TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA : SINH – KTNN ***** HOÀNG THỊ THUÝ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ HÀM LƯỢNG MEN GIỐNG CHO Q TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Người hướng dẫn khoa học TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI 5- 2007 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành c¶m ơn cô giáo: TS Đinh Thị Kim Nhung, thầy giáo: Th.S Nguyễn Khắc Thanh tận tình hướng dẫn em trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu thời gian qua Xin chân thành c¶m ơn bạn sinh viên giúp đỡ tơi để khố luận hồn thành cách tốt đẹp Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2007 Sinh viên Hoàng Thị Thuý MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………….……….5 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………7 1.1.Khái quát chung rượu vang …………………………………………… 1.2 Một số đặc tính sinh học tế bào nấm men Saccharomyces serevisiae CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 18 2.1.Nguyên liệu, thiết bị hoá chất…………………………………………18 2.2.Phương pháp nghiên cứu …………….……………………………………19 2.3.Phạm vi nghiên cứu ………………………………………………………23 2.4 Địa điểm thực đề tài ……………………………………………….…23 2.5.Thời gian thực đề tài …………………………………………………23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………………24 3.1.Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học chủng nấm men lên men vang táo mèo ………………………………………………………………… 24 3.2.Ảnh hưởng số nhân tố trình nhân giống……………… 33 3.3.Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo …………………………… 38 3.4.Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men …………… 42 3.5.Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mơ phòng thí nghiệm ……… 44 3.6.Quy trình cơng nghệ lên men vang táo mèo …………………………….…45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………………… 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………48 Danh mục chữ viết tắt, bảng, đồ thị, biểu đồ , hình vẽ Danh mục chữ viết tắt Nxb: Nhà xuất SLTB: Số lượng tế bào HL: Hàm lượng Danh mục bảng Bảng 1.1 Thành phần hoá học loại Bảng 3.1.2.1.a Khả sinh trưởng phát triển chủng nấm men Bảng 3.1.2.1.b Khả lên men hàm lượng đường cao Bảng 3.1.2.1.c Thử hoạt lực lên men bốn chủng nấm men Bảng3.1.2.1.d Khả kết lắng bốn chủng nấm men Bảng 3.1.2.1.e Khả tạo hương thơm độ sản phẩm chủng nấm men Bảng 3.1.2.1.g Tổng hợp kết tuyển chọn chủng nấm men Bảng 3.1.3.2.a Khả lên men loại đường chủng TM4 Bảng 3.2.1 Ảnh hưởng hàm lượng K2S2O5 trình nhân giống Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng cao men bổ sung trình nhân giống Bảng 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ trình nhân giống Bảng 3.2.5.Ảnh hưởng hàm lượng oxy hồ tan q trình nhân giống Bảng 3.3.1 Động thái lên men vang ngày thứ Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng độ pH đến trình lên men vang táo mèo Bảng 3.4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ men giống tới trình lên men vang táo mèo Bảng 3.5 Kết phân tích rượu thành phẩm Danh mục đồ thị, biểu đồ Biểu đồ 3.1 Tốc độ sinh sản trung bình bốn chủng nấm men Biểu đồ 3.2.4 Số lượng tế bào trung bình sau 28 ni cấy giá trị pH khác Đồ thị 3.3.1 Tốc độ phát triển S.cerevisiae TM4 ngày Đồ thị 3.3.2 Động thái trình lên men vang táo mèo Danh mục hình ảnh Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng TM4 Hình 3.2 Chủng nấm men Hình 3.3 Ảnh chụp gel sau điện di soi tia uv ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Vang loại đồ uống có độ cồn nhẹ lên men trực tiếp từ dịch trái mà khơng phải trải qua q trình chưng cất Rượu vang có hàm lượng cồn thấp, nhiều vitamin chất khống có mùi thơm dễ chịu, có hương vị đặc trưng loại Rượu vang kích thích tiêu hố, tuần hồn, thần kinh Người ta biết làm rượu vang từ 3000 năm trước công nguyên Hàng năm giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rượu vang có 1/3 Pháp Angeri Ở Việt Nam ngành sản xuất vang thực năm 80 kỉ 20 với xuất vang mang nhãn hiệu (Thăng Long, Thanh Ba, Gia Lâm…) Nguồn nguyên liệu để sản xuất vang Việt Nam chủ yếu từ loại quả: nho, dâu, táo, lê, dứa, vải…[7] Thực tế cho thấy phần lớn loại có chứa đường, axit, vitamin, khống…và khơng có độc hại sử dụng để lên men vang, để có vang tốt khơng phải loại làm Do việc lựa chọn nguyên liệu phù hợp với yêu cầu công nghệ chất lượng sản phẩm vấn đề cấp thiết ngành sản xuất vang nước ta Mặt khác cần phải có quy trình cơng nghệ hồn thiện để sản xuất loại vang thực có chất lượng cao, bước hội nhập vào thị trường khu vực quốc tế Nguyên liệu mà lựa chọn nghiên cứu cho lên men rượu vang táo mèo (Docynia indica) Đây loại có hương vị thơm đặc trưng trồng nhiều tỉnh miền núi phía bắc nước ta với tổng diện tích 40.000 Nơi có diện tích trồng táo mèo nhiều tỉnh Yên Bái, Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La Tổng diện tích trồng táo mèo tiếp tục tăng năm gần [6] Nhu cầu tiêu dùng táo mèo chủ yếu ăn trực tiếp, ngâm rượu, ngâm dịch siro chiếm khoảng 35-40% tổng sản lượng thu hoạch, số lại thường chưa sử dụng hết nhiều nguyên nhân Trong ngành sản xuất vang nước ta phát triển với tốc độ nhanh thiếu nguyên liệu có chất lượng phù hợp để sản xuất rượu vang có chất lượng cao giá thành hạ Chính chúng tơi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng hàm lượng men giống cho trình lên men vang tỏo mốo Mc tiờu ca đề tài Phõn lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho lên men vang táo mèo, tiến hành định loại chủng nấm men phương pháp phân tử Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng nấm men tuyển chọn Lên men vang táo mèo với quy mơ phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình lên men vang táo mèo Đối tượng nghiên cứu - Quả táo mèo (Docynia indica) - Chủng nấm men có khả lên men vang táo mèo Ý nghĩa lý lun v thc tin ca đề tài - Nghiờn cứu đặc tính, sinh lý, sinh hố chủng nấm men có khả lên men vang táo mèo Kết nghiên cứu liệu góp phần bổ sung cho nghiên cứu nấm men ứng dụng nấm men đời sống - Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có địa phương nhằm sản xuất loại vang phù hợp thị hiếu người tiêu dùng, góp phần làm phong phú thị trường vang nước nâng cao thu nhập cho đồng bào dân tộc vùng cao CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ RƯỢU VANG 1.1.1 Thành phần rượu vang Thành phần chủ yếu rượu vang bao gồm: Cồn(etanol): lên men tự nhiên từ dịch trái khơng lẫn aldehit, este Độ cồn rượu vang từ 10-12o, nên nhiều người uống Chất bổ dưỡng: đường nguyên liệu để tạo nên loại rượu trình lên men vang Trong dịch chín chủ yếu loại đường khử: fructoza, glucoza, galactoza ngồi có đường kép: sacaroza…đường vang từ 62-132g/l Axit vô axit hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit citric, axit oxalic Hàm lượng axit tổng số từ 4-7g/l ( quy axit tartaric) Rượu vang giàu vitamin: vitamin có nước khơng bị q trình lên men phân huỷ mà điều chỉnh lại thành phần [ 3] Các axit amin: axit amin có vai trò quan trọng sinh sản phát triển nấm men Ngoài lượng axit amin có sẵn dịch quả, q trình lên men vang tạo thêm số axit amin làm cho vang thành phẩm có hương, vị đặc trưng Các axit amin như: Lizin, treonin, valin, acginin… [ 10] 1.1.2 Phân loại vang Có nhiều cách phân loại khác nhau, vào màu sắc sản phẩm mà phân thành loại: vang đỏ, vang hồng, vang trắng, tương ứng với loại vang có tiêu giới hạn màu sắc định Chẳng hạn vang đỏ loại vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thắm, vang trắng vang có màu vàng rơm đến vàng ánh, vang hồng có màu hồng đến đỏ tươi Căn vào độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axit…có vang mà phân thành loại vang: vang khô, vang dịu, vang ngọt… Xu hướng chung vang phân thành nhóm vang khơng có gas (trong vang thành phẩm khơng có CO2) vang có gas (trong vang thành phẩm có CO2) [ 9], [ 5] 1.1.3 Nguyên liệu sản xuất rượu vang Nguyên liệu để sản xuất dịch trái từ loại quả: mơ, táo mèo, vải, dứa, lê, nho…( bảng 1.1) Bảng 1.1 Thành phần hoá học loại [6] Tên Thành phần hoá học Nước Đường Axit tổng số Pectin Tanin Nho 73,1 9,88 0,56 0,092 0,07 Vải 84,28 16,1 5,16 0,249 0,83 Dứa 54,3 3,9 0,6 _ _ Mơ 73,8 9,0 1,1 _ _ Táo mèo 84,0 4,8 1,45 _ _ 1.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA TẾ BÀO NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae 1.2.1 Sơ lược nấm men Nấm men (yeast) tên chung để nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản chủ yếu phương pháp nảy chồi Chúng phân bố rộng rãi thiên nhiên đất, nước, khơng khí đặc biệt có mặt nhiều bề mặt nhiều loại Nấm men có khả sinh sản nhanh chóng Sinh khối chúng giàu protein, vitamin lipit Nấm men có khả lên men loại đường để tạo thành rượu điều kiện yếm khí, điều kiện hiếu khí chúng lại có khả tạo sinh khối tế bào Vì nấm men ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối… Tuy nhiên số nấm men dại có hại cho sản xuất, làm nhiễm quy trình cơng nghệ gây hư hỏng sản phẩm 1.2.2 Hình thái cấu trúc tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Hình thái Saccharomyces cerevisiae có dạng hình ovan hình trứng Hình dạng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy tuổi tế bào - Kích thước tế bào nấm men: khoảng 2-8m x 4-10m - thay đổi tuỳ lồi, giống điều kiện mơi trường sống Nấm men có màu trắng đục, vàng hồng nhạt, bề mặt tế bào thường khô căng, đứng riêng lẻ dính thành chuỗi 1.2.3 Cấu tạo tế bào nấm men Mặc dù có cấu tạo đơn bào nấm men mang đầy đủ tính chất thể sống Chúng có cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh nhân 1.2.3.1 Màng Có cấu tạo lớp với tỷ lệ glucan mannan tương đương Màng tế bào có cấu tạo chủ yếu hemixenluloza, chiếm khoảng 70% trọng lượng khô tế bào ( 31% mannan + 29% glucan), 6-7% protein thường protein liên kết vững với hidratcacbon, tạo thành phức chất giàu lưu huỳnh, tồn dạng disunfit ( -S-S- ) sulfidrin (-SH- ) Ngoài màng tế bào chứa lipit, đường khử, nitơ, axit amin chất khoáng Trên thành tế bào nấm men có lỗ nhỏ, qua lỗ chất dinh dưỡng đưa vào tế bào sản phẩm trao đổi chất thải ngồi mơi trường xung quanh Nhiệm vụ màng tế bào: bảo vệ hình thái tế bào, trì áp suất thẩm thấu bên tế bào điều hoà trình trao đổi chất Các chất dinh dưỡng hấp thụ, chọn lọc qua thành tế bào 1.2.3.2 Nguyên sinh chất Màng nguyên sinh chất: nằm lớp thành tế bào, chức chủ yếu chủ động điều hoà việc hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, nhờ có hệ enzim pecmeaza mà chất dinh dưỡng hấp thụ tích luỹ lại tế bào Chất nguyên sinh tế bào nấm men + Riboxom: bao gồm loại riboxom 80S ( tồn tế bào chất) riboxom 70S ( có ty thể) + Ty thể có hình bầu dục dài, kích thước 0,2-0,5nm x 0,4-1,0nm kích thước hình dáng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy trạng thái sinh lý tế bào DNA nấm men phân tử dạng vòng có khối lượng phân tử 50x106 Da ( gấp lần so với DNA ty thể động vật bậc đặt lên máy lắc ổn nhiệt (28-30 0C) với tốc độ 150 vòng/phút thời gian 28 Chúng thu kết dẫn bảng 3.2.1 Bảng 3.2.1 Ảnh hưởng hàm lượng K2S2O5 trình nhân giống SLTB x106tb/ml Hàm lượng T h i g i a n Thời gian bổ sung giống Sau h sunfit hoá 50mg/l Thanh trùng Đối chứng 100mg/l 200mg/l 50mg/l Sau 12 h bổ sunfit hoá 100g/l 200mg/l 0mg/l 0mg/l 0h 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,0 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 4h 7,5±1,1±1,1 5,5±1,2 4,25±1,2 5±1,1 4,5±1,0 4,15±1,3 6,25±1,2 3,5±1,0 8h 31,2±1,2 28,1±1,1 15±1,1 27,5±1,1 26,5±1,1 4,5±1,1 15±1,1 5,45±1,1 12h 64,2±1,1 56,5±1,0 29,5±1,1 54,5±1,3 50,2±1,1 7,5±1,1 29,5±1,1 21,5±1,1 16h 115±1,1 120±1,1 58,5±1,3 60,5±1,1 95,5±1,2 84,5±1,3 58,5±1,0 43,5±1,3 20h 137±1,0 142±1,1 148±1,1 178±1,1 148±1,1 137±1,1 118±1,1 96,5±1,1 24h 172±1,1 178±1,3 155±1,1 165±1,2 145±1,1 135±1,1 155±1,1 175±1,1 28h 170±1,1 170±1,1 1470±1,0 162±1,1 148±1,3 130±1,0 150±1,1 172±1,2 Từ bảng cho thấy rằng: Chủng S.cerevisae TM4 sinh trưởng tốt mơi trường sunfit hố K2S2O5 với hàm lượng từ 50-100 mg/l Ở mơi trường sunfit hố với liều lượng lớn ức chế sinh trưởng chủng TM4 Trong trường hợp môi trường không sunfit hố chủng TM4 sinh trưởng yếu môi trường dễ bị nhiễm khuẩn Từ kết thu chúng tơi định sunfit hố mơi trường K2S2O5 với liều lượng 50 mg/l 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng cao men Hàm lượng đạm dịch siro loại thường thấp Vì việc bổ sung cao men trình nhân giống lên men cần thiết [9] Chủng nấm men TM4 nuôi cấy môi trường dịch siro táo mèo nhiệt độ 28 300C máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút Thời gian ni cấy 24 Bổ sung cao men hàm lượng: 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 6; 8; 10g/l Chúng thu kết dẫn bảng 3.2.2 Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng cao men bổ sung trình nhân giống SLTB x106tb/ml Hàm lượng cao men Đơn vị(g/l) 3,5 0h 3,2±1,1 4h 3,4±1,1 Thời gian 4,5 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,45±1,0 3,4±1,2 3,5±1,1 3,65±1,3 3,6±1,0 4,7±1,1 5,95±1,1 6±1,1 12 10,5±1,1 11±1,1 14,7±1,3 16h 22±1,1 25±1,1 30,6±1,1 20 34,7±1,2 40,5±1,2 24h 85±1,1 110±1,1 h h h 10 3,2±1,0 3,2±1,1 3,2±1,3 3,7±1,1 3,85±1,0 3,9±1,1 6,1±1,1 6,25±1,1 7,5±1,1 7,8±1,1 16,6±1,1 20,5±1,0 19,9±1,2 16±1,1 18,5±1,0 47±1,1 93±1,1 86,3±1,1 83±1,2 145±1,1 56±1,1 85.±1,1 145±1,1 152±1,3 128±1,1 135±1,1 120±1,0 112±1,1 145±1,2 150±1,1 120±1,1 137±1,2 Từ kết cho thấy số lượng tế bào nấm men tỉ lệ thuận với hàm lượng cao men bổ sung Nếu bổ sung cao men với hàm lượng thấp 3-4,5g/l môi trường thiếu lượng đạm cần thiết tế bào nấm men sinh sản chậm cụ thể là: Sau 24h nuôi cấy số lượng tế bào tăng 85x106tb/ml(ở môi trường bổ sung 3g/l cao men) 112 x106tb/ml (ở môi trường bổ sung 4,5g/l cao men) số lượng tế bào nấm men/ml dịch nhân giống nhỏ không đáp ứng cho trình lên men nên sinh trưởng chậm Nhưng bổ sung hàm lượng cao men 8-10g/l cao môi trường nhân giống nhiều chất dinh dưỡng khiến tế bào nấm men sinh sản nhanh, môi trường nuôi cấy bị biến đổi dễ gây lây nhiễm Hơn phát triển nấm men thấp so với mức cao men 5-6g/l Hàm lượng cao men bổ sung hợp lý từ - g/l sinh trưởng nấm men đạt kết cao 24 đạt 145-150 x106 tb/ml Vì q trình nhân giống chúng tơi định bổ sung cao men vào môi trường dịch siro với hàm lượng - g/l 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Chủng S.cerevisiae TM4 cấy vào môi trường nhân giống có pH 3,8 với số lượng giống ban đầu 3,2 x 106tb/ml, tiếp tục nhân giống nấm men máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút ngưỡng nhiệt độ: 24, 26, 28, 30, 32, 35, 37 (oC), sau tiến hành xác định số lượng tế bào khoảng thời gian giờ/lần để xác định thời điểm số lượng tế bào đạt giá trị cao xác định tốc độ sinh trưởng nấm men giờ, thu kết trình bày bảng 3.2.3 Bảng 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ trình nhân giống SLTB Nhiệt độ x10 tb/ml 240C 260C 280C 300C 320C 350C 370C T 0h 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 h 4h 3,5±1,2 5,6±1,1 5,8±1,1 4,85±1,1 4,9±1,3 5,5±1,0 5±1,15 12,5±1,1 15,4±1,0 16,5±1,1 12,5±1,0 11,5±1,0 10,0±1,1 9,5±1,1 16,2±1,0 27±1,1 25,7±1,2 20±1,1 21,2±1,1 19,6±1,2 20,7±1,1 h i 12 h g 16 h 75,5±1,1 95±1,0 95±1,0 80±1,1 93±1,1 85 ±1,1 70±1,0 i 20 a 24h 110,5±1,1 140±1,1 154±1,1 108±1,1 107±1,3 107±1,0 101,1 140±1,1 155±1,1 162±1,3 145±1,0 145±1,1 140±1,1 130±1,3 n 28h 138±1,1 162±1,1 160±1,1 140±1,1 140±1,1 138±1,1 126±1,1 h Từ kết cho thấy chủng nấm men TM4 sinh trưởng phát triển tốt khoảng nhiệt độ từ 26-280C đạt 160 x 106tb/ml Ở nhiệt độ 300C tốc độ sinh trưởng chủng TM4 bị giảm không phù hợp q trình sản xuất, điều hồn tồn phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Amerine.M.A, Bergh W and Cruess.W nghiên cứu nấm men nói chung [12 ] Vì chúng tơi định giữ nhiệt độ cho trình lên men chủng nấm men TM4 khoảng 26-280C 3.2.4 Ảnh hưởng pH Chúng cấy chủng nấm men S.cerevisiae TM4 với số lượng tế bào ban đầu (3,2 ± 1,1) x106tb/ml vào môi trường dịch nhân giống có độ pH mức: 3; 3,3; 3,6; 3,8; 4,2; 4,5; 5,2; 7,2 (dùng axit HCl NaOH để chỉnh pH) nuôi cấy nhiệt độ 26-28oC Chủng TM4 nhân giống bình tam giác 250 ml máy lắc ổn nhiệt khoảng thời gian 28 Chúng thu kết sau 50 45 40 SLTBx1 35 triệu tb/ml 30 25 20 15 10 3.3 3.6 3.8 4.2 4.5 5.2 7.2 Độ pH Biểu đồ 3.2.4 Số lượng tế bào trung bình sau 28 ni cấy giá trị pH khác Chủng S.cerevisiae TM4 sinh sản phát triển tốt mơi trường nhân giống có độ pH 4,2-4,5 Rõ ràng nhận thấy sau 28 nuôi cấy số lượng tế bào nấm men đạt cực đại mơi trường có pH 4,2-4,5 Chính độ pH thích hợp 3,8–4,5 kiểm tra chất lượng tế bào nấm men tỉ lệ tế bào nẩy chồi là: 70-73%, độ pH phù hợp với pH dịch Ở giá trị pH khác chủng nấm men TM4 sinh sản yếu ớt pH môi trường cao dễ bị nhiễm khuẩn Vì chúng tơi giữ mức pH thích hợp cho q trình lên men chủng nấm men TM4 4,2-4,5 3.2.5 Ảnh hưởng hàm lượng oxy hồ tan Trong qúa trình nhân giống hàm lượng O2 có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh sản nấm men Để nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố tới sinh sản chủng TM4 tiến hành nuôi cấy máy lắc với tốc độ khác Ứng với tốc độ lắc giá trị oxy hoà tan định Kết thể bảng sau Bảng 3.2.5 Ảnh hưởng hàm lượng oxy hoà tan trình nhân giống SLTB(x106tb/ml) Hàm lương O2(mg/l) 4-6 8,25 8,5 8,75 Tốc đô lắc(v/phút) 130 150 170 200 Thời gian Không lắc 100 h 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 3,2±1,1 4h 3,3±1,0 3,4±1,2 3,6±1,3 3,8±1,3 4,0 ±1,0 4,6±1,1 8h 3,5±1,1 4,6±1,1 5,8±1,1 7,5±1,1 7,8±1,1 8,2±1,2 12h 4,8±1,2 5,5±1,0 10,0±1,1 16±1,3 21±1,1 21±1,0 16h 5,6±1,1 66±1,1 68,5±1,1 70±1,1 75±1,1 76±1,1 h 20 9,15±1,0 99±1,1 91,2±1,4 88,5±1,3 98±1,0 102±1,1 24h 18,2±1,1 109±1,1 128±1,1 139±1,1 145±1,1 152±1,3 28h 78±1,1 122±1,0 135±1,1 140±1,1 151±1,1 170±1,1 Từ kết cho thấy chủng nấm men TM4 sinh sản mạnh hàm lượng O2 hoà tan khoảng - mg/l Ở mẫu đối chứng ( không lắc) chủng TM4 sinh sản yếu ớt, môi trường bị nhiễm khuẩn Như việc bổ sung O2 q trình nhân giống hồn tồn hợp lý Kết phù hợp với công bố tác giả Amerine.M.A, Bergh W and Cruess.W Amerine.M.A, Bergh W and Cruess.W nghiên cứu nấm men nói chung [12], [13] 3.3 NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI LÊN MEN VANG TÁO MÈO Động thái lên men vang q trình chuyển hố đường hợp chất hữu có dịch thành rượu, axit hữu cơ, vitamin, chất thơm… làm cho vang có hương vị đặc trưng khác hẳn nhiều loại rượu khác Động thái lên men vang trình biến đổi phức tạp hợp chất, ảnh hưởng định đến chất lượng sản phẩm cuối Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tập chung nghiên cứu số biến đổi số chất hữu trình lên men vang táo mèo biến đổi đường, axit tổng số, độ pH, hàm lượng rượu, số lượng tế bào nấm men…thông qua nghiên cứu động thái lên men vang 24 đầu 14 ngày đầu trình lên men vang táo mèo 3.3.1 Động thái lên men vang ngày thứ Chúng tiến hành lên men vang quy mơ thí nghiệm bình lên men có dung tích lít Mơi trường lên men dịch siro táo mèo pha loãng nước tới nồng độ đường tổng số 25% ( 250 g/l ) Tiến hành khử trùng môi trường K2S2O5 ( chứa 55% SO2 ) với hàm lượng 50 mg/l Sau tiếng bổ sung K2S2O5 vào mơi trường tiến hành cấy giống với tỉ lệ 5% v/v ( tương đương khoảng 12.106 tế bào/ml ) Các bình sau cấy giống chuyển vào tủ ấm 300C, giá trị pH khoảng từ 3,8-4,2 Tiến hành phân tích mẫu lần 24 liên tục, thu kết sau Bảng 3.3.1 Động thái lên men vang ngày thứ Chỉ tiêu Đơn vị Thời gian (giờ) 12 16 20 HLcồn %V 0.25±0.01 0.26±0.01 0.28±0.01 0.3±0.01 0.32±0.01 0.54±0.01 HLaxit tổng số g/l 4.6±0.01 4.65±0.01 4.7±0.01 4.76±0.01 4.82±0.01 4.9±0.01 HL đường tổng số g/l 25±0.1 25.5±0.1 24±0.1 23.5±0.1 23±0.1 22.5±0.1 HLđường khử g/l 62.6±0.02 61.5±0.02 60.0±0.02 59.8±0.02 58.2±0.02 57.8±0.02 3.8±0.1 4.0±0.1 4.01±0.1 3.95±0.1 4.0±0.1 3.84±0.1 12±1.1 16±1.1 38±1.1 48±1.1 82±1.1 160±1.1 pH SL tế bào X106/ml Kết cho thấy : nửa ngày hàm lượng đường giảm chậm, số lượng tế bào nấm men tăng dần, hàm lượng etylic có tăng ít, thơng số khác có biến đổi không rõ rệt Theo nửa ngày thời gian nấm men làm quen với môi trường, số nấm men đề kháng yếu với SO2 bị tiêu diệt Những nấm men thích nghi tồn sinh sản nên điều dẫn đến tượng nửa ngày số lượng tế bào nấm men tăng lên chậm chạp, thông số khác biến đổi không nhiều lúc nấm men thực sinh sản chủ yếu Hàm lượng etylic tăng từ 0,25 (do nấm men dại hoạt động chậm chạp dịch siro tạo thành ) đến 0,54±0,01 Điều cho thấy ngày etylic sản xuất với hàm lượng Đó ngày nấm men thực trao đổi chất theo kiểu hiếu khí cách dùng oxy phần tử lưu lại bình lên men Thời điểm từ 12h- 24h số lượng tế bào tăng lên nhanh, cách tiếng số lượng tế bào lại tăng gấp đôi, độ pH giảm hàm lượng axit tổng số có tăng khơng đáng kể Về mặt sinh trưởng, chúng tơi khẳng định : 24h kể từ cấy giống, giai đoạn từ - 8h ứng với pha tiềm phát, giai đoạn từ - 12h ứng với pha khởi phát pha cấp số mũ ( logarit ) Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả khác [11], [7] nghiên cứu đặc điểm sinh sản, phát triển Saccaromyces cerevisiae nghiên cứu lên men vang nói chung 180 SLTBx1triệu tb/ml 160 140 120 100 80 60 40 20 0 10 20 30 Thời gian ( giờ) Đồ thị 3.3.1 Tốc độ phát triển S.cerevisiae TM4 ngày 3.3.2 Động thái trình lên men vang táo mèo Để xác định động thái q trình lên men vang táo mèo, chúng tơi tiến hành lên men bình có dung tích lít Mơi trường lên men dịch siro táo mèo ( có hàm lượng đường tổng số khoảng 50% ) pha loãng nước tới nồng độ đường tổng số 25 % ( 250 g/l ) Tiến hành khử trùng môi trường K2S2O5 ( chứa 55 % SO2 ) với hàm lượng 50 mg/l Sau tiếng bổ sung K2S2O5 vào mơi trường tiến hành cấy giồng với tỉ lệ % v/v ( tương đương khoảng 12.106 tế bào/ml ) Các bình sau cấy giống chuyển vào tủ ấm 280C, giá trị pH khoảng từ 4,2-4,5 Tiến hành phân tích mẫu ngày lần 14 ngày liên tục, thu kết sau : 350 300 250 200 150 100 50 14 12 HL cồn 10 0 10 Thời gian (ngày) 15 10 Thời gian (ngày) 15 SL tế bào Đồ thị 3.3.2 Động thái trình lên men vang táo mèo Kết cho thấy : tế bào nấm men sinh sản nhanh vào ngày thứ đến ngày thứ tiếp tục trì ngày thứ 6, thứ 7, thứ 8, sau bắt đầu giảm dần giảm nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 12 trình lên men, đến ngày thứ 14 số lượng tế bào nấm men lại : 147.106 tế bào/ml Số lượng tế bào đạt cực đại vào ngày thứ ( thời gian pha log ) Theo ngày thứ ngày thứ nấm men sinh sản nhanh mơi trường có nhiều dinh dưỡng, hàm lượng cồn thấp chưa có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm men Ngày thứ thứ ( thuộc pha cân động ) mơi trường đủ dinh dưỡng để trì số lượng tế bào nấm men Nhưng từ ngày thứ trở hàm lượng cồn tăng nhanh, hàm lượng đường giảm mạnh, đặc biệt cạn kiệt nguồn đạm làm cho tế bào nấm men bị tự phân lắng xuống đáy bình Do số lượng tế bào vào ngày cuối giảm nhanh đến ngày thứ 14 147.106 tế bào/ml Về biến đổi hàm lượng cồn, nhận thấy độ cồn tăng nhanh vào ngày thứ 3, đồng thời đường tổng số giảm mạnh vào thời điểm Từ ngày thứ trở độ cồn tăng chậm hàm lượng đường giảm chậm Quan sát mắt thường cho thấy từ ngày thứ đến ngày thứ số lượng bọt khí CO2 tạo nhiều, từ ngày thứ trở số lượng bọt khí bắt đầu giảm dần Như kết thí nghiệm cho thấy : biến đổi hàm lượng cồn hàm lượng đường có liên quan chặt chẽ với theo biến động số lượng tế bào nấm men Hàm lượng axit tổng số tăng dần, nhiên thay đổi hàm lượng axit tổng số không lớn Điều giải thích sau : q trình lên men rượu, ngồi việc tạo sản phẩm rượu tạo nên axit xucxinic, axetic, lactic Theo CH.Barthomenf (1986) từ 100 phần đường saccaroza thu 105,4 phần đường tự sau thủy phân thu 0,7 phần axit xucxinic[4] Sự tạo thành axit trình lên men dẫn đến làm giảm độ pH dịch lên men Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả nghiên cứu nấm men nói chung [7], [12] 3.4 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO Q trình lên men vang nói chung chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố có môi trường dịch lên men như: nhiệt độ, hàm lượng đường, pH, tỉ lệ men giống… 3.4.1 Độ pH Độ pH không ảnh hưởng đến hoạt động sống nấm men, mà ảnh hưởng đến giá trị cảm quan vang Để khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu tới trình lên men chúng tơi tiến hành thí nghiệm mơi trường dịch táo mèo có hàm lượng đường 250g/l, nhiệt độ: 26-28oc, pH: 3,5; 4; 4,5; Kết thu bảng 3.4.1 Bảng 3.4.1 Ảnh hưởng độ pH đến trình lên men vang táo mèo Chỉ tiêu phân tích Đơn vị pH 3,5 4,5 Thời gian lên men H 100-105 85-90 83-90 83-87 HL đường sót g/l 4,9±0,2 4,6±0,2 5±0,2 6,1±0,2 HL cồn %V 10,5±0.1 12,5±0,1 11,25±0,1 9.7±0,1 Kết cho thấy pH tăng thời gian lên men giảm Các mẫu có độ pH: 4-4,5 thời gian lên men lâu mẫu khác lại đạt tiêu cần thiết có hàm lượng cồn cao hiệu suất lên men cao Đối với mẫu có pH: 3,5 có hiệu suất lên men giảm theo hàm lượng axit tăng (độ pH thấp) áp suất thẩm thấu tăng gây ức chế cho hoạt động sống nấm men Đối với mẫu có pH: có hàm lượng cồn thấp, hàm lượng đường sót cao vị bị dư thừa, vị chua, chát…của sản phẩm khó cảm nhận không phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng Như độ pH thích hợp cho lên men vang táo mèo là: 4-4,5 3.4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ men giống Men giống giữ vai trò quan trọng đến thành cơng hay thất bại q trình lên men, tỷ lệ men giống phù hợp với trình lên men vang nhằm thu hiệu suất lên men chất lượng vang đạt giá trị cao yêu cầu cần thiết quy trình cơng nghệ sản xuất vang Để lựa chọn hàm lượng men giống thích hợp chúng tơi tiến hành thí nghiệm môi trường dịch lên men với tỷ lệ giống ban đầu là: 5, 7, 10, 15, 20%V Kết dẫn bảng 3.4.2 Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ men giống tới trình lên men vang táo mèo tiêu phân tích HL giống (x106tb/ml) Đơn vị 10 15 20 thời gian lên men H 103-110 98-104 92-97 85-90 80-85 HL đường sót g/l 5,3±0,3 5,2±0,3 4,6±0,3 4,9±0,3 5,0±0,3 Hl cồn %V 10,3±0,02 10,5±0,02 12,5±0,02 12,2±0,02 12,0±0,02 pH 3,85±0,01 3,8±0,01 3,75±0,01 3,7±0,01 3,85±0,01 Kết thí nghiệm cho thấy: tỷ lệ men giống ban đầu giảm từ 5-20% V thời gian lên men ngắn dần, hàm lượng đường sót giảm không đáng kể Hàm lượng cồn, hiệu suất lên men giá trị cảm quan chung đạt giá trị cao mẫu lên men có tỷ lệ men giống ban đầu 10%V Đối với mẫu lên men có tỷ lệ men giống thấp 5%V thời gian lên men kéo dài mẫu khác thời gian sinh sản phát triển để đạt số lượng tế bào cao nấm men bị kéo dài tỷ lệ men giống bổ sung ban đầu mức thấp ngược lại mẫu lên men có tỉ lệ men giống ban đầu cao 15-20%V thời gian sinh sản, phát triển để đạt số lượng tế bào/ml dịch đạt giá trị cao ngắn số lượng men giống bổ sung ban đầu nhiều Mặt khác, bổ sung nấm men tỷ lệ cao, làm cho trình lên men diễn nhanh hơn, làm cho nhiệt độ trình lên men tăng cao so với mẫu có tỷ lệ giống nên làm giảm hiệu suất trình lên men Như vậy, theo lượng men giống bổ sung ban đầu chủng S cerevisiae TM4 nên sử dụng tỷ lệ: 10 %V phù hợp cho trình lên men vang táo mèo 3.5 ỨNG DỤNG LÊN MEN VANG TÁO MÈO VỚI QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Qua kết nghiên cứu tiến hành lên men vang táo mèo với môi trường lên men MT3 thực nghiệm trình lên men ở: nhiệt độ 28oC pH: 4,5, tỷ lệ men giống 10% với quy mơ phòng thí nghiệm bình lên men lit sau 17 ngày kết thúc giai đoạn lên men đánh giá rượu thành phẩm cảm quan sau chuyển tiếp lên men phụ Kết phân tích dẫn bảng Bảng 3.5 Kết phân tích rượu thành phẩm Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Mẫu Độ rượu %V 12,5 Đường sót % 5,0 Axit (%) % 0,48 Độ pH 4,2 Sản phẩm đánh giá cao Trên sở chúng tơi xây dựng quy trình cơng nghệ lên men vang táo mèo 3.6 QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ LÊN MEN VANG TÁO MÈO 3.6.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất vang táo mèo Quả táo mèo -Rửa sạch, loại bỏ chất lượng - Ngâm đường với tỷ lệ 1:1 Dịch siro - Khử trùng môi trường dịch siro - Dịch lên men - Nấm men S cerevisiae TM410% -Lên men( to: 26-280C, pH:4,2-4,5) - Có bổ sung thêm sacaroza phù hợp với loại vang Vang non - Tách cặn, tiếp tục lắng - Tiếp tục tàng trữ: (to: 15oC) Vang thô Tách cặn (2-3 lần) lọc Vang thành phẩm Tàng trữ Đóng chai để tiêu thụ 3.6.2 Thuyết minh công nghệ Quy trình sản xuất vang táo mèo bao gồm giai đoạn là: 3.6.2.1 Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men Quả thu hoạch cần phải chọn lấy chín, loại bỏ non, dập nát thối Quả chọn đem rửa nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh để nước Sau cho vào ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1 Quả táo mèo ta khía đường nhỏ quanh Khoảng hai ngày khuấy trộn lần Sau tháng ta thu thứ siro nước có nồng độ đường khoảng 60-80 % nhiều dưỡng chất khác chiết từ thịt 3.6.2.2 Giai đoạn 2: Lên men Bổ sung nấm men vào dịch lên men (thường tỉ lệ 10%V) Điều chỉnh nhiệt độ phù hợp cho trình lên men vang táo mèo 26-28oC, suốt trình lên men vang phải tiến hành phân tích mẫu kiểm tra nấm men thường xuyên để điều chỉnh trình lên men cho phù hợp để hạn chế thất cồn, hương thơm…trong q trình lên men chính, cần thiết phải lên men gần đầy bình, nên giữ áp lực mức thấp Quá trình lên men vang táo mèo thường kết thúc sau 15-17 ngày 3.6.2.3 Giai đoạn 3: Lên men phụ (Ủ chín vang) Quá trình lên men phụ (ủ vang) nên giữ nhiệt độ 15-20oC, sau kết thúc lên men vang 80-90 ngày tiến hành tách cặn đáy bình sau bổ sung phụ gia lắng cách : pha loãng chất phụ gia với cồn (1515%V) cho từ từ vào bình, vừa cho vừa khuấy theo chiều cố định khoảng 10-15 phút Việc tách cặn đáy bình phải tiến hành 2-3 lần suốt thời gian tàng trữ 3.6.2.4 Giai đoạn 4: Hoàn thiên tiêu thụ sản phẩm Để tăng cường giá trị cảm quang sản phẩm (nhất độ trong) cần tiến hành lọc vang sản phẩm đạt đến độ hoàn thiện Việc đóng chai tiêu thụ sản phẩm thường tiến hành sau lọc vang lần cuối Thơng thường rượu bị nhiễm khâu đóng chai, u cầu vệ sinh giai đoạn phải nghiêm ngặt Vang đóng chai cất trữ bảo quản thời gian dài KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Chúng phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men tốt, hàm lượng đường sót dịch lên men đạt tiêu chuẩn, tạo độ cồn cao, độ tốt, hương vị thơm phù hợp lên men vang táo mèo Căn khoá phân loại Lodder (1970) tiến hành định loại chủng nấm men tuyển chọn S cerevisiae TM4 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố trình nhân giống chủng nấm men S cerevisiae TM4 như: K2S2O5, cao men, nhiệt độ, pH, hàm lượng oxy hoà tan Đã nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo nghiên cứu ảnh hưởng pH, tỉ lệ men giống cho trình lên men vang táo mèo cuả chủng nấm men S cerevisiae TM4 Lên men vang táo mèo với quy mơ phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vang táo mèo ĐỀ NGHỊ Với kết thu được, mong muốn góp phần cho nghiên cứu để đưa sản xuất vang táo mèo quy mô cơng nghiệp nhằm giải vấn đề khó khăn tiêu thụ sản phẩm, làm phong phú nguồn sản phẩm rượu vang sản xuất từ loại quả, góp phần nâng cao thu nhập cho bà nông dân vùng cao Đem lại rượu vang phù hợp với nhu cầu người Việt Nam, góp phần làm phong phú tăng sản lượng rượu vang sản xuất nước TÀI LIỆU THAM KHẢO Mai Danh Côn (1972), Sản xuất sử dụng thức ăn lên men chăn nuôi, Nxb Nông thôn Nguyễn Lân Dũng (1986), Men gia súc men rượu, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất Mir Maxcova Nguyễn Thành Đạt (2000-2002), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Tập Nxb Giáo Dục Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hoá sinh, Nhà xuất Đai Học Quốc Gia Nguyễn Đình Sinh (1997), Nấm men khả sử dụng chúng công nghệ sinh học, Luận văn thạc sỹ, Trường ĐHSP Hà Nội Nguyễn Quang Thảo (2000), Nghiên cứu lên men vang vải thiều, Luận án tiến sỹ sinh học, ĐHSP Hà Nội Quyền Đình Thi (2005), Cơng nghệ sinh học, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Đình Thường, Nguyễn Thanh Hằng (2000), Cơng nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 10 Nguyễn Đình Thưởng (1980), Cơng nghệ phân tích lên men, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 11 TCVN , 3217 - 79, Rượu phân tích cảm quan, phương pháp cho điểm 12 Avram, D., and Bakalinsky, A.T(1999), FZF1p of Saccharomyces cerevisiae is a positive regulator of SSU1 transcription and its first zinc finger is required for DNA binding, Yeast 15,473-480 13 Amerine.M.A, Bergh W and Cruess.W (1972), The technology of wine making AVi Publishing Company, Inc ( 22, 323 - 358 ) ... 3.2.5 .Ảnh hưởng hàm lượng oxy hoà tan trình nhân giống Bảng 3.3.1 Động thái lên men vang ngày thứ Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng độ pH đến trình lên men vang táo mèo Bảng 3.4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ men giống. .. trường dinh dưỡng hàm lượng men giống cho trình lên men vang táo mèo Mục tiêu ca đề tài Phõn lp, tuyn chn chng nm men phù hợp cho lên men vang táo mèo, tiến hành định loại chủng nấm men phương... đường Hàm lượng đường phù hợp cho trình lên men vang 12-25% .Hàm lượng đường 30%V ức chế trình lên men Các kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng đường dịch lên men tăng hàm lượng axit axetic vang cao