TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN TRẦN VĂN TUẤN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN 201 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, Trước tiên tơi xin gởi lời cam ơn đến Q thầy cô thuộc Bộ Môn Dinh Dưỡng Chế Biến Thủy Sản, Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ ln quan tâm tận tình đến tơi q trình thực đề tài Ngồi tơi nhận giúp đở lớn từ Thạc sĩ Phạn Văn Hùng, Phó Giám Đốc Trung Tâm Nơng lâm Thủy Sản vùng cán khác phòng kiểm nghiệm vi sinh Trung Tâm Bên cạnh cịn có người khơng thể nao khơng nhắc đến gia đình bạn bè tơi chăm sóc ủng hộ cho suốt thời gian qua Xin chân thành tri ân đến tất người! i TÓM LƯỢC Việc phát vi khuẩn Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản ngày gia tăng thời gian gần Đây loại vi khuẩn gây nhiều bệnh nguy hiểm người Hiện việc xác định loại vi khuẩn thủy sản chủ yếu dùng Phương pháp ISO 11290-1:2004 thời gian cho kết kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp âm tính đến bảy ngày cho trường hợp dương tính Điều thật gây nhiều trở ngại cho hoạt động sản xuất mặt hàng thủy sản Vì úng dụng phương phân tích nhanh cần thiết, có Phương pháp PCR Phương pháp cho kết thời gian từ hai đến ba ngày Để ứng dụng Phương pháp vào thực tiển cần phải kiểm tra độ đặc hiệu L.monocytogenes, độ lập lại phương pháp tính tương đồng phương pháp so với Phương pháp ISO 11290-1:2004 Sau q trình thí nghiệm từ tháng 1/2010 – 4/2010 Trung Tâm Nông Lâm Thủy Sản Vùng 6, kết cho thấy Phương pháp PCR đặc hiệu với L.monocytogenes, 100% số lần lập lại cho kết dương tính phương pháp phân tích nhanh L.monocytogens PCR cho kết tương đồng với phương pháp định tính L.monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 Qua cho thấy ứng dụng Phương pháp PCR bước xác định nhanh L.monocytogenes vào thực tế kiểm nghiệm Từ khóa : PCR; Listeria monocytogenes ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT L.mono L innocua L.ivanoii R equi S aureus AOAC FDA ISO PCR HF ALOA SPW TSYEA TSYEB TSA BHI TBE Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria ivanoii Rodococcus equi Saphylococcus aureus Association of Analytial Communities (Hiệp hội nhà phân tích) Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ) International Standard Organization (Tổ chức tiêu chuẩn Quốc Tế) Polymerase Chain Reacion Half Fraser Broth Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI Salty peptone water (Nước muối sinh lý) Trytone soya broth Yeast extract Agar Trytone soya broth Yeast extract Tryptic Soy Agar Brain Heart Infusion Tris- Borate EDTA iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .i Tóm lược ii Danh mục từ viết tắt iii Mục lục iv Danh sách bảng vi Danh sách hình vii Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .1 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dụng nghiên cứu 1.4 Thời gian thực đề tài Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Listeria monocytogenes 2.1.1 Phân loại hoc 2.1.2 Hình thái học 2.1.3 Đặc điếm sinh lý 2.1.4 Khả chịu đựng 2.1.5 Phân bố nguồn lây nhiễm 2.1.6 Đặc điểm gây bệnh 2.2 Các phương pháp 2.2.1 Theo ISO 11290 -1:2004 2.2.2 Theo phương pháp áp dụng kỷ thuật PCR 11 Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 15 3.1 Phương tiện thí nghiệm 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 15 3.1.3 Mẫu thủy sản 15 3.1.4 Chủng vi sinh .15 3.1.5 Mơi trường, hóa chất 15 3.1.6 Thiết bị dụng cụ .15 3.2 Qui trình định tính L.monocytogenes kỷ thuật PCR 16 3.2.1 Thuyết minh qui trình 16 3.3 Phương pháp thí nghiệm 18 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ lập lại phương pháp 16 3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy 20 3.3.3 Thí nghiệm : Xác định độ lặp lại 22 3.3.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng phương pháp .23 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết thí nghiệm 26 4.2 Kết thí nghiệm 27 4.3 Kết thí nghiệm 29 4.4 Kết thí nghiệm 30 iv Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .34 PHỤ LỤC HÌNH 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Đặc điểm khác loài thuộc giống Listeria Bảng 2.2 Một số thông số Listeria Bảng 3.1 Các giai doạn q trình chạy PCR .17 Bảng 3.2 Danh mục chủng vi sinh vật thử nghiệm 20 Bảng 4.1 Kết thí nghiệm xác định độ đặc hiệu…… 26 Bảng 4.2 Kết thí nghiệm xác định độ nhạy 28 Bảng 4.3 Kết thí nghiệm xác định độ lặp lại ……… 30 Bảng 4.4 Kết thí nghiệm xác định độ tương đồng………… 31 Bảng 4.5 Bảng so sánh ưu khuyết điểm hai phương pháp…… .32 vi Trang vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290 -1: 2004 .8 Hinh 2.2: Chu trình nhiệt máy luân nhiệt PCR 12 Hình 3.1: Sơ đồ phân tích nhanh Listeria monocytogenes kỷ thuật PCR 16 Hình 3.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định độ nhạy 19 Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm xác định độ lặp lại 21 Hình 3.4: Sơ đồ thí nghiệm xác định độ tương đồng 24 Hình 4.1: Ảnh chụp kết chạy điện di thí nghiệm 27 Hình 4.2: Ảnh chụp kết chạy điện di thí nghiệm 29 Hình 4.3: Ảnh chụp kết chạy điện di thí nghiệm 30 Hình 4.4: Ảnh chụp mẫu nhiễm Listeria monocytogenes ALOA 32 Hình 4.5: Ảnh chụp kết phân tích mẫu nhiễm Listeria monocytogenes PCR bước 33 vii Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Thủy sản ngành đóng góp vào nguồn thu ngoại tệ nhiều nước ta, năm gần mặt hàng gặp khó khăn thị trường xuất vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm cịn chưa tốt, trường hợp bị nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes bị phát ngày gia tăng, năm 2007 phân tích loại vi khuẩn sản phẩm cá tra đơng lạnh có tới 21.5% cho kết dương tính, tăng lên 30.36% vào năm 2008 với đặc tính gây nhiều bệnh nguy hiểm người gây nhiễm trùng máu, viêm màng não trẻ em, phụ nữ mang thai dễ bị sảy thai, để non trẻ chết sau sinh…, Listeria monocytogenes trở thành mối quan tâm lớn khách hàng trung tâm kiểm tra chất lượng giới Hiện có nhiều phương pháp ứng dụng để xác định Listeria monocytognens thực phẩm Trong có phương pháp truyền thống như: ISO 11290- 1:2004, BAM-FDA, USDA, ALOA định danh Listeria.momocytogenes thực phẩm bao gồm nhiều bước phức tạp tăng sinh, phân lập môi trường chọn lọc dùng thử nghiệm hóa sinh để dịnh danh Các phương pháp truyền thống cần nhiều thời gian thực từ ba đến bốn ngày cho trường hợp âm tính năm đến bảy ngày cho trường hợp dương tính Do hạn chế mà dẫn đến nhiều khó khăn, bất tiện hoạt động sản xuất kèm theo sản phẩm bị tổn thất giảm chất lượng phải lưu kho thời gian dài để đợi kết phân tích Hiện phát triển phương pháp đại phương pháp miễn dịch ELISA, phương pháp phân tích nhanh RAPID`Lmono, để phát nhanh Listeria monocytogenes Khi tìm gen đặc hiệu cho Listeria monocytogenes việc ứng dụng kỹ thuật PCR xác định Listeria monocytogenes có nhiều triển vọng rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống từ 2-3 ngày có độ tin cậy cao dễ thực hiện, từ mà khác phục hạn chế lớn phương pháp ISO 11290- 1:2004 Do tiến hành nghiên cứu “ ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định Listeria monocytogenes thực phẩm thủy sản” 1.2 Mục tiêu đề tài Kiểm tra khả ứng dụng kỹ thuật PCR bước để phát nhanh Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản điều kiện phịng thí nghiệm thơng qua phân tích tiêu: Độ đặc hiệu Độ nhạy Độ lặp lại Sự tương đồng hai phương pháp PCR ISO11290 – 1:2004 1.3 Nội dung nghiên cứu Xác định độ đặc hiệu cách cho chạy PCR mẫu có chứa DNA vi khuẩn Listeria monocytogenes mẫu có chứa DNA vi khuẩn Listeria spp khác Listeria monocytogenes Dựa sử dụng chế phẩm chuyên dùng phân tích Listeria spp Xác định độ nhạy bước khuếch đại DNA kỹ thuật PCR bước cách dựa vào độ đục chuẩn McFarland để pha loảng chủng nhiều nồng độ sau tiến hành chạy PCR Nồng độ thấp phát vạch DNA ảnh gel doc độ nhạy phương pháp Xác định độ lặp lại kỹ thuật thông qua việc tiến hành phân tích nhiều lần lập lại mẫu có chứa Listeria monocytogenes nồng độ định điều kiện phịng thí nghiêm để đánh giá mức độ ổn định kỹ thuật Xác định độ tương đồng phương pháp PCR phương pháp ISO11290 – 1:2004 cách tiến hành song song hai phương pháp để xác định Listeria monocytogenes 1.4 Thời gian thực hiên Từ tháng 1/2010 đến 5/2010 3.3.4.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Mười mẫu thủy sản nhiễm listeria monocytogenes Tăng sinh Half Fraser Phân lập ALOA Chon khuẩn lạc điển hình ALOA Phân tích kỹ thuật PCR Phân tích phương pháp ISO1129-1:2004-1:2004 Chạy điện di chụp ảnh gel doc Thử nghiệm sinh hóa Đọc kết Đọc kết Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiêm 3.3.4.3 Tiến hành thí nghiệm a) Lấy mẫu nhiểm: Từ miếng cá tra file chọn nhiều vị trí khác mẫu cá, khoảng từ bốn đến năm vị trí b) Tăng sinh:Cho vào bao plastic 25gam mẫu thêm vào 225ml HF Cho vào máy dập mẫu phút để trộn mẫu, ủ mẫu 370C 24h c) Phân lập ALOA: Như nêu mục 2.2.1.3 Sau chọn khuẩn lạc điển hình phân tích song song hai phương pháp d) Phân tích PCR: Nêu mục 3.2 e) Phân tích ISO 11290 – 1:2004: Như nêu mục 2.2.1.3 f) Đọc kết quả: Thu thập đọc kết dương tính 24 3.4 Phương pháp thu thập, tính tốn xử lý số liệu Tổng hợp kết từ thí nghiệm Tổng số kết cho dương tính Phương pháp PCR Phương pháp xác định LD50 Tổng số cho kết dương tính Phương pháp ISO 11290-1:2004 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định độ đặc hiệu phương pháp phân tích nhanh định tính tiêu Listeria monocytogenes PCR : Để xác định tính đặc hiệu phương pháp PCR Listeria monocytogenes sử dụng chủng vi sinh vật Bảng 3.3 để tiến hành thí nghiệm Các chủng dược tăng sinh môi trường BHI sau phân lập ALOA 37 0C từ 24 – 48 , ly trích tinh DNA tiến hành chạy PCR với mồi sử dụng Hly F1/R1(399bp) Kết thu được thể Bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết thí nghiệm xác định độ đặc hiệu Mẫu Chủng vi sinh vật A0 Mẫu đối chứng không Xuất hiện/không xuất vạch 399bp Không xuất chứa vi sinh vật A1 Listeria monocytogenes Xuất A2 Listeria ivanovii Không xuất A3 Listeria innocua Khơng xuất Thí nghiệm lập lại 10 lần cho kết tương tự Bảng 4.1 Do mồi bổ sung Hly F1/R1 có kích thước 399bp bắt cặp với gen Listeriolysin Listeria monocytogenes, trải qua trình luân nhiệt loại gen đặc hiệu cho Listeria monocytogenes nhân lên hàng tỷ lần, kết gel doc xuất vạch 399bp Trong loại vi sinh vật khác thuộc Listeria spp khơng có loại gen chun biệt nên khơng có xuất vạch 399bp ảnh gel doc (Hình 4.1) Qua đưa kết luận: Mồi Hly F1/R1 thiết kế đặc hiệu để phát Listeria monocytogenes 26 399bp Hình 4.1 Kết thí nghiệm xác định độ đặc hiệu phương pháp PCR Listeria monocytogenes Ghi chú: Lino: Listeria innocua Liva: Listeri ivanovii Lm: Listeria monocytogenes (-): Mẫu âm không chứa vi khuẩn M: Thang DNA 4.2 Xác định độ nhạy bước khuếch đại DNA kỹ thuật PCR bước việc phát Listeria monocytogenes: Sau tiến hành tăng sinh Listeria monocytogenes môi trường lỏng BHI 24 giờ, tiếp tục xác định nồng độ vi khuẩn ống cách so sánh với độ đục chuẩn với McFarland xác định nồng độ Listeria monocytogenes ống môi trường BHI la khoảng 108 tế bào/ml xem 100 ta tiến hành pha loảng nồng độ dãy thập phân: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10 -6, 10-7, 10-8 Trên nồng độ tiến hành chạy PCR cấy đĩa môi trường PCA Kết chạy PCR thể Bảng 4.3 27 Bảng 4.2 Kết thí nghệm xác định độ nhạy Nồng độ Ngày phân tích 10/4 Độ lặp lại Tỷ lệ dương tính 10/4 Tỷ lệ dương tính 10-1 Số tế bào cho Kết vào đọc PCA 10-2 Số tế bào cho Kết vào đọc PCA 10-3 Số tế bào cho vào đọc Kết PCA Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos 100% 100% 10-5 ND ND ND 1250 ND ND 10-6 ND ND ND 130 ND ND 0% 0% 130000 Số bào cho vào đọc PCA 12500 100% 13 0% Kết ND ND Pos Pos Pos 60% 10-7 ND ND ND ND ND 10-4 tế 10-8 ND ND ND ND ND 0% Ghi chú: Pos: Kết dương tính ND : Kết âm tính Tính tốn LD50 Giá trị L: L = log130000 (Mật độ tế bào thấp có 100% cho kết dương tính) Giá trị d: d = log10 (Hệ số pha loãng) Các giá trị pi: p1 = 1,0 (100% dương tính mật độ tế bào thấp nhất) p = 0,6 (Tỉ lệ dương tính) ∑ pi = 1,6 Theo cơng thức tính toán LD50 – phương pháp Speaman- Karber Mục 3.3.2.4 Ta tính được: m= 4,01 LD50 = 10232,93 28 Um = 0,96 m- 2SQRT(Um) = 2,05 m+2SQRT(Um)=5,97 Cận : 10230,88 Cận : 10237.97 Kết luận: giới hạn phát bước khuếch đại DNA kỹ thuật PCR bước Listeria monocytogenes LD50 = 10233 (số liệu làm tròn từ LD50=10232,93) Với độ tin cậy 95% LD50 nằm khoảng 10231 - 10238 tế bào (làm trịn từ cận cận dưới) Hình 4.2 Độ nhạy kỷ thuật PCR Listeria monocytogenes Ghi chú: M: Thang DNA (-): chứng âm không chứa vi khuẩn Listeria monocytogenes 5: Nồng độ 10-5 1: Nồng độ 10-1 2: Nồng độ 10-2 6: Nồng độ 10-6 3: Nồng độ 10-3 7: Nồng độ 10-7 4: Nồng độ 10-4 8: Nồng độ 10 -8 4.3 Xác đinh độ lặp lại phương pháp PCR bước: Chúng tiến hành bố trí thí nghiệm lặp lại 10 lần cho khuẩn lạc chủng Listeria monocytogenes phân lập lôi trường ALOA để kiểm tra độ ổn định phương pháp Kết nêu Bảng 4.1 29 Bảng 4.3: Kết thí nghiệm xác định độ lặp lại Số lần lặp lại Tỷ lệ dương tính 10 10/10 (-) L.M L.M L.M L.M L.M M 399bp 399bp Hình 4.3: Xác định độ lặp lại bước khuếch đại DNA (-) : Mẫu trắng khơng có Listeria monocytogenes LM: Mẫu có chứa Listeria monocytogenes M : Thang DNA; 36bp-955bp Kết luận: Với 10 lần phân tích cho tỷ lệ dương tính 100% Như dựa vào Bảng 4.3 Hình 4.3 cho thấy phương pháp định tính Listeria monocytogenes kỹ thuật PCR bước ổn định điều kiện phịng thí nghiệm 4.4 Kiểm tra độ tương đồng phương pháp PCR so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004: Kết thí nghiệm dựa kết thí nghiệm 1và kết phân tích đồng thời 10 mẫu cá tra phi lê nhiễm chủng Listeria monocytogenes hai phương pháp PCR bước ISO 11290 – 1:2004 Đối với phương pháp định tính tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 mẫu cá có độ đặc hiệu cho Listeria monocytogenes phép thử sinh hóa, độ nhạy LD50 = 12 với độ tin cậy 95% LD50 nằm khoảng 9-15 tế bào/25gam, độ lặp lại mức L= 45 100% (Báo cáo thẩm tra phương pháp phân tích định tính Listeria monocytogenes thực phẩm ISO 11290-1:2004 Trung Tâm chất lượng, an toàn vệ sinh & thú y thủy sản vùng 6) Phương pháp phân tích nhanh định tính tiêu Listeria monnocytogenes PCR bước cho độ đặc hiệu độ lặp lại nằm chuẩn mực cho phép 30 tương đương với phương pháp chuẩn ISO11290 – 1:2004 dựa tổng hợp kết thí nghiệm 1và kết phân tích 10 mẫu cá tra phi lê bị nhiễm Listeria monnocytogenes đồng thời hai phương pháp (Bảng 4.4) Bảng 4.4 Xác định độ tương đồng Tên thí nghiệm Độ đặc hiệu Phương pháp PCR bước ISO 11290-1:2004 Đặc hiệu cho vi khuẩn Listeria monocytogene Chọn lọc khuẩn lạc Listeria spp Trên môi trường ALOA, Oxford Đặc hiệu phép thử sinh hóa Độ lặp lại Thử nghiệm song song hai phương pháp 100% 100% 10 mẫu nhiễm Listeria monocytogenes thực kỷ thuật PCR cho kết với thử nghiệm sinh hóa 92% 10 mẫu nhiễm Listeria monocytogenes ALOA , Oxford cho kết với thử nghiệm sinh hóa 80% (ALOA), 70%(Oxford) Qua Bảng 4.4 ta kết luận rằng: Phương pháp định tính nhanh tiêu Listeria monocytogenes kỹ thuật PCR so với phương pháp định tính tiêu Listeria monocytogenes theo ISO11290 -1:2004 cho kết phân tích tương đồng cho thấy ưu khuyết điểm hai phương pháp thể Bảng 4.5 31 Bảng 4.5 So sánh ưu khuyết điểm hai phương pháp PCR bước ISO 11290-1:2004 Khuyết điểm Ưu điểm Tên phương pháp ISO 112901:2004 Thời gian kết trường hợp dương tính lên đến ngày Chi phí thấp so với phương pháp khác PCR bước Chi phí cao so với phương pháp chuẩn ISO 11290-1:2004 Cần có thiết bị đắt tiền máy luân nhiệt, máy điện di, máy chụp ảnh gel doc… Cho kết tương đồng với phương pháp chuẩn ISO11290-1:2004, không cần tiến hành phép thử sinh hóa nên rút ngắn thời gian cho kết xuống cịn 2-3 ngày Mơi trường ALOA Hình 4.4: Mơi trường ALOA Listeria monocytogenes ALOA Trên ALOA khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình có màu xanh da trời, khuẩn lạc bóng lồi, đường kính khuẩn lạc từ 1- 4mm sau 24 giờ, xung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục mờ bao quanh (Hình 4.4 ) Mơi trường ALOA chứa chất ức chế Sodium Chloride, Lithium Chloride, Disodium hydrogen phosphate ức chế số vi sinh vật khác Listeria spp Mặt khác mơi trường ALOA có 5-Bromo-1Chloro-3- Indolyl- β -D- Glucosidase Khi phát triển môi trường ALOA 32 hệ enjyme β -D- Glucosidase Listeria monocytogenes bẻ gãy liên kết chất 5-Bromo-1-Chloro-3- Indolyl- β -D- Glucosidase tạo gốc 5-Bromo-1Chloro-3- Indolyl có màu xanh khuẩn lạc Listeria monocytogenes phát triển ALOA tạo khuẩn lạc màu xanh Mặt khác supplement có Phosphatidylinositol kích thích hoạt động enzyme Phospholipase Listeria monocytogenes phân giải Lipid protein tạo vùng tủa trắng đục mờ xung quanh khuẩn lạc Hình 4.5 Kết phân tích mẫu cá tra nhiễm Listeria monocytogenes (-) : Mẫu trắng khơng có Listeria monocytogenes LM: Mẫu có chứa Listeria monocytogenes M : Thang DNA; 36bp-955bp 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Mồi thiết kế phương pháp PCR bước(HlyF1/R1) đặc hiệu phát Listeria monocytogenes Độ nhạy bước khuếch đại DNA kỹ thuật PCR bước LD50=10233 tế bào Độ lặp lại phương pháp PCR bước 100% Kết thí nghiệm song song hai phương pháp PCR ISO 112901:2004 cho thấy phương pháp PCR bước cho kết phân tích tương đồng với phương pháp chuẩn ISO 11290 – 1:2004 Thời gian cho kết phương pháp PCR bước hai đến ba ngày ngắn nhiều so với phương pháp ISO 11290 - 1:2004 từ bốn đến bảy ngày Chi phí phương pháp PCR bước cao trung bình 50.000 so với phương pháp truyền thống ISO11290-1:2004 cho mẫu thử 5.2 Đề xuất Do phương pháp rút ngắn thời gian phân tích Listeria monocytogenes xuống cịn 2-3 ngày nên chúng tơi đề nghị nên áp dụng phương pháp rộng rãi phịng kiểm nghiêm vi sinh thực phẩm Ngồi nên tiến hành nghiên cứu thêm việc ứng dụng kỹ thuật PCR để định lượng Listeria monocytogenes thực phẩm 34 PHỤ LỤC HÌNH Hình H.2 Khuẩn lạc Listeria invanoi Listeria innocua ALOA Hình H.3 Khuẩn lạc Listeria monocytogenes môi trường Oxford Đường Xylose va Rhamnose Listeria monocytogees Xylose (-) Rhamnose (+) 35 Hình H.4 Thử nghiệm sử dụng đường Xylose Rhamnose Hình H.5 Thử nghiệm tan huyết cho Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanoi Hình H.6 Máy điện di gel agarose Hình H.7 : Máy chụp ảnh gel doc 36 Hình H.8: Buồn nhiệt Hình H.9 : Máy ly Tâm Hình H.10: Máy luân nhiệt Hình H.11: Máy điều chỉnh pH 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Văn Hùng - Xác định nguyên nhân lây nhiễm đề xuất giải pháp kiểm soát mối nguy Listeria monocytogenes chế biến cá tra, 2009 Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm – NXB Giáo dục Cao xuân Hiếu, Trương Quốc Phong – Cẩm Nang Sinh Học Phân TửNXB Giáo dục Nguyễn Đức Lượng – Vệ sinh an toàn thực phẩm – NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Embarek, P.K.B and Hus, H.H 1993 Heat resistance of Listeria.monocytogenes in vacuum packaged pasteurized fish fillet Intl.J.Food Microbiol 8:95-98 Ben Embarcked, P.K 1994: Presence, dection and growth of Listeria.monocytogenes in seafood; a review International Journal of Food Microbiology 23:17-34 FDA 2000, Listeria monocytogenes, Chapter 17 P J Bremer, G c Fletcher & C Osborne, May 2003, Listeria monocytogenes in seafood, Newzeland Insitute for Crop & Food Research Limited A Crown Research Institute Hornes, E., Y Wasteson, and Ø Olsvik 1991 Detection of Escherichia coli heat-stable enterotoxin genes in pig stool specimens by an immobilized, colorimetric, nested polymerase chain reaction J Clin Microbiol 29:2375-2379 10 Karch, H., and T Meyer 1989 Single primer pair for amplifying segments of distinct Shiga-like toxin genes by polymerase chain reaction J Clin Microbiol 27:2751-2757 11 Lu, Y., C Toma, Y Honma, and M Iwanaga 2002 Detection of EspB using reversed passive latex agglutination: application to determination of enteropathogenic Escherichia coli Diagn Microbiol Infect Dis 43:7-12 12 Nagano, I., M Kunishima, Y Itoh, Z Wu, and Y Takahashi 1998 Detection of verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 by multiplex polymerase chain reaction Microbiol Immunol 42:371-376 13 Mattingly, J.A.,B.T Butman, M.C Plank, and R.J Durham 1988 Arapid monoclonal antibody-based ELISA for the detection of Listeria in food products J Assoc.Off Anal Chem 71:669-673 13 www.Wikipedia.Com.vn 38 ... cao dễ thực hiện, từ mà khác phục hạn chế lớn phương pháp ISO 11290- 1:2004 Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu “ ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định Listeria monocytogenes thực phẩm thủy sản? ?? 1.2... trùng, tách dòng gen xác định huyết thống… 2.2.2.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR để xác định Listeria monocytogenes PCR sẻ khuếch đại đoạn DNA ngắn đặc hiệu cho Listeria monocytogenes xác định từ trước, từ... lặp lại phương pháp xác định Listeria monocytogenes kỹ thuật PCR 3.3.3.1 Mục đích Xác định độ lặp lại phương pháp phân tích định tính tiêu Listeria monocytogenes kỹ thuật PCR điều kiện thí nghiệm