Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 1 Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Listeria monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các triệu chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu và viêm màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Vì vậy Listeria monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát trong quản lý chất lượng thực phẩm. Các phương pháp truyền thống ví dụ như ISO 11290-1:2004 hay BAM – FDA (chương 10) phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm bao gồm các bước tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và thử nghiệm hóa sinh để định danh. Quá trình này thường kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp âm tính và trên bảy ngày cho các trường hợp dương tính. Đây thật sự là một trở ngại cho việc đánh giá chất lượng nói chung và phân tích vi khuẩn gây bệnh trong sản phẩm thực phẩm vì thời gian chờ trả kết quả quá dài. Trong những năm qua, nhiều phương pháp phát hiện Listeria monocytogenes dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA, … đã được triển khai. Trong đó nhiều phương pháp đã được thiết kế theo hướng cho kết quả phân tích nhanh. Vì vậy việc ứng dụng phương pháp phân tích nhanh vào kiểm nghiệm thực phẩm là vấn đề được nhiều phòng thí nghiệm quan tâm. RAPID’L.mono là phương pháp mới khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện nhanh, dễ thực hiện, đọc kết quả phân tích dễ dàng, cho kết quả cùng lúc về Listeria monocytogenes và các loài khác thuộc Listeria spp trên cùng một đĩa môi trường chọn lọc. Vì những lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono để phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản”. 1.2. Mục tiêu của đề tài Xác định độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L. mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo tiêu chuẩn ISO 11290-1:2004 thông qua các chỉ tiêu thí nghiệm: - Độ đặc hiệu - Độ nhạy - Độ lặp lại Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 2 1.3. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện đề tài chúng tôi dự kiến các nội dung nghiên cứu sau: 1. Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono bằng cách thử nghiệm trên mẫu gây nhiễm Listeria monocytogenes và mẫu gây nhiễm vi sinh vật khác. Trên cơ sở xác định khuẩn lạc điển hình, thử nghiệm sinh hóa điển hình (nếu có) của Listeria monocytogenes. 2. Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD) của phương pháp thông qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện. 3. Xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách phân tích mẫu thực phẩm thủy sản nhiễm Listeria monocytogenes hay mẫu thực phẩm gây nhiễm Listeria monocytogenes nhằm đánh giá sự ổn định của phương pháp phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm. 4. Phân tích song song mẫu sản phẩm thủy sản nhiễm Listeria monocytogenes bằng cả hai phương pháp: RAPID’L.mono và ISO 11290-1:2004. Kết hợp kết quả thu được từ Mục 1 – 3 để đánh giá mức độ tương đồng của phương pháp RAPID’L.mono so với phương pháp chuẩn ISO 11290-1:2004. 1.4. Thời gian thực hiện đề tài Tháng 01/2009 đến 05/2009 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes 2.1.1. Phân loại học Theo khóa phân loại của Bergey’s (tái bản lần thứ 7), giống Listeria được xếp vào họ Corynebacteriaceae. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Stackebrandt và cộng sự (1983) về rRNA 16S, ông đã chứng minh rằng Listeria monocytogenes hoàn toàn khác biệt trong nhánh Lactobacillus- Bacillus thuộc cây phát sinh loại vi khuẩn do Woese xây dựng năm 1981. Năm 2001, Họ listeriaceae đã được tạo ra, bao gồm cả Staphylococcaceae, Bacillaceae và các họ khác. Trong phạm vi cây phát sinh loại này có sáu loại thuộc loại Listeria: L. monocytogenes, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii L.innocua và L. grayi. Loại L. grayi có hai loài phụ là L.grayigrayi và L. grayimurrayi. 2.1.2. Hình thái học Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que, gram dương, di động nhờ tiêm mao, không sinh bào tử và đôi khi chúng tạo thành hình chuỗi ngắn. Khi kiểm tra kính phết, vi khuẩn này có dạng hình cầu, vì vậy thường lầm tưởng chúng là vi khuẩn Streptococci. Đôi khi xuất hiện những tế bào dài hơn có thể trông giống corynebacteria. Ở nhiệt độ phòng (không lớn 37 0 C) vi khuẩn này có khả năng tạo tiêm mao (flagella), di động theo thể thức lộn nhào và tạo hình tán dù trong môi trường motility agar. Hoạt tính tiêu huyết (heamolysis) trên môi trường thạch máu được dùng làm chỉ dấu để phân biệt Listeria monocytogenes trong số các loài khác thuộc giống Listeria, nhưng đây không phải là tiêu chí để xác định loài này. Để phân biệt các loại thuộc Listeria cần thêm các đặc tính sinh hóa được thể hiện ở Bảng 2.1. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 4 Bảng 2.1: Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria Ghi chú: Cata: catalase, Henry: Henry illumination, Man: manitol, Rham: Rhamnose, Xyl: Xylose. 2.1.3. Đặc điểm sinh lý 2.1.3.1. Thông số phát triển Bảng 2.2: Một số thông số cơ bản của Listeria Thế nước (a w ) cực đại pH tối thiểu pH cực đại NaCl(%) cực đại T 0 C tối thiểu T 0 C cực đại Nhu cầu oxy 0,92-0,95 4,6 9,6 8-12 0-2 45 Kỵ khí tùy nghi 2.1.3.2. Trong thực phẩm Listeria monocytogenes có khả năng sống trong nhiều loại thực phẩm đông lạnh, trong các sản phẩm chưa được gia nhiệt tốt, bề mặt sản phẩm đã bị tách nước. Sự phát triển của chúng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, pH và các loại thịt cũng như sự hiện diện của quần thể vi sinh vật. 2.1.4. Khả năng chịu đựng Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ưa lạnh và có khả năng phát triển ở nhiệt độ 2 - 8 0 C (nhiệt độ của tủ lạnh), pH tối thiểu là 4,6; chúng có khả năng sống trong điều kiện kỵ khí, hiếu khí ngay cả môi trường hút chân không hoặc có sự hiện diện của vi khuẩn lactic. Loài vi khuẩn này cũng có khả năng sống từ 10 đến 30 ngày trong nguồn nước công cộng ở nhiệt độ 28- 30 0 C và từ 7 đến 110 ngày ở nhiệt độ 5 đến 10 0 C. Ở nước ao chúng có khả năng sống đến 8 tuần với nhiệt độ không Các phản ứng phân biệt Listeria spp. CAMP test TÊN LOÀI Cata Gram Di động Henry Man (a) Rham Xyl Tan huyết S.aureus R.equi L. monocytogens + + + Xanh - + - + + - L. innocua + + + Xanh - V - - - - L. ivanovii + + + Xanh - - + + - + L. seeligeri + + + Xanh - - + (+) (+) - L. welshimeri + + + Xanh - V + - - - L. grayi loài phụ grayi + + + Xanh + - - - - - L. grayi loài phụ murrayi + + + Xanh + V - - - - V : phản ứng có thể xảy ra (+): phản ứng yếu + : >90% phản ứng dương tính -: phản ứng không xảy ra (a) tham khảo theo USFDA/CFSAN BAM- chương 10. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 5 khí từ -26 0 C đến 9 0 C. Ở nước biển Listeria monocytogenes có thể sống đến 3 tuần hoặc lâu hơn nữa. Việc tồn tại trong nước biển thì tùy thuộc vào nhiệt độ và chủng vi khuẩn này. Trong môi trường chế biến thực phẩm với độ ẩm là 75% và ở 15 0 C, hỗn hợp vi khuẩn Listeria monocytogenes và Flavobacteria spp. Có thể tồn tại hơn 75 ngày trên bề mặt thép không gỉ. Thời gian để giết chết 90% các tế bào này là 18,5 ngày. Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong các sản phẩm thủy sản xông khói đóng gói chân không được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 10 0 C, trong nhiều trường hợp chúng còn gia tăng số lượng tế bào. Ví dụ: trong tôm, thịt cua, surimi và cá được bảo quản ở nhiệt độ 7 0 C trong vòng 14 ngày, Listeria monocytogenes gia tăng đến 10.000 tế bào trên một gam sản phẩm. (Nguồn: Baron’s Medical Microbiology, Miscellaneous Pathogenic Bacteria (H Hof)). Khả năng chịu nhiệt của Listeria monocytogenes cũng là một yếu tố khá quan trọng để đánh giá mức độ nguy hiểm của vi sinh vật này đối với an toàn thực phẩm. Theo cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (USFDA), khả năng kháng nhiệt của loài vi khuẩn này trên các sản phẩm thủy sản khác nhau thì không giống nhau. Listeria monocytogenes là điển hình cho vi khuẩn không sinh bào tử có khả năng kháng khá tốt các tác động có hại như đông lạnh, làm khô và gia nhiệt. 2.1.5. Phân bố, nguồn lây nhiễm Mãi đến năm 1960, người ta vẫn còn nghĩ rằng Listeria monocytogenes hầu như không liên quan đến các bệnh truyền nhiễm ở động vật và ít khi xuất hiện ở người. Tuy nhiên, trong những năm sau đó, người ta bắt đầu phân lập được nhiều loài thuộc giống Listeria bao gồm cả các loài gây bệnh như Listeria monocytogenes và L. ivanovii từ nhiều nguồn khác nhau. Đến nay vi khuẩn này được công nhận là phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Ít nhất có 42 loài động vật có vú hoang dã và thuần dưỡng, 17 loài chim bao gồm thuần dưỡng và gà chọi là nơi ẩn náo của Listeria. Có khoảng từ 5 – 10% trong số chúng ta có Listeria monocytogenes hiện diện trong đường ruột nhưng không biểu hiện bất cứ triệu chứng nào về bệnh do listeria. Listeria cũng được phân lập từ giáp xác, cá, sò, ve ký sinh và ruồi. Ngoài ra có thể phân lập vi khuẩn này từ đất, thức ăn động vật và các nguồn khác từ môi trường. 2.1.6. Đặc điểm gây bệnh Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 6 Hiện nay theo quan điểm của Rocourt, L. ivanovii và L. monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho chuột và các động vật khác. Tuy nhiên chỉ có loài L. monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho người. Bệnh do L. ivanovii, và L. seeligeri thì rất hiếm khi xảy ra ở người. Thuật ngữ bệnh do listeria (listeriosis) bao gồm nhiều triệu chứng bệnh giống nhau ở người và động vật. Listeria monocytogenes gây bệnh ở người và động vật; L.ivanovii chỉ gây bênh ở động vật, chủ yếu ở cừu. Bệnh viêm màng não là hình thức bệnh thường gặp nhất ở động vật nhai lại. Ở những động vật còn nhỏ, thường xuất hiện nhiễm trùng nội tạng hoặc nhiễm trùng máu. Nhiễm trùng cổ tử cung ở bào thai qua đường nhau thường làm cừu và gia súc đẻ non. Tác động thật sự bệnh do Listeria ở người đến nay vẫn còn chưa sáng tỏa, vì bình thường đối với người trưởng thành khỏe mạnh, các bệnh truyền nhiễm thường ít có triệu chứng hoặc có chăng chỉ là triệu chứng cảm nhẹ. Biểu hiện lâm sàng dao động từ triệu chứng trông giống như là bệnh cảm cúm nhẹ và/hoặc viêm não và màng não. Bệnh do Listeria hầu hết chỉ xuất hiện ở phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và người suy giảm hệ miễm dịch, nhưng đối với những người khỏe mạnh cũng có thể bị ảnh hưởng. Hình thức bệnh nghiêm trọng thể hiện rõ ràng nhất là ở bệnh viêm màng não và thường đi kèm theo nhiễm trùng máu. Tuy nhiên ở phụ nữ mang thai, mặc dù triệu chứng thường xuất hiện là bệnh giống như cúm nhẹ không bị viêm màng não, nhưng dễ có khả năng thai nhi bị bệnh và dẫn đến phải phá bỏ hoặc sinh non. Ở người bệnh do listeria biểu hiện rõ ràng nhất là do L. monocytogenes thường ít xảy ra, nhưng đã xuất hiện những đợt bùng phát thành dịch. Vào năm 1981, xuất hiện đợt bùng phát liên quan đến 100 người ở Canada. Ba phần tư những trường hợp bị nhiễm bệnh là phụ nữ mang thai, trong trường hợp này có 9 thai nhi bị chết, 23 trẻ sơ sinh bị nhiễm trùng và 2 trẻ còn sống khỏe mạnh. Trong số 77 người trưởng thành không mang bầu bị nhiễm khuẩn đã biểu hiện bệnh do listeria một cách rõ ràng, tỷ lệ chết gần 30%. Nguồn bùng phát là từ xà lách trộn được sản xuất tại một nhà máy tại địa phương. Các biểu hiện bệnh do Listeria bao gồm nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm não và nhiễm trùng tử cung hoặc cổ tử cung ở phụ nữ mang thai dẫn đến khả năng xẩy thai hoặc phá bỏ thai nhi. Khởi đầu các biểu hiện này thường xuất hiện các triệu chứng tương tự như các bệnh cúm bao gồm sốt kéo dài. Có thể xuất hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, nôn mữa và tiêu chảy là những triệu chứng biểu hiện sớm bệnh nghiêm trọng do Listeria gây ra hoặc có thể là những triệu chứng thoáng qua. Các triệu chứng này có thể kéo dài hơn 12 giờ. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 7 2.2. Phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogens trong thực phẩm 2.2.1. Theo ISO 11290 -1:2004 Phương pháp này (tham chiếu theo ISO 11290-1:2004) được áp dụng để định tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm dành cho người và thức ăn gia súc. 2.2.1.1. Nguyên lý Phương pháp này thực hiện qua các giai đoạn: · Tăng sinh: giai đoạn này là cần thiết vì Listeria monocytogenes thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và dễ bị tổn thương trong quá trình chế biến cùng sự tồn tại một số lượng các loại vi sinh vật khác, do đó bước tăng sinh đầu tiên rất quan trọng làm tăng sự phát triển của vi khuẩn. · Phân lập: Mục đích của giai đoạn này nhằm phân biệt vi khuẩn Listeria spp và các vi khuẩn không phải là Listeria spp. Thông qua các đặc điểm của khuẩn lạc. Do đó, môi trường phân lập có chứa các thành phần sao cho Listeia spp. có thể sinh trưởng tạo thành các khuẩn lạc rời rạc đồng thời ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn không phải là Listeria spp. tồn tại được trong giai đoạn tăng sinh. Phân lập trên hai môi trường chọn lọc ALOA, Oxford (hoặc Palcam). · Khẳng định: cấy chuyển khuẩn lạc Listeria monocytogenes nghi ngờ sang thạch không chọn lọc để làm thuần vi khuẩn và thực hiện các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa để định danh. Khẳng định là Listeria spp. bằng các thử nghiệm Henry-illumination, catalase, nhuộm Gram, khả năng di động phương pháp giọt treo. Sau khi các thử nghiệm trên đều nghiệm đúng Listeria spp., kế tiếp khẳng định Listeria monocytogenes qua các thử nghiệm bổ sung sau: khả năng tan huyết, khả năng biến dưỡng đường, thử nghiệm CAMP, di động trong ống nghiệm tạo hình tán dù. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 8 2.2.1.2. Sơ đồ quy trình phân tích theo ISO 11290-1:2004 (II) (I) Quy trình (I) và (II) thực hiện song song nhau. Nếu quy trình (I) cho kết quả dương tính thì ngưng không tiếp tục thực hiện quy trình (II), nếu quy trình (I) cho âm tính thì phải tiếp tục quy trình (II). Thời gian cho kết quả của phương pháp từ 4- trên 7 ngày. 2.2.1.3. Thuyết minh quy trình phân tích A. Tăng sinh lần 1: Cân 25gam mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml Half Fraser. Đồng nhất mẫu trong khoảng 30-60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu. Ủ dịch mẫu trong tủ ủ ở 30 ± 1 0 C trong 24 ± 2giờ. Sau bước tăng sinh lần 1 thực hiện hai quy trình (I), (II). Ủ 25 0 C, 8-24 giờ (TSYEB) Ủ 37 0 C, 24 giờ (TSYEA) A.Tăng sinh lần 1 25 g mẫu + 225ml Half Fraser B.Tăng sinh lần 2 0,1ml dịch tăng sinh lần 1 + 10ml Fraser C. Cấy ria trên ALOA + Palcam hoặc Oxford Đồng nhất (30-60 giây) Ủ 30 0 C, 24 giờ D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB C. Cấy ria trên ALOA + Palcam hoặc Oxford Ủ 37 0 C, 48 giờ Ủ 37 0 C, 24-48 giờ Ủ 37 0 C, 24-48 giờ F. Khẳng định: - Henry illumination - Catalase - Gram - Tan huyết - Khả năng sử dụng đường Xylose, Rhamnose - Thử nghiệm CAMP - Di động D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB Ủ 25 0 C, 8-24 giờ (TSYEB) Ủ 37 0 C, 24 giờ (TSYEA) F. Khẳng định G. Đọc kết quả G. Đọc kết quả Hình 2.2.1.2: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 9 B. Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml từ dịch tăng sinh lần 1 sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường Fraser để tăng sinh lần 2. Ủ ống nghiệm trong tủ ủ ở 37 ± 1 0 C trong 24 giờ. C. Cấy ria trên ALOA, Oxford hoặc Palcam: Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy nhựa vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lần 1 theo quy trình (I) và dịch mẫu tăng sinh lần 2 theo quy trình (II) sang môi trường thạch ALOA và Oxford hoặc Palcam sao cho khuẩn lạc mọc rời, ủ trong tủ ủ ở 37 ± 1 0 C trong 24 giờ. D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford hoặc Palcam. Thường sau 24 giờ ủ phải kiểm tra. Nếu khuẩn lạc mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc nào thì phải ủ tiếp 48 giờ. Sau khi ủ ghi nhận các khuẩn lạc điển hình trên các loại môi trường thạch. E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ Listeria monocytogenes trên mỗi loại môi trường phân lập dùng que cấy lấy ½ khuẩn lạc cấy ria trên môi trường TSYEA (ủ ở 37 ± 1 0 C trong 18-24 ± 2 giờ) và ½ khuẩn lạc còn lại cấy vào TSYEB (ủ ở 25 ± 1 0 C trong 18- 24 ± 2 giờ). F. Khẳng định - Thử nghiệm Henry-illumination Kiểm tra khuẩn lạc Listeria spp bằng nguồn sáng trắng, kiểm tra khuẩn lạc theo hướng vuông gốc với đĩa thạch hoặc trực tiếp bằng mắt thường hoặc qua kính hiển vi phân tích (có gương riêng) hoặc kính hiển vi có độ phân giải thấp. Nguồn sáng chiếu vào đĩa thạch với góc nghiêng 45 0 , quan sát theo hướng vuông góc với đĩa thạch. Trên môi trường TSYEA khuẩn lạc Listeria spp. điển hình qua nguồn ánh sáng trắng có màu xanh óng ánh (xanh xám đến xanh). - Thử nghiệm Catalase + Thực hiện: Lấy sinh khối ở tâm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng sau 18-24 giờ ủ. Chuyển sinh khối lên miếng lam. Nhỏ lên sinh khối một giọt H 2 O 2 3% (dùng ống nhỏ giọt hoặc pipette Pasteur). Quan sát nhanh sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả. Bỏ miếng lam vào dung dịch khử trùng. + Kết quả: Dương tính khi có hình thành bọt khí (O 2 ). Âm tính khi không có hình thành bọt khí. - Nhuộm Gram (thử nghiệm KOH) Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056 Trang 10 Thử nghiệm KOH dùng để phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm: nhỏ 1-2 giọt KOH 3% lên lam kính, sau đó lấy khuẩn lạc đã được làm thuần từ TSYEA trộn vào thuốc thử KOH trên lam. Sau khi trộn nếu gặp hiện tượng đặc quánh kéo thành dây thì dùng khuyên cấy nhích lên là phản ứng dương tính và ngược lại là phản ứng âm tính. Vi khuẩn gram (-): thử nghiệm KOH dương tính Vi khuẩn gram (+): thử nghiệm KOH âm tính Listeria spp cho phản ứng gram (+) - Thử tính di động ü Khả năng di động phương pháp giọt treo: Lấy một khuyên dịch từ TSYEB đặt lên lamem và quan sát dưới kính hiển vi. Listeria spp là những tế bào hình que, mảnh, ngắn và thể hiện những chuyển động xoay quanh trục thân thành từng đợt (luân phiên nghĩ và động) rất đặc trưng. ü Thử tính di động trong ống nghiệm: Lấy vi khuẩn đã được làm thuần từ TSYEA đâm sâu vào thạch của ống nghiệm chứa môi trường Motility agar. Ủ ở 25 0 C ± 1 0 C trong 48 giờ. Kiểm tra sự phát triển xung quanh đường cấy đâm sâu. Thử nghiệm là dương tính khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy làm môi trường có màu đỏ cam và tạo hình tán dù. - Thử nghiệm tan huyết Dùng que cấy ria lấy sinh khối từ khuẩn lạc trên môi trường làm thuần TSYEA cấy ria lên đĩa thạch Blood Agar. Ủ đĩa trong tủ ở 37 ± 1 0 C trong 24 ± 2 giờ. Kết quả: Listeria monocytogenes cho thấy vùng sáng, trong và hẹp (dung huyết beta) - Thử nghiệm sử sụng đường Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối từ môi trường TSYEB cấy lần lược sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Xylose và sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Rhamnose. Ủ các ống trong tủ ủ ở 37 ± 1 0 C trong 24 – 48 giờ. Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng. Âm tính khi dung dịch đường không đổi màu. Listeria monocytogenes Xylose (-), Rhamnose (+). - Thử nghiệm CAMP [...]... trắng không gây nhiễm Listeria monocytogenes d) Thu thập số liệu Tống số cho kết quả dương tính 3.2.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 a) Mục đích Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo tiêu chuẩn... đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono a) Mục đích Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono với vi khuẩn Listeria monocytogenes và các chủng vi sinh vật khác không phải Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân. .. nghiệp Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Đại Học Cần Thơ Khoa Thủy Sản 4.4 Kết quả thí nghiệm 3: Xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono Do phương pháp này ứng dụng để phát hiện định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes nên chúng tôi bố trí thí nghiệm lặp lại ở giá trị lớn hơn LOD50 để kiểm tra sự ổn định của phương pháp Thí nghiệm được lặp... lạc 3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono a) Mục đích thí nghiệm Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD50) của phương pháp thông qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện SVTH: Hồ Linh Phương MSSV: 2052056 Trang 20 GVHD: Th.s Phạm... phương pháp RAPID’L.mono so với 4 – trên 7 ngày bằng phương pháp phân tích theo ISO 112901:2004 SVTH: Hồ Linh Phương MSSV: 2052056 Trang 35 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Đại Học Cần Thơ Khoa Thủy Sản Phần 5: KẾT LUẬN CHUNG Phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono được so sánh với phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria. .. spike chủng được phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono Dựa vào các số liệu phân tích và áp dụng công thức tính LOD50 để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp Hình 3.2.2: Sơ đồ thí nghiệm 2 c) Cách tiến hành -Xác định hàm lượng tế bào từ 10-100 tế bào/ml dựa vào độ đục McFarland Độ đục chuẩn McFarland 0.5 có thể mua từ nhà sản xuất Nếu tự... tròn Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và CAMP (-) với R.equi G Đọc kết quả: Phát hiện hay không phát hiện Listeria monocytogenes trong 25 gam mẫu 2.2.2 Phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono theo AOAC Môi trường RAPID’L.mono sản xuất bởi phòng thí nghiệm Bio-Rad 2000 Alfred Nobel Drive Hercules, Ca 94547 RAPID’L.mono là môi trường được thiết kế đặc hiệu nhằm phát hiện. .. 10 lần phân tích với L= 29 tế bào Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm 3 Mật độ gây nhiễm Số lần lặp lại 29 tế bào/ml 10 Tỉ lệ dương tính 10/10 Kết luận: Với 10 lần phân tích với L=29 tế bào/ml thì kết quả dương tính là 10 (100%) 4.5 Kết quả thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 Phương pháp định... định được phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên môi trường RAPID’L.mono có độ đặc hiệu, độ nhậy, độ lặp lại nằm trong chuẩn mực cho phép tương đương với phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 Bảng 4.5 Bên cạnh đó chúng tôi cũng đã tiến hành phân tích song song 10 mẫu cá tra phi lê đông lạnh nhiễm Listeria monocytogenes và Listeria. .. nhiễm Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii trên ALOA , Oxford cho kết quả đúng với thử nghiệm sinh hóa là 80% (ALOA), 70%(Oxford) Kết luận: phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono so với phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004: · Cho kết quả phân tích tương đồng với nhau · Thời gian cho kết quả 2-3 ngày bằng phương . tiến hành nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L .mono để phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản . 1.2. Mục tiêu của. nhiều phương pháp đã được thiết kế theo hướng cho kết quả phân tích nhanh. Vì vậy việc ứng dụng phương pháp phân tích nhanh vào kiểm nghiệm thực phẩm là vấn