 4.11 Kết mức độ thải vi rút động vật sau công cường độc 64 Bảng 4.12 Kết phát vi rút cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4 65 Bảng 4.13 Mức độ thải vi rút nhóm gà, vịt thí nghiệm 65 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu tạo ngồi vi rút cúm gia cầm 19 (Nguồn: http://www.medicalecology.org/diseases/influenza/influenza.htm) 19 Hình 2.2 Sự tiến hóa clade vi rút H5N1 theo thời gian (WHO) (http://afludiary.blogspot.com/2011/10/h5n1-increasingly-complexfamily-tree.html) .25 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh dịch cúm gia cầm từ năm 2014 – 2016 48 Phân bố không gian vi rút cúm subtype H5 Việt Nam năm 2014.( Nguồn: Cục Thú y, 2014) .50 Phân bố không gian vi rút cúm subtype H5 Việt Nam năm 2015.( Nguồn: Cục Thú y, 2015) 50 Hình 4.2 Phân bố khơng gian vi rút cúm H5 Việt Nam năm 2014-2015 50 Hình 4.3 Phân bố khơng gian vi rút cúm subtype H5 miền Bắc, miền Trung Tây Nguyên Việt Nam năm 2016 51 Hình 4.4 Cây phả hệ vi rút cúm subtype H5 miền Bắc, miền Trung Tây Nguyên Việt Nam năm 2016 53 Hình 4.5 Biểu đồ phân bố hiệu giá kháng thể sau tiêm phịng gà thí nghiệm 55 Hình 4.6 Biểu đồ phân bố hiệu giá kháng thể sau tiêm phịng vịt thí nghiệm .57 Hình 4.7 Biểu đồ khả bảo hộ sau công cường độc gà thí nghiệm 61 Hình 4.8 Biểu đồ khả bảo hộ sau công cường độc vịt thí nghiệm .62 Hình 4.9 Biểu đồ diễn biến mức độ thải vi rút nhóm gà thí nghiệm 66 Hình 4.10 Biểu đồ diễn biến mức độ thải vi rút nhóm vịt thí nghiệm 67 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lường Văn Hảo Tên Luận văn: Đánh giá hiệu lực vắc xin cúm vô hoạt Navet-vifluvac (H5N1 clade 1) chống lại cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4 Ngành: Thú Y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá hiệu lực vắc xin cúm vô hoạt Navet-vifluvac (H5N1 clade 1) sử dụng cho gà, vịt thí nghiệm cơng cường độc với chủng virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4” Khảo sát khả bảo hộ vắc xin với virus, tạo sở khoa học giúp nhà quản lý đưa chiến lược phòng chống bệnh phù hợp Phương pháp nghiên cứu - Hồi cứu tình hình dịch cúm gia cầm Việt Nam từ 2014 đến - Thí nghiệm cơng cường độc đánh giá hiệu lực vắc xin Navet-vifluvac chống lại virus H5N6 clade 2.3.4.4 Gà, vịt chọn từ đàn bệnh, chưa tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm khơng có kháng thể kháng kháng ngun cúm H5 Gà, vịt lấy máu trước tiêm vắc xinđể kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm phương pháp HI với kháng nguyên H5 Bố trí tiêm vắc xin cho gà sau: Tổng số 45 gà chia thành nhóm: vắc xin (30 con) lô đối chứng (15 con) Tiêm vắc xin cho 30 gà lơ vắc xin với liệu trình mũi lúc 03 tuần tuổi với liều 0,3ml/con Gà thuộc lô đối chứng khơng tiêm Bố trí tiêm vắc xin cho vịt sau: Tổng số 45 vịt chia thành nhóm: vắc xin (30 con) lơ đối chứng (15 con) Tiêm vắc xin cho 30 vịt lô vắc xin với liệu trình mũi lúc tuần tuổi với liều 0,5 ml/con nhắc lại lúc tuần tuổi với liều 0,5ml/con Vịt thuộc lô đối chứng không tiêm Ba tuần sau tiêm vắc xin, gà vịt lấy máu đánh giá hiệu giá kháng thể phương pháp HI với kháng nguyên tương đồng với chủng vắc xin - Tiến hành công cường độc lúc tuần tuổi gà tuần tuổi vịt Lượng vi rút dùng để công cường độc: 106TCID50/100ul/con ix đáp ứng miễn dịch lồi có thề có khác biệt nói việc tiêm liều thời điểm tuần tuần vịt cho hiệu giá kháng thể mức độ cao cách rõ rệt Trong lơ gà thí nghiệm tiêm 01 mũi vắc xin cho đáp ứng miễn dịch tập trung mức hiệu giá kháng thể trung bình cao 4.3.3 Khả độ bảo hộ mặt huyết học vắc xin tiêm phòng cho đàn gà, vịt Từ phân tích hiệu giá kháng thể loại vắc xin so sánh khả bảo hộ vắc xin gà, vịt thí nghiệm Bảng 4.7 Khả bảo hộ mặt huyết học loại vắc xin sau tiêm phịng Nhóm thí nghiệm tiêm vắc xin Navet- Số gà xét nghiệm Liệu trình vifluvac (con) Gà 28 mũi 4,4 19 67,9 Vịt 27 mũi 7,7 26 96,3 GMT (log2) Số mẫu (con) có HGKT ≥ log2 Tỷ lệ % Qua bảng số liệu cho thấy, vịt thí nghiệm có 96,3% vịt có đáp ứng miễn dịch mức ≥ log2 Trong nhóm gà có 67,9% có đáp ứng miễn dịch mức ≥ log2 Tuy nhiên để đánh giá khả bảo hộ động vật thí nghiệm cách xác cụ thể sử dụng thử thách vi rút cường độc Kết quả chi tiết trình bày phần 4.4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG BẢO HỘ LÂM SÀNG CỦA VẮC XIN CHỐNG LẠI VI RÚT CÚM GIA CẦM H5N6 CLADE 2.3.4.4 4.4.1 Kết thí nghiệm cơng cường độc với vi rút cúm H5N6 gà Để đánh giá khả bảo hộ lâm sàng chống lại vi rút cúm gia cầm loại vắc xin, tiến hành công cường độc cho lơ gà, vịt thí nghiệm, cơng cường độc coi “phương pháp vàng” việc đánh giá khả bảo hộ vắc xin Để đảm bảo đàn gà, vịt đủ tiêu chuẩn tiến hành thí nghiệm, chúng tơi kiểm tra mang trùng vi rút cúm type A toàn gà, vịt (bằng Realtime RT- PCR) kiểm tra kháng thể kháng cúm H5N1 gà, vịt đối chứng (bằng HI) Kết (khơng trình bày cụ thể) cho thấy tồn gà, vịt thí nghiệm khơng mang trùng vi rút cúm type A, gà đối chứng khơng có kháng thể kháng cúm H5N1 Thí nghiệm cơng cường độc tiến hành chuồng ni an tồn sinh học Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương Lượng vi rút dùng để cơng cường 58 độc: 106TCID50/100µl/con Đường gây nhiễm nhỏ mũi nhóm vắc xin đối chứng gà tuần tuổi, vịt tuần tuổi (do vịt sử dụng liệu trình mũi vắc xin) Để đảm bảo tiêu số lượng mẫu giảm bớt chi phí thí nghiệm mà khơng ảnh hưởng đến tính xác kết tiến hành công cường độc 15 gà, 15 vịt bố trí bảng 3.2 nêu Chúng tiến hành theo dõi ghi chép biểu lâm sàng đàn gà thí nghiệm 10 ngày kể từ ngày cơng cường độc Căn vào triệu chứng cụ thể gà, vịt lơ thí nghiệm chúng tơi đánh giá chấm điểm lâm sàng theo mức từ đến điểm + Gà, vịt chấm điểm gà, vịt khỏe mạnh bình thường + Gà, vịt chấm điểm ốm nhẹ, bỏ ăn + Gà, vịt chấm điểm gà, vịt bị ốm nặng, nằm liệt + Gà, vịt chấm điểm gà, vịt chết Kết theo dõi lâm sàng đàn gà tiêm vắc xin lô đối chứng thể bảng 4.7 Điểm lâm sàng Ngày sau công cường độc Điểm lâm STT/Kí hiệu Tỷ lệ chết 12/4 13 14 15 16 17 18 19 20 21 sàng 10 Gà Navetco 0,51 20% 0,00 3 3 3 3 2,40 0,00 11 0,00 Tỷ lệ bảo 13 3 3 3 2,20 hộ 80% 15 0,00 16 1 1 0,50 18 0,00 21 0,00 10 27 0,00 2,36 100% Gà đối chứng 202 3 3 3 2,20 210 3 3 3 3 2,50 Tỷ lệ sông 211 3 3 3 3 2,50 sót 0% 215 3 3 3 2,20 219 3 3 3 3 2,40 Bảng 4.8 Kết công cường độc với vi rút cúm H5N6 gà thí nghiệm 59 Qua số liệu bảng 4.7, đưa phân tích sau a Nhóm gà đối chứng Gà lô đối chứng sau ngày gây nhiễm với liều cơng cường độc có biểu bình thường, vào ngày thứ có gà gà có dấu hiệu mệt mỏi, bỏ ăn bắt đầu có triệu chứng hơ hấp Sau ngày theo dõi có 3/5 gà chết có triệu chứng điển hình bệnh cúm gia cầm triệu chứng hô hấp triệu chứng thần kinh Trong gà chết có gà có triệu chứng hơ hấp, gà chết trước khơng có biểu lâm sàng ngày thứ ngày thứ Sau ngày theo dõi tồn số gà lô đối chứng chết có triệu chứng điển hình bệnh cúm gia cầm Như nhóm gà đối chứng khơng tiêm vắc xin có tỷ lệ chết 100% cơng cường độc với loại vi rút dùng thí nghiệm b Nhóm gà tiêm vắc xin Navet-vifluvac Sau ngày cơng cường độc đàn gà tiêm phịng vắc xin khỏe mạnh khơng có biểu gà ốm Đến ngày thứ sau cơng có 1/10 gà chết, 1/10 gà bắt đầu xuất triệu chứng bệnh cúm Sang ngày thứ thêm gà bị chết, hai gà chết rơi vào gà khơng có đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng kết phù hợp với nghiên cứu trước cho thấy gà có hiệu giá kháng thể < log2 không đủ khả bảo hộ gia cầm (ngưỡng bảo hộ ≥ log2), ngày thứ khơng có gà có triệu chứng, sang ngày thứ sau cơng có thêm gà có triệu chứng theo dõi ngày gà bị ốm cho lúc kết thúc thí nghiệm; Như tỷ lệ gà chết tăng dần ngày kể từ ngày theo dõi thứ Sau 10 ngày theo dõi, có 80% (8/10 con) gà vắc xin sống sót Kết cho thấy gà khơng có đáp ứng miễn dịch thời gian chết tương đương với lô gà đối chứng Mặc dù hiệu giá kháng thể trung bình nhóm gà tiêm vắc xin Navetvifluvac công ty Navetco cung cấp thấp đạt mức 4,4 log2 cho khả bảo hộ lâm sàng sau công cường độc tương đối cao với 80% gà sống sót sau kết thúc thí nghiệm Kết tương đương với thử nghiệm vắc xin tiến hành năm trước Từ kết ta có biểu đồ tỷ lệ sống sót sau cơng cường độc 60 Hình 4.7 Biểu đồ khả bảo hộ sau cơng cường độc gà thí nghiệm 4.4.2 Kết thí nghiệm công cường độc với vi rút cúm H5N6 vịt Vào thời điểm tuần sau tiêm nhắc lại, nhóm vịt gây nhiễm vi rút H5N6 clade 2.3.4.4 theo quy trình thí nghiệm nêu Chương III Kết theo dõi lâm sàng sau: Bảng 4.9 Kết công cường độc với vi rút cúm H5N6 vịt thí nghiệm STT/ Kí hiệu Vịt Navetco 51 54 55 56 57 58 68 70 77 10 82 Vịt đối chứng 270 290 262 258 269 14/1 Điểm lâm sàng Ngày sau công cường độc Điểm 15 16 17 18 19 20 21 22 23 lâm Tỷ lệ chết 10 sàng 0,00 0% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Tỷ lệ bảo 0,00 hộ 100% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,64 40% 0,00 0,00 Tỷ lệ 3 3 3 1,80 sống sót 0,00 60% 2 2 1,40 61 a Nhóm vịt đối chứng Đối với nhóm vịt đối chứng không tiêm vắc xin: Sau ngày kể từ gây nhiễm vi rút H5N6 clade 2.3.4.4 qua đường nhỏ mũi, có vịt bắt đầu có biểu mệt mỏi, ủ rũ, ăn đột ngột có triệu trứng thần kinh, ngoẹo cổ Qua theo dõi triệu chứng kéo dài từ ngày thứ ngày biểu nặng dần, sau vật chết vào ngày thứ 10 Như ta thấy thời gian bị bệnh vịt kéo dài nhiều so với gà, trường hợp vịt ốm kéo dài ngày chết Sang ngày thứ có thêm vịt chết, qua thời gian theo dõi 10 ngày tổng số vịt chết sau công cường độc 2/5 con, với tỷ lệ chết 60% b Nhóm vịt tiêm vắc xin Navet-vifluvac Đối với nhóm vịt tiêm vắc xin Navet-vifluvac: thời gian theo dõi 10 ngày, khơng có vịt có biểu ốm, vịt khỏe mạnh, ăn uống bình Tỷ lệ bảo hộ lâm sàng đạt 100% - Như ta nhìn cách cụ thể qua biểu đồ sau Hình 4.8 Biểu đồ khả bảo hộ sau công cường độc vịt thí nghiệm Qua bảng biểu đồ 100% vịt tiêm vắc xin bảo hộ vi rút công cường độc, ta nhận thấy vịt nói riêng thuỷ cầm nói chung mẫn cảm vi rút giảm dần theo độ tuổi, gia cầm có thích nghi định mà khơng có biểu triệu chứng lâm sàng hay nói cách khác thuỷ cầm nguồn tàng trữ reo rắc mầm bệnh tự nhiên Số lượng vịt đối chứng sống sót sau cơng cường độc chiếm tỷ lệ 60% vịt vắc xin 100% với khơng có biểu lâm sàng cụ thể Kết cao so với kết 62 thử nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương tiến hành năm 2015, với khả bảo hộ 83%, thí nghiệm chúng tơi thu kết bảo hộ 100% (Trung Tâm Chẩn Đốn Thú Y Tw, 2015) Qua phân tích thấy vắc xin Navet-vifluvac cho tỷ lệ bảo hộ cao gà vịt thí nghiệm, tỷ lệ bảo hộ với gà 80%, với vịt 100% Bảng 4.10 Bảng điểm lâm sàng tỷ lệ bảo hộ đàn gà, vịt sau công cường độc H5N6 clade 2.3.4.4 Gà Vịt Gà đối chứng Vịt đối chứng Điểm lâm sàng trung bình 0,51 2,36 0,64 Tỷ lệ sống sót 80 (%) 100 (%) (%) 60 (%) Như ta thấy có khác lơ gà vịt thí nghiệm, tỷ lệ sống sót lồi có khác kèm theo chên lệch điểm lâm sàng thời gian chết động vật thí nghiệm Gà đối chứng chết 100% vào ngày thứ 4, vịt đối chứng ngày thứ chết con, ốm kéo dài chết vào ngày thứ 10 sau cơng, điều có nghĩa lồi khác độc lực vi rút có khác nhau, thể rõ thông qua điểm lâm sàng lơ thí nghiệm Gà vắc xin có tỷ lệ chết 20% rơi vào gà khơng có đáp ứng miễn dịch, vịt vắc xin khơng có chết Kết phù hợp với đáp ứng miễn dịch lồi Gà vắc xin có 7/28 khơng có đáp ứng miễn dịch, vịt có khơng có đáp ứng miễn dịch Như thấy cá thể khác có đáp ứng miễn dịch khác nhau, khơng đồng với tồn đồn Vịt thí nghiệm sử dụng liệu trình 02 mũi cho đáp ứng miễn dịch cao đồng đểu so với gà thí nghiệm sử dụng liệu trình 01 mũi vắc xin, qua ta thấy ý nghĩa việc tiêm nhắc lại vắc xin thực tế sản xuất 4.4.3 Kết thải vi rút Bên cạnh việc theo dõi lâm sàng hàng ngày suốt thời gian thực thí nghiệm cơng cường độc, tiến hành thu thập mẫu dịch ngoáy hầu họng chết sống vào ngày thứ 3, ngày thứ 10 ngày chết gà, vịt sau công Các tăm bơng ngốy hầu họng bảo quản dung dịch PBS, sau chiết tách RNA kít Qiagen Rneasy minitkit, xét nghiệm phản ứng Realtime RT- PCR theo quy trình xét nghiệm Cục Thú y Mức độ thải chi tiết nhóm gà, vịt thí nghiệm trình bày bảng 4.11 63 Bảng 4.11 Kết mức độ thải vi rút động vật sau công cường độc STT/KHM Gà vắc xin 10 10 5 11 13 15 16 18 21 27 Vịt vắc xin 51 54 55 56 57 58 68 70 77 82 Gà đối chứng 202 210 211 215 219 Vịt đối chứng 270 290 262 258 269 ngày O-swab 35.88 40.00 Sự thải vi rút ngày 10 O-swab 39.67 40.00 ngày chết O-swab 24.75 23.84 31.25 40.00 27.15 32.83 31.71 40.00 40.00 40.00 32.72 25.94 33.00 28.94 40.00 26.36 40.00 35.75 28.47 36.95 31.81 27.17 25.6 40.00 40.00 25.66 37.39 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 40.00 28.74 29.49 28.36 28.28 25.84 24.99 40.00 64 39.98 40.00 39.94 24.15 29.10 20.58 22.32 24.00 24.77 29.71 26.95 40.00 32.47 Kết phát vi rút cúm gia cầm A/H5N6 clade 2.3.4.4 sau cơng cường độc trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết phát vi rút cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4 RRT- PCR (phát vi rút) H5N6 clade 2.3.4.4 Số thí nghiệm Kiểm tra mẫu Kiểm tra mẫu Kiểm tra mẫu Swab sau Swab sau 10 ngày Swab gà, ngày công cường cơng cường độc vịt bị chết độc (Dương tính) (Dương tính) (Dương tính) Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ kiểm tra % kiểm tra % kiểm tra % Gà Vịt 10 10 10/10 10/10 100 100 8/10 8/10 0 2/10 20 Gà đối chứng Vịt đối chứng 5 5/5 5/5 100 100 5/5 3/5 0 5/5 2/5 100 40 Qua bảng ta thấy ngày thứ sau cơng cường độc có 100% gà, vịt thí nghiệm dương tính với vi rút cúm Nhưng sang đến ngày thứ 10 100% động vật thí nghiệm khơng thải vi rút Như vắc xin Navet-vifluvac có tác dụng làm giảm khả thải cách rõ rệt Kết xét nghiệm Realtime RT-PCR thể giá trị Ct (Cycle threshold - giá trị ngưỡng vòng phản ứng) Giá trị Ct tỷ lệ nghịch với mức độ vi rút có mẫu kiểm tra Nghĩa lượng vi rút cao Ct thấp ngược lại Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 dương tính Do giá trị Ct tỷ lệ nghịch với lượng vi rút có mẫu xét nghiệm, nên quy ước giá trị Ct sang mức độ từ + đến ++++ để dễ biểu thị kết lượng vi rút có mẫu kiểm tra Cụ thể sau: Ct từ >20 đến 25 coi ++++, Ct từ >25 đến 30 coi +++, Ct từ >30 đến 35 coi ++, Ct từ >35 đến 39 coi + mẫu có giá trị Ct 40 coi âm tính với vi rút cúm Lượng vi rút thải thể qua Bảng 4.12 Bảng 4.12 Mức độ thải vi rút nhóm gà, vịt thí nghiệm H5N6 clade Chỉ số Ct trung bình Ngày Mức độ Ngày Mức độ Ngày Mức độ thải vi rút 10 thải vi rút chết thải vi rút Gà Vịt Gà đối chứng 35,88 32,72 27,17 + +++ ++ 39,67 40,00 40,00 (-) (-) (-) 24,75 40,00 24,15 ++++ (-) ++++ Vịt đối chứng 29,49 ++ 39,98 (+) 29,71 ++ 2.3.4.4 65 4.4.2.1 Mức độ thải vi rút gà sau công cường độc Những gà không tiêm vắc xin công cường độc vi rút H5N6 clade 2.3.4.4 tỷ lệ chết 100% sau 2-3 ngày mức độ thải vi rút lớn với số Ct trung bình 27,17 Chỉ số thể lượng vi rút thải ngồi mơi trường vơ lớn Mức độ thải có vi rút lớn ngày chết với số Ct trung bình 24,15 Như thấy có tăng lên vi rút sau cơng từ ngày thứ cao ngày chết Điều cho thấy phù hợp với nhân lên vi rút thể vật chủ mà khơng có diện kháng thể trung hoà vi rút Sau gây nhiễm vi rút H5N6 clade 2.3.4.4 nhóm gà tiêm vắc xin Navet-vifluvac thải lượng nhỏ vi rút mẫu Swab hầu họng thời điểm ngày khơng cịn thải vi rút thời điểm 10 ngày Những gà chết phát vi rút mẫu hầu họng, đặc biệt lượng vi rút cao Hình 4.9 Biểu đồ diễn biến mức độ thải vi rút nhóm gà thí nghiệm Có thể thấy vắc xin Navet-vifluvac có tác dụng làm giảm lượng vi rút thải trường hợp gà tiêm phòng bị nhiễm vi rút H5N6 clade 2.3.4.4 Qua kiểm tra Mức độ thải vi rút phương pháp Realtime RT – PCR kết bảng ta thấy số Ct trung bình gà tiêm vắc xin Navet – vifluvac sau ngày công cường độc 35,88 cho kết âm tính với vi rút cúm gia cầm sau 10 ngày công số Ct trung bình 39,67 coi âm tính (Ct ≥ 35 coi âm tính) Điều chứng tỏ cơng cường độc cho nhóm gà tiêm vắc xin Navet-vifluvac sau 10 ngày theo dõi lượng vi rút bị thải khơng cịn Những gà bị chết lượng vi rút thải cao với số Ct trung bình 24,75 Những gà chết nhóm vắc xin rơi vào 66 gà khơng có đáp ứng miễn dịch Kết phù hợp với nghiên cứu trước khả bảo hộ gia cầm gà có hiệu giá kháng thể ≥ 4log2 có khả bảo hộ Như ta thấy tiêm vắc xin cho gia cầm gia cầm sinh miễn dịch mức độ thải vi rút giảm cách rõ rệt (giá trị Ct mức âm tính vào ngày thứ ngày 10 sau công cường độc) Trong lơ đối chứng có lượng vi rút thải lớn 4.4.2.2 Mức độ thải vi rút vịt sau công cường độc Sau gây nhiễm vi rút H5N6 clade 2.3.4.4, Vịt nhóm đối chứng kiểm tra thời điểm ngày sau cơng cường độc có Ct mức 29,49, nhiên ngày thứ 10 huỷ thí nghiệm giá trị Ct mức 39,98 có nghĩa khơng có tượng thải vi rút Những vịt bị chết mức độ thải vi rút tương đối cao với số Ct trung bình 29,71 Điều chứng tỏ gây nhiễm vi rút H5N6 clade 2.3.4.4, nhóm vịt tiêm khơng tiêm vắc xin Navetvifluvac mức độ thải vi rút thời điểm đầu tương đối lớn Đối với lô vắc xin sau gây nhiễm vi rút H5N6 clade 2.3.4.4, vịt tiêm vắc xin Navet -vifluvac thải lượng nhỏ vi rút mẫu Swab hầu họng thời điểm ngày khơng cịn thải vi rút thời điểm 10 ngày Như thấy vắc xin làm giảm khả thải vi rút cách rõ rệt Kết tương đương với kết nghiên cứu trước (Trung Tâm Chẩn Đoán Thú Y Tw, 2015) Hình 4.10 Biểu đồ diễn biến mức độ thải vi rút nhóm vịt thí nghiệm 67 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu được, rút số kết luận sau: (1) Nhánh 2.3.4.4 vi rút cúm gia cầm A/H5N6 xuất lây lan phạm vi nước từ tháng 4/2014 Đặc biệt tập trung miền Bắc miền Trung (2) Vắc xin Navet-vifluvac có khả kích thích sinh miễn dịch tốt với động vật thí nghiệm, cụ thể sau: gà có mức hiệu giá kháng thể trung bình GMT với liệu trình 01 mũi vắc xin 4,4 log2; vịt thí nghiệm có mức hiệu giá kháng thể trung bình GMT với liệu trình mũi tiêm 7,7 log2 (3) Khả bảo hộ lâm sàng vắc xin Navet-vifluvac sau công cường độc vi rút cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4 gà thí nghiệm 80%, vịt thí nghiệm 100% (4) Vắc xin Navet-vifluvac có tác dụng làm giảm khả thải vi rút môi trường hai lồi gà vịt sau cơng cường độc 5.2 KIẾN NGHỊ (1) Tăng cường kiểm tra, giám sát chất lượng vắc xin, q trình tiêm phịng để tỷ lệ bảo hộ đàn gia cầm cao (2) Căn vào phân bố chủng vi rút để sử dụng loại vắc xin phòng bệnh phù hợp cho khả bảo hộ cao (3) Định kỳ lấy mẫu giám sát vi rút cúm gia cầm để tìm hiểu biến đổi vi rút 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Quang Anh Văn Đăng Kỳ (2004) Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đoán kiểm soát dịch bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y tr 69 -75 Cục Thú y (2004) Bệnh cúm gia cầm biện pháp phòng chống Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Cục Thú y (2015) Báo cáo tóm tắt kết cơng tác thú y 2015 kế hoạch công tác năm 2016 Cục Thú y (2016) Hội nghị tổng kết công tác năm 2016 triển khai kế hoạch năm 2017 Lê Thanh Hòa (2006) Chiến lược nghiên cứu ứng d ng vi rút vector tái tổ hợp sản xuất vaccine hệ Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (4) tr 397 - 416 Lê Văn Năm (2004) Bệnh cúm gà Tạp chí Khoa học Thú y 12 tr 81-86 Lê Văn Năm (2007) Đại dịch cúm gia cầm ngun tắc phịng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y tr 91-94 Nguyễn Tiến Dũng, Đào Thanh Vân , Bùi Ngọc Anh, Kenjiro Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Bá Thành Phạm Thị Kim Dung (2005) Giám sát tình trạng nhiễm vi rút cúm gia cầm đồng Sông Cửu Long cuối năm 2004 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y 12 (2) tr 13-18 Nguyễn Tiến Dũng (2008) Vài nét cúm gia cầm H5N1 Tạp chí Khoa học Thú y tr 80 - 86 10 Nguyễn Đăng Thọ, Nguyễn Hoàng Đăng, Đỗ Thị Hoa Đàm Thị Vui, Mai Thùy Dương, Nguyễn Thị Điệp, Nguyễn Viết Không Tô Long Thành (2016) Vi rút cúm gia cầm độc lực cao H5N6 Việt Nam năm 2014 Tạp chí Khoa học Thú y tr 18 - 28 11 Phạm Sỹ Lăng (2004) Diễn biến bệnh cúm gia cầm Châu Á hoạt động phòng chống bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y (311) tr 91-94 12 Tô Long Thành (2007) Các loại vaccine cúm gia cầm đánh giá hiệu tiêm phòng Tạp chí Khoa học Thú y tr 84- 90 13 Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW (2014) Báo cáo thí nghiệm đánh giá độc lực vi 69 rút cúm H5N6 hiệu lực vắc xin với vi rút H5N1 H5N6 gà, Công văn số 164/CĐ-VR ngày 04/9/2014 gửi Cục Thú y báo cáo kết thử nghiệm hiệu lực vắc xin cúm 14 Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW (2015) Báo cáo thí nghiệm đánh giá hiệu lực vắc xin cúm gia cầm chống lại vi rút H5N6 vịt 15 Trương Văn Dung Nguyễn Viết Không (2004) Một số hoạt động nghiên cứu khoa học Viện Thú y Quốc gia bệnh Cúm gia cầm giải pháp khoa học công nghệ thời gian tới Tạp chí Khoa học Thú y tr 62 - 68 Tiếng Anh: 16 Alexander D.J., McFerran J.B., McNulty M S Horzinek M.C (1993) Orthomyxovi rút Infections”, In Viral Infections of Vertebrates, Volume 3: Viral Infections of Birds tr 287- 316 17 Beard, M Brugh RG Webster (1987) Emergence of amantadine-resistant H5N2 avian influenza vi rút during a simulated layer flock treatment program Avian diseases tr 533-537 18 Castrucci, Maria R, Kawaoka YOSHIHIRO (1993) Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A vi rút Journal of virology 67 (2) tr 759-764 19 De Vries, Erik, Hongbo Guo, Meiling Dai, Peter JM Rottier, Frank JM van Kuppeveld Cornelis AM de Haan (2015) Rapid emergence of highly pathogenic avian influenza subtypes from a subtype H5N1 hemagglutinin variant Emerging infectious diseases 21 (5) tr 842 20 E Centanni O Savonuzzi (1965) cited by Stubbs EL:" Fowl plague." Diseases of poultry 21 F Y Wong, P Phommachanh, W Kalpravidh, C Chanthavisouk, J Gilbert, J Bingham, K R Davies, J Cooke, D Eagles, S Phiphakhavong, S Shan, V Stevens, D T Williams, P Bounma, B Khambounheuang, C Morrissy, B Douangngeun S Morzaria (2015) Reassortant highly pathogenic influenza A (H5N6) vi rút in Laos 10.3201/eid2103.141488: 10.3201/eid2103.141488 Emerg Infect Dis 21 (3) tr 511-6 từ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25695754 22 Liu, Chun-Guo, Ming Liu, Fei Liu, Rang Lv, Da-Fei Liu, Lian-Dong Qu Yun Zhang (2013) Emerging multiple reassortant H5N5 avian influenza vi rútes in 70 ducks, China, 2008 Veterinary microbiology 167 (3) tr 296-306 23 Luo, Guangxiang Peter Palese (1992) Genetic analysis of influenza vi rút Current opinion in genetics & development (1) tr 77-81 24 Murphy, B R Webster (1996) Orthomyxovi rútes BN Fields, DM: Knipe, PM: Howley et al Virology 3rd edition, Raven Publishers, Philadelphia tr 1424-1429 25 Nguyen Tung, Pierre Rivailler, C Todd Davis, Amanda Balish, Nguyen Hoang Dang, Joyce Jones, Dam Thi Vui, Natosha Simpson, Ngo Thu Huong Bo Shu (2012) Evolution of highly pathogenic avian influenza (H5N1) vi rút populations in Vietnam between 2007 and 2010 Virology 432 (2) tr 405-416 26 Suarez, DL S Schultz-Cherry (2000) Immunology of avian influenza vi rút: a review Developmental & Comparative Immunology 24 (2) tr 269-283 27 T Dung Nguyen (2008) Multiple Sublineages of Influenza A Vi rút (H5N1), Vietnam, 2005− 2007-Volume 14, Number 4—April 2008-Emerging Infectious Disease journal-CDC 28 Tumpey, Terrence M, Suarez, David L , Perkins, Laura EL, Senne, Dennis A, Jaegil Lee, Youn-Jeong Lee, In-Pil Mo, Haan-Woo Sung David E Swayne (2002) Characterization of a highly pathogenic H5N1 avian influenza A vi rút isolated from duck meat Journal of virology 76 (12) tr 6344-6355 29 Wanasawaeng, Wisanu, Bunpapong, Napawan, Leelamanit, Wichet, Thanawongnuwech Roongroje (2009) Growth characteristics of the H5N1 avian influenza vi rút in chicken embryonic eggs and MDCK cells The Thai Journal of Veterinary Medicine 39 (3) tr 281-286 30 WHO (2014) WHO China statement on H5N6, Truy cập ngày Aug 25 http://www.wpro.who.int/china/mediacentre/releases/2014/20140507/en/ 71 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA ĐỀ TÀI 72 ... bệnh cúm gia cầm 29 2. 3. 1 Các loại vắc xin dùng 29 2. 3 .2 Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm giới 30 2. 3. 3 Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm việt nam 31 2. 3. 4 Những... khơng cịn phát Năm 20 14, clade subclade 2. 1 .3, 2. 2, 2. 2.1, 2. 3 .2, 2. 3. 4 clade xuất nhiều nơi giới nhiều nỗ lực thực phòng chống dịch cúm gia 23 cầm Các vi rút từ subclade 2. 3 .2 tái xuất nhiều nơi... phòng chống bệnh phù hợp Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, tiến hành đề tài: ? ?Đánh giá hiệu lực vắc xin cúm vô hoạt Navet – vifluvac (H5N1 clade 1) chống lại cúm gia cầm H5N6 clade 2. 3. 4. 4” 1 .2 MỤC