Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Loài Địa Y Parmotrema Sancti-Angelii

KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y

Định nghĩa và phân loại

Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, hình thành từ sự cộng sinh giữa nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp, thường là tảo (green alga) hoặc vi khuẩn lam (cyanobacterium).

Khoảng 17 000 loài địa y đã được biết Địa y thường được chia làm ba dạng: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose) [30]

Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y

Địa y là sự kết hợp giữa tảo và nấm, trong đó tảo sản sinh carbohydrate qua quang hợp, còn nấm tạo ra các hợp chất tự nhiên để chống lại tia UV, sâu bọ và động vật ăn cỏ, đồng thời cung cấp nước và khoáng chất Sự cộng sinh này giúp địa y phát triển và tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt, đặc biệt ở vùng vĩ độ cao và vùng nhiệt đới, và chúng có thể xuất hiện trên nhiều bề mặt như đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại và thủy tinh Để tìm hiểu về bản chất và nguồn gốc của địa y, các nhà thực vật học đã cố gắng tổng hợp chúng từ tảo và nấm, nhưng việc kết hợp hai thành phần này vẫn gặp nhiều khó khăn.

Hoạt tính các hợp chất trong địa y

Địa y sản sinh ra nhiều hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học, nhưng việc nghiên cứu hóa học trên địa y gặp khó khăn do nguồn cung hạn chế và tốc độ phát triển chậm Nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm chỉ thành công khoảng 10%, và các hợp chất hữu cơ thu được từ quá trình này khác biệt so với các hợp chất trong địa y tự nhiên.

Đến nay, gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập, với nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên này Các tài liệu thống kê từ Huneck (1999), Muller (2001) và Boustie (2007) đã chỉ ra rằng các hợp chất địa y có khả năng kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm và kháng enzyme.

1.1.2.1 Hoạt tính đối với động vật [30]

Caperatic acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và

Xanthoparmelia cumberlanda kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia

Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis

Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, evernic acid, psoromic acid, physodic acid, 3-hydroxyphysodic acid, fumarprotocetraric acid, stictic acid, norstictic acid, salazinic acid, vulpinic acid, rhizocarpic acid, and usnic acid inhibit the growth of the polyphagous larva Spodoptera littoralis without affecting their survival.

1.1.2.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [30]

Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính

Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic, acid diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid β-orcinolcarboxylic, acid orsellinic Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật

Acid evernic Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina

Acid lecanoric Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây Allium cepa

Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật

Các quinone từ Pyxine spp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây

Usnic acid Ức chế sự nảy mầm và phát triển của

1.1.2.3 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus

Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus, trong khi hypericin cho thấy khả năng đáng kể trong việc chống lại sự sao chép ngược của virus HIV Các hợp chất như 7,7’-dichlorohypericin và 5,7-dichloroemodin thể hiện hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1, với hoạt tính tăng theo số lượng nguyên tử Cl trong cấu trúc Depside và depsidone có khả năng ức chế sự sao chép của virus HIV thông qua enzyme integrase, với depsidone có cấu trúc vòng 11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-one được cho là nguyên nhân chính Mặc dù depside có hoạt tính yếu, nhưng các β-depsidone như virensic acid, granulatine, stictic acid và chloroparellic acid cho thấy hoạt tính tương đương với giá trị IC50 khoảng 3 µM Một số β-depsidone khác như physodic acid, norlobaric acid, salarinic acid và parellic acid cũng có hoạt tính với giá trị IC50 khoảng vài µM.

3 có hoạt tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự nhân bản DNA của virus HIV với giỏ trị IC50 khoảng 24 àM (Bảng 1.2) [23]

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus Hợp chất Virus và enzyme của virus

Depsidone: virensic acid và dẫn xuất tương tự

Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV

Butyrolactone acid: protolichesterinic acid Nhân bản của HIV

(+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro-1-O- methylemodin, 5,7-dichloroemodin, hypericin

HIV, cytomegalovirus và các virus khác

1.1.2.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm [30]

Các hợp chất từ địa y có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả, trong đó acid protolichesterinic được thử nghiệm in vitro cho thấy khả năng kháng Helicobacter pylori, và là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày Nhiều hợp chất địa y như alectosarmentin, pannarin, chloropannarin, emodin, physcion, evernic acid, leprapinic acid, các hợp chất phenol đơn vòng, puvinic acid, usnic acid và các dẫn xuất của chúng có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm Khả năng kháng nấm của các hợp chất này được đánh giá qua giá trị MIC, với parietin, fallacinal, và emodin là những ví dụ tiêu biểu Đặc biệt, usnic acid và các dẫn xuất của nó thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ trên nhiều dòng vi khuẩn khác nhau.

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm [30]

Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,

Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum

Methyl orsellinate, ethyl orsellinate, methyl β-orsellinate, methyl haematommate

Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M gypseum,

Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans

Pulvinic acid và dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata

Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

1.1.2.5 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến

Usnic acid, một hợp chất có nguồn gốc từ địa y, đã được chứng minh có khả năng gây độc tế bào mạnh mẽ Khả năng kháng u của usnic acid đã được khám phá cách đây 30 năm, với thử nghiệm đầu tiên được thực hiện trên hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan.

Kopperman [23] Những nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính cấu trúc cũng được khảo

Nghiên cứu cho thấy tính thân dầu (lipophilicity) có vai trò quan trọng trong khả năng gây độc tế bào Cấu trúc của acid usnic với hai liên kết hydrogen nội phân tử đã làm tăng tính thân dầu tự nhiên của hợp chất này.

Depside và depsidone cho thấy độc tính tế bào tương đối, với depsidone lobaric acid và depside baeomyceic acid có khả năng ức chế sự phát triển của 14 dòng tế bào ung thư, với giá trị IC50 từ 12-65 µg/ml Ngoài ra, depsidone pannarin và depside sphaerophin cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU-145 và tế bào ung thư da M14, với IC50 trong khoảng 25-30 µg/ml.

Bảng 1.4 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến [23] [30]

Hợp chất Hoạt tính trên loại tế bào

(-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCaT

Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich

Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào

Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa

Scabrosin ester và dẫn xuất, euplectin Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác

Hydrocarpone, salazinic acid, stitic acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột

Psoromic acid, chrysophanol và emodin cùng các dẫn xuất của chúng cho thấy hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu Bên cạnh đó, một số hợp chất cũng có khả năng ức chế enzyme như được trình bày trong bảng 1.5.

Bảng 1.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y [23]

Hợp chất của địa y Enzyme bịức chế

Bis-(2,4-dihydroxy-6-n- propylphenyl)methane, divarinol, cao chiết từ

Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và

Confluentic acid, 2β-O-methylperlatolic acid Monoaminoxidase B

(+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược

NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA

(+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập bởi David F và cộng sự [6]

Lecanoric acid (14) và stictic acid (18) được cô lập từ Parmelia praesorediosa

(Nyl.) bởi Ramesh P và cộng sự [26]

Huỳnh B L Chi và cộng sự đã cô lập được prasoether A (42), zeorin (46), và 1β,3β-diacetoxyhopan-29-oic acid (57) [16][17]

Atranorin (11), lecanoric acid (14) và α-collatolic acid (25) được cô lập bởi Neeraj V và cộng sự [24]

Hà Xuân Phong successfully isolated ten compounds from the lichen species Parmotrema sancti-angelii, including 8-(2,4-Dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H-isochromen-1-one, gyrophoric acid, lecanoric acid, orsellinic acid, methyl orsellinate, methyl β-orsellinate, methyl haematomate, and three new bicyclic compounds designated as Sancti A-C.

Protocetraric acid (21), malonprotocetraric acid (23) và (+)-(12R)-usnic acid

(40) được cô lập bởi Keogh M F [19]

Depside atranorin (11), các depsidone salazinic acid (16), norstictic acid (19), hypostictic acid (20) và protocetraric acid (21) được cô lập từ Parmotrema dilatum bởi Honda N K và cộng sự [12]

Depside atranorin (11), depsidone salazinic acid (16) và xanthone lichexanthone (40) được cô lập từ cao chloroform của loài địa y Pamotrema lichexanthonicum bởi Ana C M và cộng sự [1]

Methyl orsellinate (5), ethyl orsellinate (6), n-butyl orsellinate (7), methyl β- orsellinate (8), methyl haematommate (9), ethyl chlorohaematommate (10), atranorin

(11), chloroatranorin (12), α-alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25), 2′′′-O- methyl-α-alectoronic acid (26), 2′′′-O-ethyl-α-alectoronic acid (27), dehydroalectoronic acid (28), dehydrocollatolic acid (29), parmosidone A (30),

8 parmosidone B (31), parmosidone C (32), isocoumarin A (33), isocoumarin B (34), β- alectoronic acid (36), 2′′′-O-methyl-β-alectoronic acid (37), 2′′′-O-ethyl-β-alectoronic acid (38), (+)-(12R)-usnic acid (39) và skyrin (41) được cô lập từ loài địa y

Parmotrema mellissii thu hái ở thành phố Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy [22]

 Parmotrema nilgherrense α-Alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25) và dehydrocollatolic acid (29) được cô lập bởi Kharel M K và cộng sự [20]

Depside atranorin (11) được cô lập bởi Neeraj V và cộng sự [24]

Năm 2011, Dương T Huy và cộng sự [7] đã cô lập được 7 hợp chất gồm có methyl β-orsellinate (8), methyl orsellinate (5), orsellinic acid (4), methyl haematommate (9), atranorin (11), lecanoric acid (14), (+)-(12R)-usnic acid (39)

Năm 2012, orcinol (3), gyrophoric acid (13), protocetraric acid (21), 9’-O- methylprotocetraric acid (22), 2-[3-(2,6-dihydroxy-4-methylbenzyl)-2,4-dihydroxy-6- methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (35), được cô lập bởi Dương

Atranorin (11), chloroatranorin (12), salazinic acid (16) và consalazinic acid

(17) được cô lập từ cao acetone bởi Fazio A T và cộng sự [10]

Atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập từ cao hexane của loài địa y

Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T S và cộng sự [5]

Orsellinic acid (4), methyl orsellinate (5), atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Javaprakasha G K và cộng sự [18]

Depside atranorin (11) và hai depsidone salazinic acid (16) và consalazinic acid

(17) được cô lập từ cao acetone bởi O’Donovan D G và cộng sự [25]

Isolecanoric acid (15) được cô lập bởi Sakurai A và cộng sự [27]

Ethyl orsellinate (6) được cô lập bởi Santos L C và cộng sự [28]

Atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Honda N K và cộng sự [12]

Hợp chất phenolic đơn vòng

Orsellinic acid ( 4 ) Methyl orsellinate ( 5 ) Ethyl orsellinate ( 6 ) n-Butyl orsellinate ( 7 )

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema

Parmosidone A (30) R= a− C 2 H 5 [H-5''' (d H 5.28 (d, 5.0 Hz)] Parmosidone B (31) R= β -C 2 H 5 [H-5''' (d H 5.29 (dd, 5.5, 3.5 Hz)] Parmosidone C (32) R=C 4 H 9

R 1 R 2 R 3 Salazinic acid (16) H CHO CH 2 OH Consalazinic acid (17) H CH 2 OH CH 2 OH Stictic acid (18) CH 3 CHO CH 3

Norstictic acid (19) H CHO CH 3 Hypostictic acid (20) CH 3 CH 3 CH 3

Protocetraric acid (21) H 9'-O- Methylprotocetraric acid (17) CH 3 Malonprotocetraric acid (23) COCH 2 COOH

Methyl 2-[3-(2,6-dihydroxy-4- methylbenzyl)-2,4-dihydroxy-6- methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy- 6-methylbenzoate ( 35 )

R 1 R 2 β-Alectoronic acid ( 36 ) H H 2'''-O-Methyl-β-alectoronic acid ( 37 ) H CH 3 2'''-O-Ethyl-β-alectoronic acid ( 38 ) H C 2 H 5

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp)

HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

Hóa chất

• Silica gel 0.04 – 0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí

• Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F254 (20×20), Merck

• Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol và nước cất

• Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng vanillin/H 2 SO 4

Thiết bị, dụng cụ

• Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu

• Máy cô quay chân không Buchi-111, bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath

• Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm

• Các thiết bị ghi phổ: phổ 1 H-NMR tần số 500 MHz và phổ 13 C - NMR ở tần số

125 MHz tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

NGUYÊN LIỆU

Hình 2.1 Tản địa y Parmotrema sancti-angelii

Loài địa y Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale thu hái trên thân cây trà

Camellia sinensis (L.) O Ktze được ghi nhận tại thành phố Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng, với tên khoa học do tiến sĩ Harrie J M Sipman thuộc Vườn và Bảo tàng Thực vật, Đại học Freie, Berlin, Đức xác định Mẫu ký hiệu số US-B025 hiện đang được lưu trữ tại bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên.

QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

Bột địa y khô (350 g) được ngâm trong acetone ở nhiệt độ phòng, sau đó cô quay để thu hồi dung môi, thu được cao acetone thô (145.1 g) Trong quá trình bay hơi dung môi, tủa xuất hiện và được lọc riêng, thu được tủa P (30.0 g).

Dịch chiết đem cô quay thu được 110.4 g cao acetone Sau khi thực hiện sắc kí cột trên cao acetone với hệ dung môi hexane–ethyl acetate (9:1), thu được 6.1 g cao H0 Tiếp tục giải ly với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (8:2, 7:3, 6:4, 4:6, 3:7), các phân đoạn thu được tương ứng là H1 (2.1 g), C (15.4 g), EA1 (4.5 g), EA2 (5.1 g) và EA3 (9.8 g).

Tiến hành sắc kí cột trên phân đoạn H1 (2.1 g) với hệ dung môi hexane–ethyl acetate–acetic acid (9:1:0.5) đã thu được năm phân đoạn H1.1 (1.1 g), H1.2–H1.4 (0.5 g) và H1.5 (197.3 mg) Tiếp theo, thực hiện sắc kí lớp mỏng trên phân đoạn H1.5 (197.3 mg) bằng hệ dung môi H:A:M (7:3:0.4), kết quả thu được hai hợp chất là H3.79 (4.9 mg) và P2 (3 mg).

Sơ đồ 2.1 Qúa trình ly trích và cô lập trên địa y Parmotrema sancti-angelii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT H3.79

Hợp chất H3.79 (4.9 mg) thu được từ phân đoạn H1.5 của địa y Parmotrema sancti-angelii với các đặc điểm sau:

• Là chất bột vô định hình màu trắng

• Phổ 1 H-NMR (500 MHz, Acetone-d6): Phụ lục 1

• Phổ 13 C-NMR (125 MHz, Acetone-d6): Phụ lục 2

 Bi ện luận cấu trúc hợp chất H3.79:

Phổ 1 H-NMR cho thấy 8 nhóm methyl mũi đơn ở δ 1.19 (3H, s, H-23), 1.02 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-25), 1.09 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-27), 0.81 (3H, s, H-28),

1.26 (3H, s, H-29), 1.13 (3H, s, H-30), hai nhóm oxymethine tại δ 3.93 (1H, m, H-6) và 4.06 (1H, ddd, J.5, 9.5, 4.5 Hz, H-16) Phổ 13 C-NMR cho thấy sự hiện diện của

Hợp chất có 30 carbon, bao gồm 2 nhóm oxymethine tại δC 65.8 (C-16) và 67.1 (C-6), 5 carbon tứ cấp, 5 nhóm methine, 9 nhóm methylene và 8 nhóm methyl Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất cho thấy sự tương đồng với dữ liệu của zeorin ở các vòng A và B.

So sánh dữ liệu phổ NMR giữa H3.79 và zeorin cho thấy sự khác biệt chính là sự xuất hiện của nhóm oxymethine (δH 4.06, ddd, J 5, 9.5, 4.5 Hz) thay thế cho nhóm methylene tại C-16 trong hợp chất zeorin Ngoài ra, nhóm methine H-5 (δH 0.87, d, J 10.5 Hz) tương tác spin-spin 1H-1H nhị trục với nhóm methine tại (δH 3.93, m, H-).

Phân tích hằng số ghép của H-16 cho thấy proton này tương tác với hai proton khác ở vị trí trục, giúp tái khẳng định vị trí 6α của nhóm hydroxyl.

Tần số J aa là 11.5 Hz và 9.5 Hz xác nhận định hướng β của nhóm 16-OH Dựa trên kết quả phân tích và tài liệu tham khảo, H3.79 đã được xác định là leucotylin (Hình 3.1).

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của zeorin và H3.79

Hình 3.2 Cấu dạng của hợp chất H3.79

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất zeorin và H3.79

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT P2

Hợp chất P2 (3 mg) thu được từ phân đoạn H1.5 của địa y Paemotrema sancti-angelii với các đặc điểm sau:

• Chất bột vô định hình màu trắng

• Phổ 1H-NMR (500 MHz, Acetone): Phụ lục 3 : 2.23 (3H, s),

 Bi ện luận cấu trúc hợp chất P2:

Phổ 1 H-NMR cho thấy hai proton vòng thơm tại δ 6.26 (2H, s), cho thấy proton chịu ảnh hưởng của các nhóm –OR đẩy electron, đồng thời chỉ ra rằng hợp chất P2 là đối xứng với hai proton ở vị trí meta Ngoài ra, phổ còn xác định sự hiện diện của một nhóm methyl thơm tại δ 2.23 (3H, s) và một nhóm aldehyde tại δ 10.26 (1H, s) Dựa trên các dữ liệu phổ và tài liệu tham khảo [14], hợp chất P2 được xác định là atranol (Hình 3.2).

Hình 3.3 Công thức hợp chất P2

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Atranol và P2