BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ  Phan Quốc Thơng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, ĐẶC TRƯNG VÀ KHẢO SÁT TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HỆ DẪN THUỐC NANO ĐA CHỨC NĂNG NỀN COPOLYME PLA-PEG CĨ VÀ KHƠNG CĨ HẠT TỪ (Fe3O4) Chun ngành: Vật liệu điện tử Mã số: 9.44.01.23 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – 2019 Luận án hồn thành tại: Phòng Vật liệu nano y sinh, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TSKH Nguyễn Xuân Phúc TS Hà Phương Thư Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện Học Viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Hà Nội, Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Thư viện Viện Khoa học vật liệu, Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mở đầu Trong vài thập niên trở lại đây, hệ vật liệu kích thước nano phân phối thuốc quan tâm phát triển mạnh Trong tất hệ vật liệu phân phối thuốc kích thước nanomet, hệ polyme, hệ hạt vàng, hệ hạt từ quan tâm Đặc biệt, hệ phân phối thuốc nanomet hạt nano sắt từ (Fe3O4) quan tâm phát triển mạnh năm gần với nhiều ưu điểm vượt trội dễ dàng phát triển thành hệ nano phân phối thuốc đa chức ứng dụng cho mục đích chẩn đoán điều trị bệnh Polyme phân hủy sinh học sử dụng để thiết kế hệ phân phối thuốc kích thước nano với đặc tính ưu việt so với hệ phân phối thuốc truyền thống như: kiểm sốt phóng thích thuốc, tự phân hủy không gây độc sau sử dụng, giảm liều dùng phụ thuộc bệnh nhân vào thuốc cải thiện Trong số polyme phân hủy sinh học phải kể đến polylactic axit (PLA), poly(lactic-co-glycolic) (PLGA), … quan quản lý thuốc thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép ứng dụng dược phẩm lưu hành thị trường Việc chức hóa bề mặt polyme phân hủy sinh học PLA PEG (polyethylene glycol) để cải thiện hạn chế polyme phân hủy sinh học quan trọng PEG polyme ưu nước, độc tính thấp, khơng kích thích miễn dịch FDA cho phép lưu hành Copolyme PLA-PEG sau tổng hợp sử dụng hệ dẫn thuốc ứng dụng cho mục đích chẩn đoán điều trị bệnh Trong nội dung luận án, copolyme PLA-PEG sử dụng để mang Curcumin (một dược chất có tính chất chống ơxy hóa tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư) gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ dẫn thuốc hướng đích Cur/PLA-PEG-Fol kích thước nano sử dụng để tiêu diệt tế bào ung thư Hep-G2 (dòng tế bào ung thư gan người) Hơn nữa, copolyme PLA-PEG sử dụng để bọc hạt nano sắt từ Fe3O4 tạo thành hệ dẫn thuốc Fe3O4@PLA-PEG kích thước nano với phần lõi hạt nano sắt từ Fe3O4 bọc lúc hạt nano sắt từ Fe3O4 Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc đa chức Cur/Fe3O4@PLA-PEG Hệ thuốc nano sử dụng cho mục đích chẩn đốn hình ảnh cộng hưởng từ MRI, cho khả tăng nhiệt chỗ chiếu từ trường ngồi, ứng dụng nhiệt trị ung thư phóng thích thuốc Curcumin Với ý nghĩa đó, đề tài nghiên cứu dẫn dắt tập thể thầy hướng dẫn chọn tên luận án: “Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng khảo sát tiềm ứng dụng hệ dẫn thuốc nano đa chức copolyme PLA-PEG có khơng có hạt từ (Fe3O4)” Mục tiêu luận án: 1) Tổng hợp copolyme PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác vùng 3:1-1:3 Chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin có khơng gắn yếu tố hướng đích Folat Nghiên cứu khả mang Curcumin hệ nano copolyme PLAPEG, nghiên cứu khả phóng thích Curcumin hệ nano copolyme khơng có gắn Folat Nghiên cứu độc tính tế bào in vitro hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin khơng có gắn Folat dòng tế bào ung thư gan người HepG2 2) Tổng hợp hạt nano Fe3O4 chế tạo chất lỏng từ có độ bền cao hạt Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG tạo thành hệ nano Fe3O4@PLA-PEG Chế tạo hệ chất lỏng từ đa chức Fe3O4@PLA-PEG/Cur hạt nano Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG mang Curcumin 3) Nghiên cứu khả gây độc tế bào ung thư hệ nano Fe3O4 bọc copolyme mang thuốc (Cur) Nghiên cứu khả ứng dụng làm tác nhân tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân, nghiên cứu hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ khả phóng thích thuốc (Curcumin) Thử nghiệm độc tính, khả nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào ung thư, tiêu diệt khối u chuột thử nghiệm dựa hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ ứng dụng nhiệt trị ung thư (hyperthermia) Nội dung luận án: Chương trình bày tổng quan giới thiệu số hệ dẫn thuốc, polyme phân hủy sinh học sử dụng cho mục đích tổng hợp hệ dẫn thuốc kích thước nano, lợi hệ dẫn thuốc chức hóa bề mặt, vai trò chất chức hóa bề mặt poly(ethylene glycol), tinh bột, polysaccarit, … lợi hệ dẫn thuốc kích thước nano, hệ nano copolyme mang thuốc hướng đích Tiềm tính ưu việt hệ nano copolyme PLA-PEG mang thuốc gắn yếu tố hướng đích Hệ chất lỏng từ hạt nano Fe3O4 chức hóa bề mặt copolyme PLA-PEG có khơng mang Curcumin trình bày tổng quát Trong chương 2, quy trình tổng hợp copolyme PLAPEG quy trình chế tạo hệ mẫu, quy trình thử nghiệm sinh học dòng tế bào ung thư chuột mang khối u, nguyên lý phép đo nhằm phân tích biện luận kết luận án trình bày chi tiết Chương 3, chương chương trình bày kết nghiên cứu thu nhận luận án thảo luận liên quan Chương trình bày kết nghiên cứu tổng hợp copolyme PLAPEG, chế tạo hệ nano dẫn thuốc PLA-PEG mang Curcumin có khơng gắn yếu tố hướng đích Folat với đặc trưng kích thước, hình dạng, cấu trúc, khả phân tán độ bền phân tán trình bày, phân tích biện luận chi tiết, thử nghiệm dòng tế bào ung thư gan G-Hep2 Các kết nghiên cứu chương liên quan đến vật liệu nano Fe3O4 tổng hợp phương pháp đồng kết tủa, bọc copolyme PLA-PEG có mang khơng mang Curcumin tạo thành hệ chất lỏng từ kích thước nano đa chức Các đặc trưng hình dạng, kích thước, cấu trúc, tính chất từ, hiệu ứng tăng cường độ tương phản cộng hưởng từ hiệu ứng đốt nóng từ định hướng ứng dụng y sinh trình bày, phân tích biện luận chi tiết Chương trình bày kết thử nghiệm sinh học hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG tế bào ung thư chuột mang khối u, thử độc tính tế bào, độc tính cấp, chụp ảnh cộng hưởng từ tế bào khối u chuột Ý nghĩa nghiên cứu luận án Hạt nano copolyme PLA-PEG tổng hợp với tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác ảnh hưởng đến khả mang thuốc (Curcumin, hạt nano sắt từ Fe3O4), khả thâm nhập tế bào ung thư (Hep-G2) khả phóng thích thuốc Hạt nano copolyme PLA-PEG mang thuốc hướng đích hệ nano mang thuốc đa chức với ưu điểm vượt trội so với hệ phân phối thuốc truyền thống hệ phân phối thuốc polyme Cụ thể: Tăng cường khả lưu thông máu, tránh đào thải thực bào tế bào hệ lưới nội mô, giảm đáng kể protein lắng đọng bề mặt Hạt nano copolyme PLA-PEG sử dụng để mang Curcumin gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ dẫn thuốc nano mang thuốc hướng đích, bọc hạt nano từ Fe3O4 tạo thành hệ dẫn thuốc nano mang Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc đa chức ứng dụng chẩn đốn hình ảnh cộng hưởng từ MRI, khả tăng nhiệt chỗ tác dụng từ trường sử dụng cho mục đích nhiệt trị chỗ tiêu diệt tế bào ung thư, nhiệt từ trị (hyperthermia) tiêu diệt khối u chuột thử nghiệm, tăng cường phóng thích Curcumin Đóng góp luận án Đã tổng hợp copolyme PLA-PEG phương pháp trùng ngưng với tỷ lệ thành phần PLA-PEG khác Đã chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG phương pháp bay dung môi dạng mixen với cấu trúc lõi-vỏ, mang Cucurmin tạo thành hệ nano mang thuốc Cur/PLA-PEG gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ nano mang thuốc hướng đích Cur/PLA-PEG-Fol Đã tổng hợp thành cơng hạt nano sắt từ Fe3O4 phương pháp đồng kết tủa với từ độ đạt khoảng 65 emu/g, bọc copolyme PLA-PEG có khơng có mang Curcumin tạo thành hệ chất lỏng nano từ đa chức cấu trúc lõi-vỏ Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur với giá trị độ phục hồi r cao chất thương phẩm Resovist Ferumoxytol ứng dụng chẩn đốn hình ảnh MRI Đốt nóng cảm ứng từ hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG/Cur làm tăng nhiệt chỗ tăng hiệu giải phóng thuốc (Curcumin) Sử dụng hệ chất lỏng nano từ đa chức Fe3O4@PLA-PEG ứng dụng nhiệt trị giúp tiêu diệt hiệu tế bào khối u chuột Bố cục luận án: Luận án gồm 132 trang, bao gồm: phần mở đầu, chương nội dung, kết luận cuối danh sách tài liệu tham khảo Các kết luận án cơng bố báo tạp chí nước quốc tế báo khác có liên quan Chương TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ HỆ DẪN THUỐC 1.1 Hệ dẫn thuốc 1.1.1 Hệ dẫn thuốc kích thước thơng thường - Các thiết bị phân phối thuốc La cá thiết bị dùng để đặt thuốc vào phân phối, cấy thuốc vào mô bên thể Một số thiết bị sử dụng để phân phối thuốc như: Cảm biến sinh học phân phối thuốc; Thiết bị phân phối thuốc dựa vi dòng; Vi chip kiểm sốt phóng thích thuốc; Các bơm ống dẫn phân phối thuốc - Các hệ phân phối thuốc hướng đích Đối với hệ phân phối thuốc hướng đích kiểm sốt, loạt hệ chất mang phát triển như: Các chất liên kết, kháng thể đơn dòng, vi hạt hình cầu liposome Ngồi ra, có nhiều hệ thống tinh vi dựa chế phân tử, công nghệ nano, liệu pháp phân phối gen phát triển - Các hệ phân phối thuốc chuyên biệt Là hệ thống phân phối thuốc đến vị trí thể chọn lọc (gan, lách, xương, lympho) Do kích thước nhỏ, chúng tiêm trực tiếp vào thể, hệ thống phân phối thuốc chuyên biệt bao gồm thuốc vật liệu lõi thuốc phân tán chất nhũ tương bên vật liệu mang thuốc gói gọn vật liệu mang 1.1.2 Hệ dẫn thuốc kích thước nano (HDTNN) - Tính ưu việt tiềm HDTNN + Tính ưu việt HDTNN DHTNN có đặc tính ưu việt sau: i) kéo dài lưu thông máu; ii) đóng gói bảo vệ loạt tác nhân điều trị với tải trọng cao; iii) tối ưu hóa tổ hợp tính chất vật lý chất mang để tận dụng hai chế nhắm đích chủ động thụ động; iv) đáp ứng với kích thích chỗ cho phóng thích thuốc kiểm soát; v) khả chịu đựng nhiều gốc thuốc tương phản/chụp ảnh/quan sát phương tiện loạt kỹ thuật hình ảnh đa phương thức + Tiềm HDTNN Các hệ thống phân phối thiết kế để cung cấp, phóng thích có kiểm sốt phóng thích kích hoạt phân tử điều trị, tăng thời gian lưu trú máu, giảm phân phối khơng đặc hiệu, nhắm đích mơ kháng nguyên bề mặt tế bào đích với yếu tố gắn kết nhắm đích, qua tăng khả hiệu điều trị thuốc Hình 1.3 Sơ đồ hệ dẫn thuốc nano đa chức - Các vật liệu bảo đảm chức hệ dẫn thuốc nano + Vật liệu cho chức thích ứng mơi trường sinh hóa Hệ dẫn thuốc nano cấu trúc lõi-vỏ, với phần lõi polyme phân hủy sinh học chức hóa polyme ưa nước polyethylene glycol (PEG) ghép, tạo phức, hấp thụ lên bề mặt hạt nano để tạo nên ổn định khơng gian hình thành nên thuộc tính "tàng hình" giúp tăng thời gian lưu thơng máu tương thích sinh học + Vật liệu cho chức hóa trị liệu Một số phân tử thuốc kháng ung thư bao gồm doxorubicin, dopamine Curcumin sử dụng điều trị hỗ trợ điều trị ung thư Trong loại thuốc nêu trên, Curcumin xem dược chất kháng ung thư tiềm có nguồn gốc thiên nhiên + Vật liệu cho chức lý trị liệu Hệ dẫn thuốc nano chức mang, giúp phân tán lưu thông dược chất (thuốc) môi trường sinh lý tốt hơn, chúng mang (bọc) tác nhân lý trị liệu khác hạt nano vàng, hạt nano từ + Vật liệu cho chức chẩn đốn hình ảnh Các hạt nano tăng độ tương phản hình ảnh hạt nano vàng, hạt nano từ sử dụng tác nhân chẩn đốn hình ảnh + Vật liệu cho chức bám đích Hoạt động hướng đích hạt nano liên quan đến việc tạo phức phối tử nhắm đích với hạt nano, sử dụng từ trường để điều khiển hạt nano, đặc biệt hạt nano từ tính định vị vị trí đích, dựa vào đặc tính cấu tạo màng tế bào thực hoạt động nhắm đích 1.1.3 Các loại polyme nghiên cứu ứng dụng - Liposome: sử dụng hạt mang thuốc tiềm với lợi riêng chúng khả bảo vệ thuốc tránh bị đào thải sớm, nhắm đích đến vị trí cụ thể làm giảm độc tính tác dụng phụ - Polyme phân hủy sinh học: so với liposome, polyme phân hủy sinh học (polyme tự nhiên, polyme dendrit, copolyme) lợi liposome, giúp tăng độ ổn định thuốc/protein thuộc tính phóng thích kiểm sốt hữu ích 1.1.4 Copolyme phân hủy sinh học PLA-PEG - Polyme PLA: Polylactic axit (PLA) polyme phân hủy sinh học có nguồn gốc tự nhiên sử dụng để thiết kế hệ phân phối thuốc kích thước nano với đặc tính ưu việt so với hệ phân phối thuốc truyền thống không gây độc cho thể - Polyme PEG: PEG oligome ưa nước hấp thụ gắn liền với bề mặt hạt nano PEG làm giảm đáng kể tương tác không đặc hiệu với protein, tránh đào thải thực bào, tế bào hệ lưới nội mô, đồng thời tăng khả phân tán nước, qua tăng đáng kể khả lưu thơng máu - Tổng hợp copolyme PLA-PEG Copolyme PLA-PEG tổng hợp phản ứng mở vòng trùng ngưng axit lactic với polyethylenee glycol tạo thành block copolyme PLA-PEG với có mặt muối thiết II (Sn(Oct)2) đóng vai trò xúc tác Copolyme PLA-PEG với tỷ lệ thành phần trọng lượng PLA PEG khác tiến hành tổng hợp nhằm đánh giá ảnh hưởng hợp phần PLA PEG đến kích thước, khả mang thuốc khả tương thích sinh học hệ nano copolyme PLA-PEG mang thuốc hướng đích Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp copolyme PLA-PEG phương pháp trùng ngưng mở vòng polyme 1.2 Hệ dẫn thuốc nano từ tính 1.2.1 Hạt nano từ - Cấu trúc: Fe3O4 hợp chất ơxít phổ biến ngun tố sắt, vật liệu thuộc họ ferrite spinel có hai phân mạng từ không tương đương tương tác phân mạng phản sắt từ Vật liệu Fe3O4 có cấu trúc spinel đảo Cơng thức phân tử: FeO Fe2O3 = Fe Fe2O4, Mơ hình ion: [Fe3+]A[ Fe3+Fe2+]B O42- 11 mang curcumin tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur Các hạt nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol, Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur đặc trưng hình thái, kích thước hạt phương pháp hiển vị điện tử FE-SEM, phổ tán xạ laze động (DLS – Dynamic Light Scattering), độ bền phân tán hệ nano đặc trưng Zeta Cấu trúc hạt nano đặc trưng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS (Ultraviolet-Visible), khả mang curcumin copolyme PLA-PEG hạt nano Fe3O4@PLA-PEG xác định phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS thông qua việc xây dựng phưng trình đường chuẩn Nghiên cứu khả giải phóng chậm curcumin từ hệ dẫn thuốc nano thực hai phương pháp ủ nhiệt (giải phóng chậm thụ động) phương pháp đốt nóng cảm ứng từ (giải phóng chậm chủ động dựa vào nhiệt) Thử nghiệm độc tính tế bào hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol thực dòng tế bào Hep-G2 (dòng tế bào ung thư gan người) sử dụng phương pháp Skehan cộng 1990 phương pháp Likhiwitayawuid cộng năm 1993 Cấu trúc hạt nano sắt từ Fe3O4 xác định phương pháp nhiễu xạ tia X, tỷ lệ khối lượng lớp vỏ bọc PLA-PEG lượng curcumin mang vào xác định phương pháp phân tích nhiệt vi lượng (TGA - Thermal Gravimetric Analysis) Từ độ bảo hòa hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur xác định phép đo từ kế mẫu rung (VSM – Vibrating Sample Magnetometer), khả tăng nhiệt hạt nano thực phương pháp đốt nóng cảm ứng từ MIH – Magnetic Inductive Heating) Các phép đo đánh giá tốc độ hồi phục cộng hưởng từ hạt nhân chụp ảnh MRI mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur thực thiết bị cộng hưởng từ Bruker Biospec, tần số từ trường xoay chiều 300 MHz, từ trường tĩnh 12 tesla Trung tâm chụp ảnh động vật, thuộc Trường Đại học Đông Bắc, Thành phố Boston, Hoa Kỳ Thử nghiệm sinh học gồm thử độc tính tế bào, độc tính cấp, phương pháp nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào, nhiệt từ trị tiêu diệt khối u rắn thực Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội cho kết khả quan, mở hướng ứng dụng hạt nano sắt từ lĩnh vực y sinh Chương NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ NANO COPOLYME PLA-PEG ĐA CHỨC NĂNG 3.1 Chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol Hình 3.1 Mơ tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLAPEG-Fol 3.2 Cấu trúc, hình thái học đặc trưng tính chất hạt nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol Hạt nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol đặc trưng ảnh FE-SEM cho thấy có dạng hình cầu đơn phân tán, kích thước trung bình 100 nm Tuy nhiên, hạt nano PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác có kích thước khác Kích 13 thước hạt nano PLA-PEG chủ yếu thành phần kỵ nước PLA định chủ yếu So với kết ảnh SEM, kết đo phân bố kích thước hạt phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) cho thấy kích thước (thủy động) hạt có xu hướng tăng lên Khả mang thuốc hạt nano PLA-PEG Khi tăng thành phần PLA copolyme PLA-PEG phần lõi PLA tăng lên, mang Curcumin vào tăng mối liên kết kỵ nước phần lõi PLA với Curcumin, qua làm tăng lượng Curcumin mang vào tăng hiệu mang thuốc Bảng 3.4 Kích thước hạt, lượng Curcumin hiệu mang Curcumin hệ copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol Lượng Cur Kích thước hệ nano (nm) Tỷ lệ mang vào PLA/PEG PLA-PEG Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol (mg/mL) 3:1 2:1 1:1 1:2 1:3 59 55 50 49 49 69 65 61 60 60 86 82 80 80 80 0,73 0,63 0,43 0,40 0,39 Hiệu mang thuốc (%) 91,3 78,8 53,8 50 48,8 Kết phân tích phổ hồng ngoại FT-IR Các phổ đo cho thấy, sau mang vào copolyme PLA-PEG đỉnh hấp thụ Curcumin dịch chuyển từ 431 nm tới 426 nm, tương tự trường hợp axit folic đỉnh hấp thụ dịch chuyển từ 283 nm tới 276 nm sau gắn vào copolyme PLA-PEG, qua cho thấy có gắn kết axit folic vào copolyme PLA-PEG Curcumin mang vào copolyme PLA-PEG Kết phân tích phổ hồng ngoại FT-IR Các phổ hồng ngoại (FT-IR) PEG copolyme PLA-PEG cho thấy dao động nhóm C-O-C PEG xuất vị trí 1097 cm1 dịch chuyển tới vị trí 1114 cm-1 copolyme PLA-PEG, mặt khác dao động nhóm –CO-O- (nhóm cacboxyl) PLA xuất vị trí 1554 cm-1 dịch chuyển tới vị trí 1539 cm-1 copolyme PLA-PEG liên kết C-H vị trí 2924 cm-1 PLA dịch chuyển tới 14 vị trí 2978 cm-1 PLA-PEG Vị trí 1539 cm-1 dao động đặc trưng hình thành phản ứng trùng ngưng Qua đó, nói copolyme PLA-PEG tạo thành thơng qua phản ứng trùng ngưng mở vòng polyme hóa PEG mono axit lactic Các kết phân tích FT-IR mẫu Curcumin Cur/PLA-PEG, axit folic, PLA-PEG-Fol cho thấy Curcumin mang vào copolyme PLA-PEG Fol gắn thành công lên hệ mi-xen PLA-PEG 3.3 Nghiên cứu giải phóng chậm curcumin Kết nghiên cứu thuộc tính giải phóng chậm in vitro Curcumin từ hệ nano Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol bảng 3.5, 3.6 Hình 3.21A, 3.21B cho thấy, lượng Curcumin giải phóng chậm sau 48 có xu hướng bão hòa hai hệ nano Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol, hệ nano Cur/PLA-PEG tỷ lệ nhả chậm Curcumin đạt cao 91,1% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1 thấp 83,2% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG 1:3, kết tương ứng hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol 89,1% 72,3% Hình 3.21 Tỷ lệ % giải chậm Cur từ hệ Cur/PLA-PEG (A) Cur/PLA-PEGFol (B) 37oC 3.4 Nghiên cứu khả gây độc tế bào ung thư hệ nano Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol Đã tiến hành nghiên cứu khả gây độc tế bào in vitro với mục tiêu đánh giá khả ức chế tế bào ung thư (Hep-G2, dòng tế bào ung 15 thư gan người) hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol so với Curcumin tự copolyme PLA-PEG, qua đánh giá vai trò hệ nano phân phối thuốc việc ức chế tiêu diệt tế bào ung thư Hình 3.24 Sự thay đổi hình dạng tế bào Hep-G2 tác dụng Cur/PLAPEG Cur/PLA-PEG-Fol Bảng 3.7 Giá trị IC50 hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol Cur/H2O Tỷ lệ PLA:PEG 3:1 2:1 1:1 1:2 1:3 Cur/PLA-PEG IC50 (μg/mL) 114,8±5,7 106,9±5,3 97,5±4,9 98,8±4,9 94,4±4,7 Cur/PLA-PEG-Fol IC50 (μg/mL) 19,0±0,9 14,2±0,7 12,8±0,6 12,1±0,6 12,7±0,6 Cur/H2O IC50 (μg/mL) 820,6±41,0 Chương NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT Fe3O4 4.1 Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur Hạt nano sắt từ chế tạo phương pháp đồng kết tủa Hạt nano Fe3O4 sau tổng hợp phân tán vào nước, chức 16 hóa PLA-PEG tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG mang curcumin tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur Hình 4.2 Mơ tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur 4.2 Cấu trúc, hình thái học đặc trưng tính chất mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur Phân tích XRD FT-IR Kết phân tích nhiễu xạ tia X phân tích phổ hồng ngoại cho thấy hạt nano sắt từ liên kết bọc PLA-PEG, cấu trúc tinh thể lõi hạt nano từ Fe3O4 khơng bị thay đổi Hình dạng, kích thước phân bố kích thước hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur Phân tích ảnh TEM cho thấy hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur có kích thước gần tương đương nhau, đạt khoảng 20 nm lớn khoảng nm so với hạt nano Fe3O4 (kích thước khoảng 15 nm), hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur có cấu trúc lõi-vỏ với phần lõi hạt nano Fe3O4 tin tiếp giáp với hợp phần PLA, phần vỏ bọc hợp phần PEG.Kết đo DLS mẫu hạt nano có phân bố kích thước hẹp cho thấy mẫu chuẩn bị tốt phân tán ổn định 17 Hình 4.5 Ảnh SEM, TEM phân bố kích thước hạt nano Fe 3O4, Fe3O4@PLAPEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng hình 1A, 1B, 1C; 2A, 2B, 2C Đặc trưng đóng góp khối lượng từ tính mẫu Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur Để xác định hàm lượng chất bọc phi từ PLA-PEG Curcumin dùng vào hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur, mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur phân tích nhiệt vi trọng (TGA) để tính phần trăm khối lượng hợp phần Fe 3O4, PLA PEG/Curcumin mẫu Kết cho thấy từ độ riêng hạt lõi Fe3O4 sau chức hóa thể tăng lên đáng kể, mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG tăng 13,6% (từ 64,4 lên 73,2 emu/g), với Fe3O4@PLA-PEG/Cur tăng 8,9% (từ 64,4 lên 70,4 emu/g) Kết nghiên cứu phù hợp với cơng bố tác giả Y PiđeiroRedondo cộng Bảng 4.3 Từ độ bão hòa: đo trực tiếp cho mẫu lõi-vỏ (Mcs); hiệu đính khối lượng vỏ danh định (Mccal) khối lượng vỏ thí nghiệm TGA (M cex) mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur Mẫu Fe3O4 Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur Mcs (emu/g) 64,4 64,5 52,9 mscal (%) 9,1 25 Mccal (emu/g) 64,4 70,4 70,5 msTGA (%) 13,5 24,9 Mcex (emu/g) 64,4 73,2 70,4 18 Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân hệ nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân chụp thiết bị Bruker Tesla theo chế độ trọng T mẫu Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLAPEG/Cur giới thiệu Hình 4.10 Mẫu nước có ảnh mầu trắng mẫu có nồng độ CLT C (S1) = µg/mL Hình 4.10 So sánh độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân theo chế độ trọng T1 T2 hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B) Kết cho thấy hệ nano CLT chứng tỏ hệ đa chức (tương phản MRI, mang nhả thuốc điều trị nhiệt từ - trình bày mục sau) ứng dụng cho chẩn đoán điều trị y sinh Kết đốt nóng cảm ứng từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur Hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ hạt nano Fe3O4@PLAPEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur sau phân tán nước nghiên cứu phương pháp đo lường nhiệt hệ đốt từ dùng từ trường xoay chiều cường độ từ – 800 Oe, tần số 310 kHz Trường ĐH Nam Florida Với kết trình bày, hiệu ứng đốt nóng hạt nano bọc đáng quan tâm chúng sử dụng hiệu điều trị nhiệt từ trị 19 Hình 4.13 Đường gia nhiệt hệ chất lỏng từ nồng độ mg/mL Fe 3O4@PLAPEG (A) Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B), đo với từ trường khác nhau, kết tính SAR cho nồng độ mg/mL mg/mL hệ nano Fe 3O4@PLA-PEG (C) Fe3O4@PLA-PEG/Cur (D) Đốt nóng cảm ứng từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur Các mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLAPEG/Cur phân tán nước tiến hành đốt nóng cảm ứng từ hệ đo RDO-HFI (tại Viện KH vật liệu) với từ trường cường độ 100 Oe tần số 178 kHz 80 75 (1) 70 (2) 60 NhiƯt ®é ( ) C 65 55 59 C 50 Vïng nhiƯt trÞ 45 410C 40 35 30 (1) Fe O4 @PLA-PEG (2) Fe3 O4 @PLA-PEG/Cur 25 200 400 600 800 1000 Thêi gian (gi©y) Hình 4.14 Đường gia nhiệt MIH hệ mẫu Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur 20 Kết cho thấy biết trước nồng độ hạt nano sắt từ Fe3O4 ta điều chỉnh từ trường áp vào để đạt nhiệt độ mong muốn, điều quan trọng cho việc ứng dụng hạt nano sắt từ nhiệt trị ung thư, ngưỡng chịu nhiệt tế bào ung thư tế bào lành khác nhau, thông thường tế bào ung thư ngưỡng chịu nhiệt không 42-460C, ngưỡng chịu nhiệt tế bào lành khoản từ 520C đến 700C Điều đóng vai trò quan trọng việc ứng dụng hạt nano sắt từ Fe3O4 nhiệt trị ung thư, giảm thiểu tác động đến tế bào lành, mở khả nhiệt trị ung thư Chương THỰC NGHIỆM SINH HỌC HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT Fe3O4 5.1 Kết thử nghiệm độc tính Độc tính tế bào Độc tính hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur hai dòng tế bào ni cấy BT-474 Sarcoma 180 kiểm tra hai kit MTT Luminescent Cell Viability Assay (PROMEGA) Kết tính tốn IC50 theo khuyến cáo hãng với kit sử dụng cho thấy hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG hồn tồn khơng gây độc hai dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC 50 mức lớn, phù hợp cho ứng dụng y sinh Quan sát trí với đánh giá số công bố trước đây, C Buzea cộng sử cơng bố độc tính hạt nano ứng dụng y sinh Độc tính cấp Thử nghiệm độc tính cấp hệ CLT nano Fe3O4@PLA-PEG tiến hành chuột nhắt trắng Swiss, thông qua việc xác định liều cận liều cận từ xác định giá trị LD 50 (liều gây chết trung bình) Từ đồ thị đường cong đáp ứng liều với hai lần lặp lại, giá trị LD50 21 (liều gây chết trung bình, tính theo cơng thức 2.8, mục 2.6, chương 2) tính tốn là: LD50 (Fe3O4 - PLA - PEG) = 120.945 ± 2.07 (mg/kg thể trọng), R2 = 0,95 Đối chiếu với thang độc tính Hodge Stener, thấy hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@ PEG-PLA có độc tính nhẹ thể chuột nhắt trắng Swiss Kết cho thấy hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@ PEG-PLA hoàn toàn sử dụng chế phẩm ứng dụng y sinh học 5.2 Khả tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân Khả tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ Kết chụp ảnh MRI cho thấy hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG/Cur Fe3O4@PLA-PEG có tiềm ứng dụng lớn chụp ảnh cộng hưởng từ, ứng dụng chẩn đốn hình ảnh, mở hướng ứng dụng hệ CLT nano chẩn đốn hình Hình 5.3 Ảnh MRI hệ chất lỏng nano từ chụp theo chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s điều kiện: (A) Fe3O4@PLA-PEG, môi trường agarose 1,5 % chứa 2.106 tế bào Sarcoma 180; (B) Fe3O4@PLA-PEG, môi trường agarose 1,5 %, (C) Fe3O4@PLAPEG/Cur, môi trường agarose 1,5 % chứa 2.106 tế bào sarcoma 180; (D) Fe3O4@PLAPEG/Cur, môi trường agarose 1,5 % Nồng độ sắt từ: (1) 0,000 mg/mL; (2) 0,01 mg/mL; (3) 0,05 mg/mL; (4) 0,1 mg/mL; (5) 0,2 mg/mL; (6) 0,5 mg/mL Khả tăng tương phản ảnh chụp cộng hưởng từ khối u rắn Khối u rắn da 10 ngày tuổi có hình bán nguyệt, phần chân gắn vào phần da bụng chuột Khối u đặc, chưa hoại tử có cấu trúc tương đối đồng 22 Hình 5.4 Khả tăng tương phản MRI hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s, góc chụp 180o (cắt lớp theo trục đầu – đuôi chuột) (A) Ảnh trước tiêm hệ chất lỏng nano từ; (B) Ảnh sau tiêm hệ chất lỏng nano từ Kết cho thấy để nhiệt trị hiệu quả, nồng độ hệ chất lỏng nano từ phải đạt tối thiểu 250 µg/0,5 cm3 khối u, thời gian bắt đầu chiếu từ trường điều trị nên 15 phút sau tiêm 5.3 Khả điều trị ung thư nhiệt từ trị Khả tiêu diệt tế bào ung thư nhiệt từ trị Trong thử nghiệm này, Từ trường 80 Oe đạt nhiệt độ thích hợp tất nồng độ hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG khoảng 0,1 - mg/mL, từ trường 70 Oe đạt yêu cầu với nồng độ CLT lớn 0,5 mg/mL 60 Oe đạt yêu cầu với nồng độ mg/mL Kết cho thấy nồng độ mg/mL mg/mL cho hiệu tiêu diệt tế bào rõ ràng nhất, 36,2% 61,4 % chiếu từ trường 60 phút Sau ngừng đốt nhiệt, tế bào ung thư tiếp tục chết theo thời gian, thời điểm 60 phút kết thúc nhiệt từ trị, tỷ lệ tế bào chết tăng 40% so với thời điểm phút Từ kết cho thấy hệ chất lỏng nano đa chức lõi hạt Fe3O4 mở hướng nghiên cứu triển vọng ứng dụng to lớn nhiệt trị điều trị ung thư nói riêng lĩnh vực y sinh học nói chung Tiêu diệt khối u nhiệt từ trị sử dụng Fe3O4@PLA-PEG Kết thực nghiệm cho thấy: Thể tích khối u lơ điều trị giảm mạnh, đặc biệt có 50% cá thể đáp ứng tốt với điều trị khối u hoàn toàn biến sau ba lần chiếu từ trường Tại lần nhiệt trị đầu tiên, 23 bề mặt khối u điều trị xuất lớp vảy đen, lớp vảy lan rộng giảm thể tích khối, sau bong để lộ mô sẹo da chuột mọc lơng trở lại Hình 5.11 Ảnh khối u trước sau điều trị khối u ngày tuổi Kết nghiên cứu khẳng định phương pháp nhiệt từ trị sử dụng hạt nano lõi Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG cho triển vọng mở hướng ứng dụng y sinh, đặc biệt nhiệt từ trị điều trị ung thư Kết luận Từ kết nghiên cứu thảo luận, số kết luận rút sau: Đã tổng hợp hệ nano copolyme PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 1:3 có cấu trúc lõi-vỏ, với phần lõi kỵ nước PLA phần vỏ ưa nước PEG, kích thước hạt trung bình 100 nm Đã mang Curcumin vào hạt nano copolyme PLA-PEG, gắn yếu tố hướng đích Folat lên hệ copolyme PLA-PEG tạo thành hệ nano mang thuốc đa chức Kết thử nghiệm in vitro cho thấy hệ nano Cur/PLA-PEGFol có số IC50 tốt nhất, hiệu cao khoảng lần so với hệ nano Cur/PLA-PEG khảng 60 lần so với Cur/H2O 24 Trong hệ dẫn thuốc nano, hệ nano copolyme PLA-PEG 2:1 vừa đảm bảo khả mang thuốc vừa đảm bảo khả nhập bào Đã tổng hợp thành cơng hạt nano Fe3O4 kích thước khoảng 15 nm, chức hóa PLA-PEG có mang không mang Curcumin tạo thành hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur ứng dụng y sinh (tương phản MRI, mang nhả thuốc điều trị nhiệt từ) Kết đo độ hồi phục hệ nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLAPEG/Cur cho thấy độ hồi phục r2 mẫu Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA-PEG/Cur lớn chất thương phẩm (Resovist Ferumoxytol) Hạt nano Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLAPEG/Cur có khả tăng nhiệt chỗ dựa vào từ trường ngồi nên hồn tồn sử dụng hiệu nhiệt từ trị tăng khả giải phóng thuốc Hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLA- PEG/Cur không gây độc tế bào Sarcoma 180 BT-474, giá trị LD50 120.945 ± 2.07 mg/kg thể trọng Thí nghiệm MRI cho thấy hệ chất lỏng nano từ hoàn toàn tuân theo lý thuyết làm tăng độ tương phản hình ảnh hình chụp cộng hưởng từ Nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào ung thư hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG đạt hiệu rõ ràng nồng độ mg/mL mL/mL, từ trường cường độ 70 Oe, tần số 178 kHz thời gian chiếu từ trường nhiệt trị 60 phút Thí nghiệm nhiệt trị tiêu diệt khối u cho thấy 50% cá thể đáp ứng tốt với điều trị Tóm lại, luận án tổng hợp, chế tạo nghiên cứu cách hệ thống từ thành phần cho cấu trúc nano môi trường nước copolyme PLA-PEG, qua việc mang thuốc Curcumin đính yếu tố định đích Folat lên hệ nano (Chương 3) Sau đó, hai hệ tương tự tạo thêm yếu tố từ tính dung hạt nano 25 Fe3O4 đưa vào làm hạt lõi, Fe3O4@PLA-PEG Fe3O4@PLAPEG/Cur Các nghiên cứu trình bày chương chứng tỏ hệ nano phức hợp từ tính chế tạo chứa đựng phẩm ưu việt cho đa dạng ứng dụng sinh y tăng tương phản ảnh MRI, nhiệt từ trị hay điều khiển giải phóng thuốc từ xa CÁC CƠNG TRÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN Magnetic inductive heating of organs of mouse models treated by copolymer coated Fe3O4 nanoparticles, Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol (2017) 025013 (10pp) Ảnh hưởng poly (lactide) (pla) đến kích thước khả mang thuốc hạt nano copolyme poly (lactide)-poly (ethylene glycol) (PLA-PEG), Hội nghị VLCR & KHVL SPMS2013, Thái Nguyên 112013 Impact of PLA/PEG ratios on Curcumin solubility and encapsulation efficiency, size and release behavior of Curcumin loaded poly(lactide)- poly(ethylenglycol) polymeic micelles, International Journal of Drug Delivery (2014) 279-285 Characteristics and cytotoxicity of folate-modified Curcumin-loaded PLA- PEG micellar nano systems with various PLA:PEG ratios, International Journal of Pharmaceutics 507 (2016) 32–40 Structure and properties of Fe3O4 nanoparticles coated by PLA-PEG copolyme with and without loading of Curcumin J Sci Technol, 2016 54 (1A): p 268–276 ... tên luận án: Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng khảo sát tiềm ứng dụng hệ dẫn thuốc nano đa chức copolyme PLA- PEG có khơng có hạt từ (Fe3O4) Mục tiêu luận án: 1) Tổng hợp copolyme PLA- PEG với tỷ lệ... Chương NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ NANO COPOLYME PLA- PEG ĐA CHỨC NĂNG 3.1 Chế tạo hệ nano copolyme PLA- PEG, Cur /PLA- PEG Cur /PLA- PEG- Fol Hình 3.1 Mơ tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano. .. thuốc nano Cur /PLA- PEG, Cur/PLAPEG-Fol 3.2 Cấu trúc, hình thái học đặc trưng tính chất hạt nano PLA- PEG, Cur /PLA- PEG Cur /PLA- PEG- Fol Hạt nano PLA- PEG, Cur /PLA- PEG Cur /PLA- PEG- Fol đặc trưng ảnh FE-SEM