HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01 VÀ KTY-PRRS-02 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thân Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả nhận giúp đỡ tạo điều kiện nhiều người, sau lời cảm ơn chân thành tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lan người trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Nhờ có hướng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp q báu mà luận văn tơi hồn thành Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, giáo cán Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức q báu giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân gia đình quan cơng tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục… iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis Abstract x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS 12 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 12 2.2.2 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học virus PRRS 14 2.2.3 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus PRRS 19 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 23 3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 23 3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 3.4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus KTY-PRRS01, KTY-PRRS-02 24 3.4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS01, KTY-PRRS-02 24 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 iii 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.5.6 3.5.7 3.5.8 3.5.9 3.5.10 PHẦN 4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 24 Phương pháp gây nhiễm virus PRRS tế bào 25 Phương pháp xác định TCID50 26 Phương pháp xác định nhân lên virus 27 Phương pháp RT – PCR 28 Phương pháp giải trình tự gene 29 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus định lượng protein 30 Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang thỏ 31 Phương pháp IPMA 32 Phương pháp phân tích xử lý số liệu phần mềm 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM 34 4.1.1 Kết nghiên cứu xác định khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 34 4.1.2 Kết nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 37 4.1.3 Kết nghiên cứu xác định nhân lên 02 chủng virus KTYPRRS-01 KTY-PRRS-02 37 4.1.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch động vật thí nghiệm với chủng virus KTY – PRRS-01 KTY-PRRS-02 40 4.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 43 4.2.1 Kết phản ứng RT-PCR 43 4.2.2 Kết giải trình tự gene chủng virus PRRS nghiên cứu 44 4.2.3 Kết truy cập ngân hàng gene 45 4.2.4 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide chủng virus nghiên cứu 57 4.2.5 So sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu 59 4.2.6 Kết xây dựng sinh học phân tử chủng virus nghiên cứu 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 5.1 KẾT LUẬN 65 5.2 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 73 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men tế bào lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ số lượng virus số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Protein cấu trúc PRRSV 14 Bảng 3.1 Thông tin nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTYPRRS-02 23 Bảng 4.1 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 34 Bảng 4.2 Kết xác định hiệu giá 03 chủng virus KTY-PRRS-01, KTYPRRS-02 chủng virus vắc-xin 37 Bảng 4.3 Kết tinh chế kháng nguyên virus PRRS 40 Bảng 4.4 Kết phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Bảng 4.5 PRRSV thời điểm 14 ngày sau tiêm kháng nguyên PRRS lần 41 Kết phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Bảng 4.6 PRRSV chuột thỏ thí nghiệm 42 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 chủngvirus Bảng 4.7 nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 47 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 chủng virus Bảng 4.8 nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 50 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 chủng Bảng 4.9 virus PRRS nghiên cứu chủng virus tham chiếu 55 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu chủng virus tham chiếu 56 Bảng 4.10 Sự tương đồng trình tự nucleotide gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%) 57 Bảng 4.11 Sự tương đồng trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%) 58 Bảng 4.12 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%) 59 Bảng 4.13 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%) 60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái virus PRRS 12 Hình 2.2 Hình 4.1 Hình ảnh cấu trúc hệ gene virus PRRS 13 Tế bào Marc 145 không gây nhiễm virus 36 Hình 4.2 Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 36 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 36 Bệnh tích tế bào sau 48 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 36 Hình 4.4 Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 60 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 36 Bệnh tích tế bào sau 72 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 36 Hình 4.6 Hình 4.7 Bệnh tích tế bào sau 84 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 36 Hình biểu diễn nhân lên chủng virus KTY-PRRS-01 38 Hình 4.8 Hình 4.9 Hình biểu diễn nhân lên chủng virus KTY-PRRS-02 38 Đối chứng tế bào 42 Hình 4.10 Phản ứng IPMA dương tính 42 Hình 4.11 Kết phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) ORF5 (hình B) 44 Hình 4.12 Kết so sánh trình tự gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu 46 Hình 4.13 Kết so sánh trình tự gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 50 Hình 4.14 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu chủng tham chiếu 53 Hình 4.15 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu chủng tham chiếu 54 Hình 4.16 Cây sinh học phân tử dựa trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu 62 Hình 4.17 Cây sinh học phân tử dựa trình tự nucleotide gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu 64 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Tên Luận văn: “Nghiên cứu số đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02” Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Mục đích luận văn nhằm chọn chủng virus PRRS tiềm có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ nghiên cứu chuyên sâu như:sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng phịng, trị PRRS; cơng cường độc để đánh giá hiệu vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu virus phân lập biến chủng dùng dịch tễ học phân tử Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTYPRRS-02 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 Máy PCR, thiết bị điện di, máy giải trình tự gene Môi trường nuôi cấy tế bào, tế bào Marc 145, kít tách chiết RNA, kít RT-PCR, kít giải trình tự gene, kit BCA Để kiểm tra đặc tính sinh học virus cần sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào, gây nhiễm virus lên môi trường tế bào, xác định hiệu giá virus, xác định đường cong sinh trưởng virus môi trường tế bào, nghiên cứu tính kháng nguyên virus chuột thỏ, kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp IPMA Phương pháp RT-PCR để xác định có mặt virus Giải trình tự gene để xác định đặc điểm sinh học phân tử virus Kết kết luận: - Kết nghiên cứu đặc tính sinh học chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02: Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 36 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01và chủng KTY-PRRS-02 Bệnh tích tế bào biểu tế bào co cụm lại với chồi lên đáy bình Chủng virus KTY-PRRS-01, CPE đạt 100% 84 Chủng virus KTY-PRRS-02, CPE đạt 100% 72 Quy luật nhân lên chủng virus nghiên cứu mơi trường tế bào giống Virus giải phóng ngồi tế bào có hiệu giá cao virus tế bào Hiệu giá virus tương đối viii cao chủng KTY-PRRS-01 (1,74x106 TCID50/25µl) KTY-PRRS-02 (3,16 x106 TCID50/25µl), thời điểm hiệu giá virus đạt cao khoảng 60 đến 84 sau gây nhiễm Chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 có khả gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm - Kết nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS01 KTY-PRRS-02: Đoạn gene ORF5 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 amino acid Glycoprotein (GP5) Đoạn gene ORF7 có kích thước 372 bp mã hóa cho 123 amino acid protein N Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 ORF5 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ 98,58% 98,03% Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ 92,93%-99,65% 85,12%-99,42% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 02 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ 96,32% 95,04% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động 82,88%-98,80% 84,36%-98,80% Hai chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 có nhánh với chủng độc lực cao Trung Quốc thuộc PRRS type (Bắc Mỹ) ix gene ORF5 số chủng virus phân lập miền Bắc Việt Nam từ năm 2011-2013 mức độ tương đồng nucleotide chủng virus nghiên cứu với chủng JXA1 cao, khoảng 97,6%-99% mức độ tương đồng với chủng VR2332 thấp hơn, khoảng 88,2%-89,2% Các chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 số chủng virus nghiên cứu có tính tương đồng nucleotide với chủng Trung Quốc cao chủng VR-2332 đại diện đặc trưng dòng Bắc Mỹ, điều phù hợp với tác giả Zhou et al (2008) Feng et al (2008) phân tích gene độc lực gây PRRS xuất năm 2006-2008 Trung Quốc Việt Nam 4.2.5 So sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu Ngoài việc so sánh trình tự nucleotide, nghiên cứu cịn sử dụng phần mềm MEGA6 để phân tích tương đồng trình tự amino acid chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu Dựa mã hóa nên amino acid tương ứng từ gene ORF7 gene ORF5, phần mềm phân tích kết trình bày bảng 4.12, bảng 4.13 Bảng 4.12 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%) KTY-PRRS-01 KTY- KTY- JQ860392/ PRRS01 PRRS02 Vietnam/ 2008/DN444 JQ860414/ EF112445/ U87392/USA Vietnam/2012 China/2006 /1990/ / / ATCC_VRCT.C1 JXA1 2332 100,00 KTY-PRRS-02 JQ860392/Vietna 96,32 100,00 m/2008/DN444 JQ860414/Vietna 98,78 95,07 100,00 m/2012/CT.C1 EF112445/China/ 96,30 92,52 95,05 100,00 2006/JXA1 U87392/USA/1990/ ATCC_VR-2332 97,55 98,80 96,32 93,79 100,00 84,20 82,88 85,59 79,92 84,26 59 100,00 Bảng 4.13 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%) KTYPRRS-01 KTYPRRS02 JQ860414/ EF112445/ U87392/USA JQ860392/ Vietnam/2012 China/2006 /1990/ Vietnam/ / / ATCC_VR2008/DN444 CT.C1 JXA1 2332 100,00 95,04 100,00 94,39 98,20 100,00 2012/CT.C1 95,04 98,80 99,40 100,00 EF112445/China/ 2006/JXA1 96,31 98,80 98,19 98,80 100,00 U87392/USA/1990/ ATCC_VR-2332 84,36 87,40 88,10 88,81 87,34 KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 JQ860392/Vietnam/ 2008/DN444 JQ860414/Vietnam/ 100,00 Mức độ tương đồng trình tự amino acid tương ứng gene ORF7 hai chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 cao đạt 96,32%-100% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF5 đạt tỷ lệ cao 95,04%-100,0% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động 82,88%-98,80% 84,36%-98,80% Cụ thể, mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng virus KTYPRRS-01 với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ 84,20%-98,87% 84,36%-96,31% Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng virus KTY-PRRS-02 với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ 82,88%-98,80% 87,40%-98,80% Khi so sánh chủng virus nghiên cứu với chủng virus PRRS độc lực cao phân lập Trung Quốc, đại diện chủng virus JXA1, mức độ tương đồng trình tự amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 cao 97,55% - 98,80% 96,31%98,80% So sánh chủng virus nghiên cứu với chủng virus VR2332 mức độ tương đồng trình tự amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 dao động khoảng 82,88%-84,20% 84,36%-87,40% ORF5 gene mã hóa cho glycoprotein xuất phần lớn bề mặt virus PRRS 60 Trình tự protein GP5 dự đốn có chứa vùng trình tự tín hiệu (từ amino acid 1-32), vùng trình tự ectodomain ngắn (từ amino acid32-64 amino acid 89109) vùng trình tự endodomain (từ amino acid 110-200) (Li and Murtaugh, 2012; Kim et al., 2014) Nghiên cứu mức độ tương đồng gene ORF5 cho thấy, chủng virus PRRS lưu hành Việt Nam có mức độ tương đồng cao với chủng Trung Quốc (Metwally, 2010) Nghiên cứu trình tự đoạn gene ORF7 ORF5 02 chủng virus nghiên cứu cho thấy sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid mã hóa protein N protein GP5 Đây protein đóng vai trị quan trọng việc xâm nhiễm virus PRRS vào tế bào kí chủ có chứa số epitop quan trọng việc tạo đáp ứng miễn dịch lợn (Gonin et al.,1999) 4.2.6 Kết xây dựng sinh học phân tử chủng virus nghiên cứu 4.2.6.1 Kết xây dựng phả hệ gene ORF5 Từ trình tự gene ORF5 02 chủng virus PRRS nghiên cứu, xây dựng sinh học phân tử thể mối quan hệ di truyền chủng nghiên cứu với với số chủng virus PRRS tham chiếu Các chủng có đặc điểm di truyền đại diện cho chủng lưu hành Việt Nam Kết phân tích nguồn gốc phát sinh chủng PRRS nghiên cứu dựa sai khác nucleotide amino acid đoạn gene ORF5 thể hình 4.16 Từ kết phân tích nguồn gốc phát sinh lồi theo sai khác nucleotide gene ORF5 hình 4.16 cho thấy: chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS02 mà nghiên cứu nằm nhánh phát sinh Trong chủng KTY-PRRS-01 nằm nhánh phát sinh với chủng JF748717/China/2009/YD; chủng KTY-PRRS-02 nằm nhánh phát sinh với chủng JQ860371/Vietnam/2008/DN153 61 91 JQ860362/Vietnam/2008/DN444 JQ860368/Vietnam/2009/DN44 JQ860388/Vietnam/2012/DT8 42 AB588636/Vietnam/2010/347-T-KS JQ860382/Vietnam/2012/CT.C1 90 97 JQ860386/Vietnam/2012/CT.HS3 JN157760/China/2011/JilinTN1 JF748718/China/2010/DC 57 EU880436/China/2008/XL2008 Sublineage 8.7 KTY PRRS 02 69 JQ860371/Vietnam/2008/DN153 45 Lineage EF112445/China/2006/JXA1 KTY PRRS 01 60 9958 JF748717/China/2009/YD FJ536165/China/2004/NB/04 85 EU148495/China/2007/Yizheng/06 AY032626/China/1995/CH-1a 54 EF532801/USA/2004/INGELVAC ATP 99 Sublineage 8.9 AF176441/USA/1999/PRRSV19 AY656993/USA/2005/SDSU73 Sublineage 8.5 24 AF176476/USA/2000/PRRSV55 Sublineage 8.1 26 AF339494/USA/2001/98-31701-1 Sublineage 8.3 19 AF176462/USA/1999/PRRSV40 41 Lineage AF176466/USA/1999/PRRSV44 Lineage EU556160/USA/2008/2000-5424 11 GU187014/Singapore/2009/BCL-PS 100 95 DQ478179/USA/2006/PRRSV0004283 Lineage U87392/USA/1990/ATCC VR-2332 29 24 U66380/USA/1996/34075-NE Lineage EU758777/USA/2008/PRRSV0000008765 73 11 97 EU759139/USA/2008/PRRSV0000009234 Lineage DQ779791/USA/1998/Prime-Pac AF121131/Taiw an/1997/MD-001 24 Lineage EU273667/Taiw an/2007/TY1 77 94 EU273687/Taiw an/2007/NT8 AB546105/Japan/2008/Miyagi08-2 13 84 AB175721/Japan/2004/Gu922M EU758940/USA/2007/PRRSV0000008973 DQ475573/USA/2006/PRRSV0001028 77 Lineage AB175720/Japan/2004/EDRD-8 47 94 Lineage EU757121/USA/2008/PRRSV0000006493 AY297118/Thailand/2002/02SP3 Lineage EU757423/USA/2008/PRRSV0000006843 DQ475450/USA/2006/PRRSV0000874 M96262/Netherlands/1991/Lelystad virus PRRS type 0.2 Hình 4.16 Cây sinh học phân tử dựa trình tự nucleotide gene ORF5 chủng virus PRRS nghiên cứu Hai chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm nhánh phát sinh có chủng virus vắc-xin EF112445/China/2006/JXA1 chủng độc lực cao phân lập Trung Quốc: năm 2008, 2009, 2010, 2011, 2014, chủng virus phân lập Việt Nam từ năm 2008 – năm 2012 thuộc sublineage 8.7 62 thuộc lineage Hai chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm khác với line từ thuộc PRRS type (Bắc Mỹ), khác với nhánh phát sinh chủng PRRS type (Châu Âu) Kết phân tích phả hệ chủng virus PRRS phân lập từ năm 2011-2013 miền Bắc Việt Nam tác giả Đỗ Hải Quỳnh cs (2016) cho thấy chủng virus thuộc dòng (type) Bắc Mỹ, nhánh (sub-lineage) 8.7 Như thấy, kết nghiên cứu mối quan hệ di truyền 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 tương tự với chủng virus PRRS nghiên cứu tác giả 4.2.6.2 Kết xây dựng phả hệ gene ORF7 Trong phân tích mối quan hệ di truyền dịch tễ học phân tử virus PRRS ngồi phân tích trình tự gene ORF5, nghiên cứu giới phân tích trình tự gene ORF7 protein màng sản sinh kháng thể trung hòa lớn virus PRRS Nghiên cứu sinh học phân tử ORF7 khơng phục vụ mục đích chẩn đốn mà cịn góp phần tìm hiểu đặc tính phân tử virus PRRS Chính dựa trình tự gene ORF7, xây dựng sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 Kết dựng sinh học phân tử thể hình 4.17 Từ kết phân tích nguồn gốc phát sinh lồi theo sai khác nucleotide gene ORF7 hình 4.17 cho thấy: chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nghiên cứu nằm nhánh phát sinh Trong chủng KTY-PRRS-01 nằm nhánh phát sinh với chủng phân lập Việt Nam từ năm 2008 – 2012 chủng JQ860392/Vietnam/2008/DN444, JQ860400/Vietnam/2009/DN59, JQ860414/Vietnam/2012/CT.C1; chủng KTY-PRRS-02 nằm nhánh phát sinh với chủng vắc-xin Trung Quốc EF112445/China/2006/JXA1; chủng Trung Quốc độc lực cao JF268680/China/2009/09 HEN2 chủng JF268682/China/2009/09 HUB1 số chủng phân lập Việt Nam năm 2008 JQ860395/Vietnam/2008/DN460 JQ860403/Vietnam/2008/DN153 Hai chủng KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm nhánh phát sinh có chủng vắc-xin JXA1 63 JQ860407/Vietnam/2009/DN1155 JQ860409/Vietnam/2010/DN5.2 JQ860405/Vietnam/2009/DN339 78 JQ860402/Vietnam/2009/DN88 JQ860400/Vietnam/2009/DN59 46 JQ860392/Vietnam/2008/DN444 JQ860397/Vietnam/2008/DN694 65 JQ860419/Vietnam/2012/DT7 KTY-PRRS-01 JQ860414/Vietnam/2012/CT.C1 48 99 35 JQ860415/Vietnam/2012/CT.C2 Lineage JQ860417/Vietnam/2012/CT.HS2 JF268680/china/2009/09HEN2 JF268682/china/2009/09HUB1 39 EF112445/China/2006/JXA1 KTY-PRRS-02 58 JQ860395/Vietnam/2008/DN460 JQ860403/Vietnam/2008/DN153 91 GU232735/china/2008/KP KM659201/Vietnam/2012/DB2012-2DB 99 KM659202/Vietnam/2012/DB2012-9DB D45852/Japan/1995/EDRD-1 33 AY209222/USA/2003/27E Li neage AF066183/USA/2005/RespPRRS vaccine 3942 57 U87392/USA/1990/ATCC VR-2332 EF441853/Korea/2006/06K805 Lineage EF441809/Korea/2006/05K205 AY032626/China/1996/CH-1a 76 EU262603/china/2007/EM2007 M96262/Holand/1991/Lelystad PRRS type 0.1 Hình 4.17 Cây sinh học phân tử dựa trình tự nucleotide gene ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu Hai chủng KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 nằm line khác line thuộc PRRS type (Bắc Mỹ), khác với nhánh phát sinh chủng PRRS type (châu Âu) Kết luận: Hai chủng nhánh với chủng độc lực cao Trung Quốc thuộc PRRS type (Bắc Mỹ) Điều chứng tỏ có lây truyền bệnh qua biên giới quốc gia giới 64 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Kết nghiên cứu đặc tính sinh học 02 chủng virus KTYPRRS-01 virus KTY-PRRS-02: - 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 thích nghi tốt gây bệnh tích tế bào môi trường tế bào Marc 145 - Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 36 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01và chủng KTY-PRRS-02 CPE đạt 100% 84 bong tróc hồn tồn 96 sau gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-01 CPE đạt 85% 60 100% 72 sau gây nhiễm chủng virus KTYPRRS-02 Cả chủng virus PRRS nghiên cứu chủng virus PRRS vắc-xin có quy luật nhân lên mơi trường tế bào giống Virus giải phóng ngồi tế bào có hiệu giá cao virus tế bào Thời điểm hiệu giá virus đạt cao xác định khoảng 60 đến 84 sau gây nhiễm - Cả chủng virus PRRS nghiên cứu có khả gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm 2) Kết nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02: - Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 ORF5 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ cao 98,58% 98,03% - Mức độ tương đồng nucleotide gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ 92,93%99,65% 85,12%-99,42% - Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 02 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ cao 96,32% 95,04% - Mức độ tương đồng amino acid tương ứng gene ORF7 gene ORF5 chủng PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động 82,88%-98,80% 84,36%-98,80% Điều cho thấy tương đồng kết so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide trình tự amino acid - Hai chủng virus KTY-PRRS-01và KTY-PRRS-02 có nhánh phát sinh với chủng độc lực cao Trung Quốc thuộc PRRS type (Bắc Mỹ) 65 5.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành nghiên cứu sâu ổn định đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 để lựa chọn chủng tiềm phục vụ cho việc như: chọn chủng giống gốc để sản xuất vắc-xin PRRS, đánh giá hiệu lực loại vắc-xin, chế phẩm sinh học kít chẩn đốn nhanh, kháng ngun dùng chẩn đốn,… nhằm phịng, trị PRRS 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Cục Thú y (2008) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) Báo cáo Hội thảo khoa học phịng chống hội chứng Rối loạn hơ hấp sinh sản lợn, ngày 21/5/2008, Hà Nội Đỗ Hải Quỳnh, Vũ Thị Thu Hằng, Thân Đức Dương, Nguyễn Bá Hiên Lê Văn Phan (2016) Đa dạng di truyền gen ORF5 số chủng virus PRRS phân lập từ năm 2011 đến năm 2013 miền Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập XXIII (1) tr 29-38 Đỗ Tiến Duy Nguyễn Tất Toàn (2016) So sánh tương đồng gen chủng PRRSV độc lực cao thu thập thực đại với chủng vacxin thương mại Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XXIII (3) tr 15-25 Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007) Một số hiểu biết virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam, Trịnh Đình Thâu, Phạm Hồng Ngân, Phạm Ngọc Thạch, Lê Huỳnh Thanh Phương, Chu Đức Thắng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Bá Tiếp (2015) Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phịng hội chứng rối loạn hơ hấp sinh sản lợn Đề tài cấp Nhà nước Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan (2007) Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản bệnh liên cầu khuẩn lợn, ngày 11/10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Ngọc Tiến (2011) Báo cáo tình hình dịch bệnh tai xanh (PRRS) Việt Nam cơng tác phịng chống dịch Truy cập ngày 2/5/2016 http://text.123doc.org/document/1237638-bao-cao-tinh-hinh-dich-lon-tai-xanh-prrso-viet-nam-va-cong-tac-phong-chong-dich-pot.htm Nguyễn Thị Lan Lương Quốc Hưng (2012) Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) phân lập đàn lợn nuôi số tỉnh phía Bắc, Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, kỳ 2, tháng 7/2012 tr 82-87 Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Bá Hiên, Trịnh Đình Thâu, Cao Thị Bích Phượng Lê Văn Hùng (2016) So sánh số đặc tính sinh học chủng virus PRRS phân lập Việt Nam (KTY-PRRS-04) qua đời cấy truyền Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XXIII (6) tr 5-13 67 10 Nguyễn Thị Thu Hằng, Lê Quang Hòa, Trần Thị Thanh Hà, Trần Thị Thu Hằng Nguyễn Viết Không (2016) Một số đặc điểm sinh học phân tử virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) phân lập Việt Nam từ ổ dịch năm 2007, 2010, 2013 Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XXIII (3) tr 26-34 11 Tiêu Quang An (2012) Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lí lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS), sử dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để phát virus Luận án Tiến sỹ, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội 12 Trịnh Đình Thâu, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Nguyễn Hữu Nam, Lê Huỳnh Thanh Phương, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Văn Thọ, Phạm Ngọc Thạch Phạm Hồng Ngân (2016) Nghiên cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin phịng hội chứng rối loạn hơ hấp & sinh sản cho lợn (PRRS) Việt Nam Đề tài cấp Nhà nước Tiếng Anh: 13 Benson J E., M J Yaeger, J Christopher-Hennings, K Lager and K.-J Yoon (2002) A comparison of virus isolation, immunohistochemistry, fetal serology, and reverse-transcription polymerase chain reaction assay for the identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus transplacental infection in the fetus Journal of veterinary diagnostic investigation Vol 14 (1) pp 8-14 14 Chia M.-Y., S.-H Hsiao, H.-T Chan, Y.-Y Do, P.-L Huang, H.-W Chang, Y.-C Tsai, C.-M Lin, V F Pang and C.-R Jeng (2010) Immunogenicity of recombinant GP5 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco plant Veterinary immunology and immunopathology Vol 135 (3) pp 234-242 15 Chiou M.-T., C.-R Jeng, L.-L Chueh, C.-H Cheng and V F Pang (2000) Effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (isolate tw91) on porcine alveolar macrophages in vitro Veterinary microbiology Vol 71 (1) pp 9-25 16 Collins J E., D A Benfield, W T Christianson, L Harris, J C Hennings, D P Shaw, S M Goyal, S McCullough, R B Morrison and H S Joo (1992) Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs Journal of Veterinary Diagnostic Investigation Vol (2) pp 117-126 17 De Abin M F., G Spronk, M Wagner, M Fitzsimmons, J E Abrahante and M P Murtaugh (2009) Comparative infection efficiency of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates on MA104 cells and porcine alveolar 68 macrophages Canadian Journal of Veterinary Research Vol 73 (3) pp 200-204 18 Fang L., Y Jiang, S Xiao, C Niu, H Zhang and H Chen (2006) Enhanced immunogenicity of the modified GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virus Genes Vol 32 (1) pp 5-11 19 Feng Y., T Zhao, T Nguyen, K Inui, Y Ma, T H Nguyen, V C Nguyen, D Liu, Q A Bui and L T To (2008) Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007 Emerg Infect Dis Vol 14 (11) pp 17746 20 Grebennikova T.V., Syroeshkin A.V, Musienko M.I, Zaberezhny A.D., Aliper T.I (2005) Changes of microelement content in Marc-145 cells before and after infection with virulent and attenuated strains of PRRS virus 2005 International PRRS Symposium Westport Conference Center, St Louis, Missouri December 23, 2005 21 Han J., G Liu, Y Wang and K S Faaberg (2007) Identification of nonessential regions of the nsp2 replicase protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain VR-2332 for replication in cell culture Journal of virology Vol 81 (18) pp 9878-9890 22 Han, J., M.S Rutherford, and K.S Faaberg (2010) Proteolytic products of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp2 replicase protein Journal of virology, 2010 84(19): p 10102-10112 23 Harel S., M A Salan and J Kanner (1988) Iron release from metmyoglobin, methaemoglobin and cytochrome c by a system generating hydrogen peroxide Free radical research communications Vol (1) pp 11-19 24 Jaffe, E.R (1981) Methaemoglobinaemia Clin Haematol 10: 99-122 25 Keffaber K (1989) Reproductive failure of unknown etiol-ogy Am Assoc Swine Pract Newsl Vol pp 1-9 26 Keirstead N D., C Lee, D Yoo, A S Brooks and M A Hayes (2008) Porcine plasma ficolin binds and reduces infectivity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in vitro Antiviral research Vol 77 (1) pp 28-38 27 Kim H., J Kwang, I Yoon, H Joo and M Frey (1993) Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line Archives of virology Vol 133 (3-4) pp 477-483 28 Kim H K., H J Moon, S J Park, H C Chung, M K Choi, A R Kim and B K Park (2014) ORF5-based evolutionary and epidemiological dynamics of the type 69 porcine reproductive and respiratory syndrome virus circulating in Korea Infection, Genetics and Evolution Vol 21 pp 320-328 29 Kim W.-I., J.-J Kim, S.-H Cha, W.-H Wu, V Cooper, R Evans, E.-J Choi and K.-J Yoon (2013) Significance of genetic variation of PRRSV ORF5 in virus neutralization and molecular determinants corresponding to cross neutralization among PRRS viruses Veterinary microbiology Vol 162 (1) pp 10-22 30 Kreutz, L (1998) Cellular membrane factors are the major determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus tropism Virus research 53(2): pp 121-128 31 Kwon B., I H Ansari, F A Osorio and A K Pattnaik (2006) Infectious clonederived viruses from virulent and vaccine strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus mimic biological properties of their parental viruses in a pregnant sow model Vaccine Vol 24 (49) pp 7071-7080 32 Lee, C and D Yoo (2006) The small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus possesses ion channel protein-like properties Virology 355(1): pp 30-43 33 Leng X., Z Li, M Xia, Y He and H Wu (2012) Evaluation of the efficacy of an attenuated live vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in young pigs Clinical and Vaccine Immunology Vol 19 (8) pp 1199-1206 34 Li G., J Huang, P Jiang, Y Li, W Jiang and X Wang (2007) Suppression of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication in MARC-145 cells by shRNA targeting ORF1 region Virus Genes Vol 35 (3) pp 673-679 35 Lou S C., C Patel, S Ching and J Gordon (1993) One-step competitive immunochromatographic assay for semiquantitative determination of lipoprotein (a) in plasma Clinical chemistry Vol 39 (4) pp 619-624 36 Meng X.-J., P S Paul, P G Halbur and M A Lum (1995) Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe Archives of virology Vol 140 (4) pp 745-755 37 Metwally S., F Mohamed, K Faaberg, T Burrage, M Prarat, K Moran, A Bracht, G Mayr, M Berninger and L Koster (2010) Pathogenicity and molecular characterization of emerging porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Vietnam in 2007 Transboundary and emerging diseases Vol 57 (5) pp 315- 70 329 38 Murtaugh M., M Elam and L Kakach (1995) Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus Archives of virology Vol 140 (8) pp 1451-1460 39 Nelsen C J., M P Murtaugh and K S Faaberg (1999) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents Journal of virology Vol 73 (1) pp 270-280 40 Nelson E., J Christopher-Hennings, T Drew, G Wensvoort, J Collins and D Benfield (1993) Differentiation of US and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies Journal of Clinical Microbiology Vol 31 (12) pp 3184-3189 41 Neumann E J., J B Kliebenstein, C D Johnson, J W Mabry, E J Bush, A H Seitzinger, A L Green and J J Zimmerman (2005) Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States Journal of the American Veterinary Medical Association Vol 227 (3) pp 385-392 42 Prieto C (2010) PRRS vaccine development, EuroPRRS2010, COST Action FA0902, Understanding and combating porcine reproductive and respiratory syndrome in Europe 43 Shi M., T T.-Y Lam, C.-C Hon, R K.-H Hui, K S Faaberg, T Wennblom, M P Murtaugh, T Stadejek and F C.-C Leung (2010) Molecular epidemiology of PRRSV: a phylogenetic perspective Virus research Vol 154 (1) pp 7-17 44 Terpstra C., G Wensvoort and J Pol (1991) Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad vims: Koch's postulates fulfilled Veterinary Quarterly Vol 13 (3) pp 131-136 45 Thanawongnuwech R., B Thacker, P Halbur and E L Thacker (2004) Increased production of proinflammatory cytokines following infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae Clinical and diagnostic laboratory immunology Vol 11 (5) pp 901-908 46 Tian K., X Yu, T Zhao, Y Feng, Z Cao, C Wang, Y Hu, X Chen, D Hu and X Tian (2007) Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS one Vol (6) pp e526 47 Tsai, Y.-C (2012) The effect of infection order of porcine circovirus type and 71 porcine reproductive and respiratory syndrome virus on dually infected swine alveolar macrophages BMC veterinary research, 8(1): p 48 Valicek, L (1997) Isolation and identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in cell cultures Veterinarni medicina, 42(10): p 281287 49 Yu X., Z Zhou, Z Cao, J Wu, Z Zhang, B Xu, C Wang, D Hu, X Deng and W Han (2015) Assessment of the safety and efficacy of an attenuated live vaccine based on highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) Clinical and Vaccine Immunology Vol pp CVI 00722-14 50 Zhang M., J Xie, L Sun, Z Cao, H Gu, S Deng, Y Chen, Z Cao, F Tang and S Su (2013) Phylogenetic analysis and molecular characteristics of 17 porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in Southern China from 2010 to 2011 Microbial pathogenesis Vol 65 pp 67-72 51 Zhou Y J., X F Hao, Z J Tian, G Z Tong, D Yoo, T Q An, T Zhou, G X Li, H J Qiu and T C Wei (2008) Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China Transboundary and emerging 72 PHỤ LỤC Đề tài: “Nghiên cứu số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02” Phụ lục Bảng kết biểu diễn quy luật nhân lên chủng KTY-PRRS-01 môi trường tế bào Marc 145 24hp i Virus tế bào (KTY-PRRS-01) 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi 2.83 3.83 3.5 5.16 5.5 3.83 3.5 5.5 5.83 4.83 4.5 Virus dịch tế bào (KTY-PRRS01) 2.5 Virus tế bào (vắc-xin JXA1) 1.5 3.16 5.5 4.16 3.83 2.83 2.83 2.83 3.83 5.5 4.83 5.16 4.16 3.83 Virus dịch tế bào (vắc-xin JXA1) 3.5 4.5 Phụ lục Bảng kết biểu diễn quy luật nhân lên chủng KTY-PRRS-02 môi trường tế bào Marc 145 24hpi Virus tế bào (KTY-PRRS-02) Virus dịch tế bào(KTY-PRRS-02) 2.5 2.16 Virus tế bào (vắc-xin JXA1) Virus dịch tế bào (vắc-xin JXA1) 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi 3.5 4.16 5.5 4.83 3.83 3.5 4.83 5.83 4.5 5.16 3.5 4.5 1.5 3.16 5.5 4.16 3.83 2.83 2.83 2.83 3.83 5.5 4.83 5.16 4.16 3.83 73 ... học phân tử Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus KTY- PRRS- 01, KTYPRRS -02 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY- PRRS- 01, KTY- PRRS- 02 Máy... Xác định số đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY- PRRS- 01, KTY- PRRS- 02 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 02 chủng virus KTY- PRRS- 01, KTY- PRRS- 02 Khoa Thú y – Học viện Nông... pháp IPMA 3.4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY- PRRS0 1, KTY- PRRS- 02 - Giải trình tự gene chủng virus KTY- PRRS- 01, KTY- PRRS- 02 - Xây dựng sinh học phân tử cho thấy mối