BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN MINH THU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ VÀ SỬ DỤNG BỘ XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN MINH THU HỒN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ VÀ SỬ DỤNG BỘ XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG Chuyên ngành : Y Sinh học - Di truyền Mã số : LUẬN VĂN THẠC SĨ Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ TRANG TS TRIỆU TIẾN SANG HÀ NỘI – 2019 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Khái niệm vô sinh vô sinh nam .3 1.2 Tình hình vơ sinh 1.2.1 Tình hình vơ sinh giới 1.2.2 Tình hình vơ sinh Việt Nam .4 1.3 Tổng quan đứt gãy DNA tinh trùng 1.3.1 Khái niệm đứt gãy DNA tinh trùng .4 1.3.2 Cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng 1.3.3 Ảnh hưởng đứt gãy DNA tinh trùng đến khả sinh sản nam giới 1.4 Các phương pháp xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng giới .12 1.4.1 Phương pháp sử dụng probe thuộc cấu trúc chất nhiễm sắc 12 1.4.2 Các phương pháp phát trực tiếp tinh trùng có DNA bị đứt gẫy 13 1.4.3 Các phương pháp kiểm tra tính ổn định chất nhân tế bào tinh trùng .14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 15 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ .15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 15 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 15 2.2.3 Cỡ mẫu cách chọn mẫu 16 2.2.4 Thiết kế nghiên cứu .16 2.2.5 Quy trình nghiên cứu 17 2.3 Các bước tiến hành xét nghiệm 18 2.3.1 Hóa chất dụng cụ 18 2.3.2 Chuẩn bị mẫu 18 2.3.3 Quy trình xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng 18 2.3.4 Khác biệt quy trình xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA kit tự pha kit Halosperm 20 2.3.5 Đánh giá kết 20 2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 22 2.4.1 Hồn thiện quy trình pha chế xét nghiệm chẩn đoán đứt gãy DNA tinh trùng 22 2.4.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng .26 2.4.3 Đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại 27 2.5 Phân tích xử lý số liệu 27 2.6 Đạo đức nghiên cứu 27 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Hồn thiện quy trình pha chế sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng .28 3.1.1 Tối ưu hóa nồng độ thạch agarose tạo hỗn hợp với tinh dịch .28 3.1.2 Tối ưu hóa lam kính 29 3.1.3 Tối ưu hóa nồng độ dung dịch biến tính ly giải 31 3.1.4 Đánh giá độ xác xét nghiệm xác định mức độ đứt gẫy DNA tinh trùng 34 3.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại .36 3.2.1 Xác định độ nhạy xét nghiệm 42 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu xét nghiệm 42 3.2.3 Đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại 42 Chương 4: BÀN LUẬN 46 4.1 Hoàn thiện quy trình xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng 46 4.1.1 Tối ưu hóa nồng độ thạch agarose tạo hỗn hợp với tinh dịch .46 4.1.2 Tối ưu hóa lam kính 47 4.1.3 Tối ưu hóa nồng độ dung dịch biến tính ly giải 48 4.1.4 Đánh giá độ xác xét nghiệm xác định mức độ đứt gẫy DNA tinh trùng 51 4.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại .53 4.2.1 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu 53 4.2.2 Đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại 54 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Axit deoxyribonucleic WHO World Health Organization DFI DNA fragmentation index IUI intrauterine insemination IVF in vitro fertilization ICSI intracytoplasmic sperm injection DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 So sánh quy trình xét nghiệm kit Halosperm kit tự pha 20 Bảng 2.2 Bảng quy ước xác định độ nhạy độ đặc hiệu xét 26 Bảng 3.1 So sánh kết nồng độ thạch agarose 28 Bảng 3.2 So sánh kết nồng độ thạch phủ lam kính .29 Bảng 3.3 Kết tạo tiêu tinh dịch - thạch loại lam kính 30 Bảng 3.4 So sánh DFI dung dịch biến tính 31 Bảng 3.5 So sánh DFI dung dịch ly giải 33 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm xác định độ xác kit tự pha 35 Bảng 3.7 Kết đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng phương pháp 36 Bảng 3.8 Kết kiểm nghiệm mức độ đứt gãy ADN tinh trùng 42 Bảng 3.9 Bảng kiểm định hệ số tương quan phương pháp 44 Bảng 3.10 Bảng kiểm định T - test chênh lệch phương pháp 44 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 So sánh tỷ lệ đứt gãy ADN tinh trùng kit tự pha kit thương mại Halosperm 43 Biểu đồ 3.2 Biểu đồ Bland Altman thể tương hợp phương pháp đo .45 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Các chế gây đứt gãy DNA tinh trùng Hình 1.2 Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L (1997) .7 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu 17 Hình 2.2 Hình ảnh tinh trùng có quần halo khơng có quầng halo 21 Hình 2.3: Độ xác 24 Hình 3.1 Hình ảnh lam kính với tiêu thạch kit Halosperm 29 Hình 3.2 Hình ảnh lam kính với tiêu thạch tự pha 29 Hình 3.3 Hình ảnh tiêu kit Halosperm 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng biểu Bảng 2.1 So sánh quy trình xét nghiệm kit Halosperm kit tự pha Bảng 2.2 Bảng quy ước xác định độ đặc hiệu xét nghiệm Bảng 3.1 So sánh kết nồng độ thạch agarose Bảng 3.2 So sánh kết thể tích thạch agarose Bảng 3.3 So sánh kết nồng độ thạch phủ lam kính Bảng 3.4 So sánh kết loại lam kính Bảng 3.5 So sánh DFI dung dịch biến tính Bảng 3.6 So sánh DFI dung dịch ly giải Bảng 3.7 Giá trị đánh giá độ lặp lại kit tự pha Bảng 3.8 Bảng sơ xác định độ nhạy xét nghiệm Bảng 3.9 Bảng kết xác định độ nhạy xét nghiệm Bảng 3.10 Các giá trị đánh giá độ đặc hiệu kit tự pha Trang 19 - 20 26 28 28 28 29 29 29 - 30 30 31 32 32 49 thuận lợi cho việc tháo xoắn sợi nhiễm sắc, giữ hình thái đầu nhân tinh trùng giữ toàn sợi nhiễm sắc bị phân tán tạo thành quầng Dung dịch ly giải mà chúng tơi cải tiến từ quy trình Fernandez có lực ion đủ lớn để tạo thuận lợi cho q trình ly giải mà khơng làm biến tính protein Sau tiến hành thử nghiệm nồng độ khác chúng em chuẩn hóa quy trình với dung dịch lysis gồm: 2M NaCl; 0,1M DTT; 0,2M Tris; khoảng 1% Triton X-100 pH khoảng 7,5 Qua kiểm nghiệm 50 bệnh nhân sử dụng quy trình giảm lượng dung dịch ly giải kit Halosperm hoàn toàn tương đương Điều minh chứng độ phân mảnh DNA tinh trùng thu từ q trình khơng có khác biệt so sánh cặp Như vậy, thành phần kit tự pha tối ưu sau: - Thạch để tạo tiêu bản: Thạch agarose 0,7% - Lam kính để tạo tiêu bản: Lam kính thường có phủ thạch agarose 0,3% - Dung dịch biến tính: HCl 30% - Dung dịch ly giải: 0,5 M DTT; 2,5 M NaCl; 0,2 M Tris; 1% Triton X 100, pH 7,5 Để hồn thiện quy trình trên, cần xác định độ xác kit có đảm bảo u cầu xét nghiệm 4.1.4 Đánh giá độ xác xét nghiệm xác định mức độ đứt gẫy DNA tinh trùng 4.1.4.1 Đánh giá độ chụm kit tự pha Trong thử nghiệm, đặc biệt thử nghiệm định lượng, có nhiều yếu tố sai số ảnh hưởng tới thử nghiệm, dẫn tới khơng xác kết Do đó, để kiểm sốt yếu tố gây nhiễu này, cần thiết sử dụng khái niệm độ chụm Độ chụm mô tả kết phụ thuộc vào yếu tố sai số ngẫu 50 nhiên mà không liên quan đến kết thực mẫu Độ chụm thấp độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên lớn, ngược lại, độ chụm lớn hệ số biến thiên nhỏ [6] Trong nghiên cứu này, kit cải tiến chúng tơi có độ lặp lại với hệ số biến thiên CV% = 2,62%; hệ số biến thiên có giá trị khơng vượt q 5% [6], nói lên quy trình có độ lặp lại đạt u cầu phép phân tích Như vậy, có tác động yếu tố sai số ngẫu nhiên, với mẫu, mức độ đứt gãy ADN tinh trùng xác định điều kiện khác có sai số khoảng chấp nhận 4.1.4.2 Xác định độ kit tự pha Độ mức độ gần giá trị trung bình kết thử nghiệm giá trị thực giá trị chấp nhận Với thực nghiệm kiểm định độ đúng, chúng tơi tính ttn= 0,97; bên cạnh thơng qua tra bảng có tc = 2,262 [6] Như ttn< tc Điều đồng nghĩa với việc số đứt gãy ADN tinh trùng xác định kit cải tiến có kết tương đương với phương pháp sử dụng kit thương mại Halosperm Quy trình đạt độ theo yêu cầu phép phân tích SCSA coi tiêu chuẩn vàng để phân tích mức độ đứt gãy ADN tinh trùng Một so sánh kỹ thuật SCD kit Halosperm SCSA thực 45 mẫu tinh dịch từ bệnh nhân khám Trung tâm Y tế Sinh sản Đại học Minnesota Các mẫu tinh dịch xử lý đồng thời cho SCD SCSA Mức độ tương đồng hai kỹ thuật cao (hệ số tương quan nội hàm R: 0,85) sử dụng hàm Bland - Altman từ phần mềm SPSS để so sánh Như vậy, kít chúng tơi tự pha cho kết tương đồng với kít Halosperm, điều cho thấy độ xác kít cao Tóm lại, kỹ thuật phân tích mức độ đứt gãy ADN tinh trùng phòng thí nghiệm lâm sàng phòng thí nghiệm hỗ trợ sinh sản phải đơn giản, tái tạo, tốt không cần mới, phức tạp, 51 dụng cụ đắt tiền [7] Như vậy, kỹ thuật đánh giá kết xét nghiệm mức độ đứt gãy ADN tinh trùng kính hiển vi thơng thường nên áp dụng phổ biến Kết nghiên cứu cho thấy kít xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng có kết tương đương với Bộ kít Halosperm®, cóquy trình kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng, xác có khả tái sản xuất cao để phân tích đứt gãyADN tinh trùng Bộ kít giúp bảo quản tốt chất nhiễm sắc; kích thước quầng sáng ước tính cách xác với kính hiển vi thông thường nhờ sử dụng thuốc nhuộm Giemsa, xác định xác tuyệt đối phần mềm tự động Khơng giống SCSA, kít xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng sử dụng mà không cần yêu cầu dụng cụ phức tạp đắt tiền 4.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại 4.2.1 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu Độ nhạy độ đặc hiệu hai đại lượng thống kê phản ánh độ xác xét nghiệm Một xét nghiệm tốt cần có độ nhạy độ đặc hiệu cao, có nghĩa sinh phẩm có kết dương tính giả âm tính giả thấp Đây hai tiêu chí quan trọng đánh giá chất lượng sinh phẩm Bộ xét nghiệm tự pha đạt độ đặc hiệu 97,10%, độ nhạy 96,91% Thực nghiệm chứng minh, xét nghiệm tự pha xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng có độ nhạy độ đặc hiệu cao, có khả phát đứt gãy ADN tinh trùng mẫu tinh dịch có mật độ thấp Do sử dụng kit để xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng với độ tin cậy cao 52 4.2.2 Đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại Kết thu từ quy trình cải tiến xét nghiệm thương mại xử lý hàm Pearson (r = 0,995; p < 0,001) T - test (p = 0,236 > 0,05) cho thấy có tương quan mạnh Đây dấu hiệu tốt nhiên chưa loại trừ khả tất kết quy trình cải tiến có xu hướng lớn nhỏ so với quy trình thương mại đạt chuẩn Do đó, chúng tơi sử dụng thêm biểu đồ Bland Altman để nâng cao độ tin cậy Dựa vào biểu đồ Bland Altman chúng tơi có được: - Khác biệt phương pháp chẩn đoán ngẫu nhiên (các điểm giá trị phân tán không theo quy luật nào) kích thước sai số khơng liên hệ với giá trị DFI - Khác biệt trung bình phương pháp nhỏ (0,042), gần với - Trong 300 giá trị, có điểm nằm ngồi khoảng ± 1,96 độ lệch chuẩn Tuy nhiên hầu hết điểm (4/5 điểm) có giá trị DFI cao quy trình cải tiến đánh giá độ phân mảnh DNA tinh trùng nhẹ chút khơng bỏ sót chẩn đốn Từ chúng tơi nhận định phương pháp có sai lệch nhiên khả bỏ sót chẩn đốn sai lệch thấp 53 KẾT LUẬN Hồn thiện quy trình pha chế sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng Bộ xét nghiệm cải tiến pha chế, sản xuất sau: - Thạch agarose 0,7% để tạo hỗn hợp với tinh dịch - Lam kính thường có mài đầu phủ thạch agarose 0,3% - Dung dịch biến tính HCl 30% - Dung dịch ly giải có thành phần: 2M NaCl; 0,1M DTT; 0,2M Tris; 1% Triton X-100 chuẩn pH 7,5 Bộ xét nghiệm tự pha sau hoàn thiện đạt tiêu chuẩn xét nghiệm định lượng với tiêu chí: - Độ lặp lại CV% = 2,62% ≤ 5% - Độ ttn= 0,97 < tc = 2,262 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại Bộ xét nghiệm tự pha đạt: - Độ đặc hiệu 97,10%, - Độ nhạy 96,91% Kết xác định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng kit tự pha kit thương mại có tương quan mạnh với r = 0,995; p < 0,001 thử nghiệm Pearson; p = 0,236 > 0,05 kiểm định T - test; M = 0,042 biểu đồ Bland Altman 54 KIẾN NGHỊ Sử dụng kit tự pha chế thay cho kit thương mại đạt chuẩn đánh giá mức độ đứt gãy DNA tinh trùng Phổ biến xét nghiệm đánh giá mức độ đứt gãy DNA tinh trùng sử dụng kit tự pha Trung tâm hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện phụ sản, Trung tâm chẩn đốn điều trị vơ sinh, bệnh nam học TÀI LIỆU THAM KHẢO E A o Urology (2015) Guidelines on Male Infertility, Nguyễn Viết Tiến, Ngơ Huy Tồn Bạch Huy Anh (2009) Nghiên cứu thực trạng vô sinh Việt Nam theo vùng sinh thái, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Đại học Y Hà Nội, A Agarwal, A Mulgund, A Hamada cộng (2015) A unique view on male infertility around the globe Reprod Biol Endocrinol, 13, 37 B L Mehra, K P Skandhan, B S Prasad cộng (2018) Male infertility rate: a retrospective study Urologia, 85 (1), 22-24 Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh Lê Văn Vệ (2009) Vô sinh nam giới, Bệnh học giới tính nam, Nhà xuất Y học, 72-122 Denny S., Mariethoz E., Giancarlo M cộng (1999) Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa Reviews of Reproduction, 4, 31 - 37 Aitken R.J De Iuliis G.N (2010) On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa Molecular Human Reproduction, 16 (1), - 13 Sakkas D Alvarez J.G (2010) Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis American Society for Reproductive Medicine, 93 (4), 1027 - 1036 Monica M et al (2015) Investigation on the Origin of Sperm DNA Fragmentation: Role of Apoptosis, Immaturity and Oxidative Stress Molecular Medicine, 21, 109 - 122 10 I Bejarano, A B Rodriguez J A Pariente (2018) Apoptosis Is a Demanding Selective Tool During the Development of Fetal Male Germ Cells Front Cell Dev Biol, 6, 65 11 Ward W.S., C Barratt D Mortimer (1997) Chromosome organisation in mammalian sperm nucleic Genetics of Human Male Infertility, 205221 12 A Garcia-Peiro, J Martinez-Heredia, M Oliver-Bonet cộng (2011) Protamine to protamine ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm Fertil Steril, 95 (1), 105-109 13 L Marcon G Boissonneault (2004) Transient DNA strand breaks during mouse and human spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling Biol Reprod, 70 (4), 910-918 14 D Sakkas, G Manicardi, P G Bianchi cộng (1995) Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa Biol Reprod, 52 (5), 1149-1155 15 Geoffry N.D et al (2009) DNA Damage in Human Spermatozoa Is Highly Correlated with the Efficiency of Chromatin Remodeling and the Formation of 8-Hydroxy-2 -Deoxyguanosine, a Marker of Oxidative Stress BIOLOGY OF REPRODUCTION, 81, 517 - 524 16 H Billig, I Furuta, C Rivier cộng (1995) Apoptosis in testis germ cells: developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages Endocrinology, 136 (1), 5-12 17 D Xie, C Lu, Y Zhu cộng (2018) Analysis on the association between sperm DNA fragmentation index and conventional semen parameters, blood microelements and seminal plasma ROS in male patients with infertility Exp Ther Med, 15 (6), 5173-5176 18 R J Aitken, M A Baker D Sawyer (2003) Oxidative stress in the male germ line and its role in the aetiology of male infertility and genetic disease Reprod Biomed Online, (1), 65-70 19 O’Flaherty C., Vaisheva F Hales B.F (2008) Characterization of sperm chromatin quality in testicular cancer and Hodgkin’s lymphoma patients prior to chemotherapy Hum Reprod, 23 (52), 1044 20 S E Lewis, R John Aitken, S J Conner cộng (2013) The impact of sperm DNA damage in assisted conception and beyond: recent advances in diagnosis and treatment Reprod Biomed Online, 27 (4), 325-337 21 S E Martenies M J Perry (2013) Environmental and occupational pesticide exposure and human sperm parameters: a systematic review Toxicology, 307, 66-73 22 J Erenpreiss, M Spano, J Erenpreisa cộng (2006) Sperm chromatin structure and male fertility: biological and clinical aspects Asian J Androl, (1), 11-29 23 N H Sơn (2017) Đặc điểm đứt gãy DNA tinh tùng nam giới thất bại hỗ trợ sinh sản, Luận án tốt nghiệp bác sỹ đa khoa, Trường Đại học Y Hà Nội 24 H Utsuno, K Oka, A Yamamoto cộng (2013) Evaluation of sperm head shape at high magnification revealed correlation of sperm DNA fragmentation with aberrant head ellipticity and angularity Fertil Steril, 99 (6), 1573-1580 25 N G Cassuto, A Hazout, I Hammoud cộng (2012) Correlation between DNA defect and sperm-head morphology Reprod Biomed Online, 24 (2), 211-218 26 D S Irvine, J P Twigg, E L Gordon cộng (2000) DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality J Androl, 21 (1), 33-44 27 Sheikh N., Amiri I., Farimani M cộng (2008) Correlation between sperm parameters and sperm DNA fragmentation in fertile and infertile men International Journal of Reproductive BioMedicine, (1), 13 - 18 28 Mã Phạm Quế Mai, Nguyễn Thị Thúy An Nguyễn Trương Thái Hà (2014) Khảo sát mối tương quan số tinh dịch đồ số phân mảnh DNA tế bào tinh trùng người phương pháp Neutral Comet, Hội nghị vô sinh nam nam học lần III, 2014, 29 A Osman, H Alsomait, S Seshadri cộng (2015) The effect of sperm DNA fragmentation on live birth rate after IVF or ICSI: a systematic review and meta-analysis Reprod Biomed Online, 30 (2), 120-127 30 C Avendano, A Franchi, S Taylor cộng (2009) Fragmentation of DNA in morphologically normal human spermatozoa Fertil Steril, 91 (4), 1077-1084 31 Virro M.R., Larson-Cook K.L Evenson D.P (2004) Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles Fertil Steril, 81 (1289-95), 32 A Zini G Dohle (2011) Are varicoceles associated with increased deoxyribonucleic acid fragmentation? Fertil Steril, 96 (6), 1283-1287 33 C G Blumer, R M Fariello, A E Restelli cộng (2008) Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele Fertil Steril, 90 (5), 1716-1722 34 R P Bertolla, A P Cedenho, P A Hassun Filho cộng (2006) Sperm nuclear DNA fragmentation in adolescents with varicocele Fertil Steril, 85 (3), 625-628 35 T Carlini, D Paoli, M Pelloni cộng (2017) Sperm DNA fragmentation in Italian couples with recurrent pregnancy loss Reprod Biomed Online, 34 (1), 58-65 36 Phạm Thị Xuân (2016) Đánh giá đứt gãy ADN tinh trùng nam giới cặp vợ chồng sảy thai, thai lưu, Luận văn tốt ngiệp bác sỹ đa khoa, Đại học Y Hà Nội, 37 L Robinson, I D Gallos, S J Conner cộng (2012) The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis Hum Reprod, 27 (10), 2908-2917 38 J Hamidi, C Frainais, E Amar cộng (2015) A double-blinded comparison of in situ TUNEL and aniline blue versus flow cytometry acridine orange for the determination of sperm DNA fragmentation and nucleus decondensation state index Zygote, 23 (4), 556-562 39 D P Evenson (2016) The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA((R))) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility Anim Reprod Sci, 169, 56-75 40 R Sharma, J Masaki A Agarwal (2013) Sperm DNA fragmentation analysis using the TUNEL assay Methods Mol Biol, 927, 121-136 41 P H Chenlo, S M Curi, M N Pugliese cộng (2014) Fragmentation of sperm DNA using the TUNEL method Actas Urol Esp, 38 (9), 608-612 42 J Ribas-Maynou, A Fernandez-Encinas, A Garcia-Peiro cộng (2014) Human semen cryopreservation: a sperm DNA fragmentation study with alkaline and neutral Comet assay Andrology, (1), 83-87 43 J Ribas-Maynou, A Garcia-Peiro, A Fernandez-Encinas cộng (2013) Comprehensive analysis of sperm DNA fragmentation by five different assays: TUNEL assay, SCSA, SCD test and alkaline and neutral Comet assay Andrology, (5), 715-722 44 S.K Lwanga S Lemeshow (1991) Sample size determination in Health studies, a practical manual., WHO, Geneva, 45 E H Duran, M Morshedi, S Taylor cộng (2002) Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study Hum Reprod, 17 (12), 3122-3128 46 Fernandez et al (2003) Based on Sperm Chromatin Dispersion Test (SCDT) for humans, the sperm DNA integrity in bulls has been assessed by Sperm Bos Halomax (SBH) assay J Androl, 24 (1), 59 - 66 47 P T Hưng (2018) Cải tiến quy trình xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng nam giới vô sinh, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ y khoa, Đại học Y Hà Nội 48 Martin B J Altman D Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement The Lancet, 327 (8476), 307 - 310 Phụ lục HỒ SƠ NGHIÊN CỨU I THÔNG TIN MẪU Số phiếu: Tên bệnh nhân: Tuổi: Giới: Nam Địa chỉ: Xét Kiểm tra mức độ đứt gẫy ADN tinh trùng (kit Halosperm kit tự pha) nghiệm: Ngày làm xét nghiệm: II KẾT QUẢ: Tinh trùng không bị đứt gẫy ADN Tinh trùng bị đứt gẫy ADN (%) (%) Quầng nhiễm sắc rộng Kít Halosperm Quầng Quầng nhiễm sắc vừa nhiễm sắc nhỏ Khơng có quầng nhiễm sắc Thối hóa Khơng có quầng nhiễm sắc Thối hóa Tỷ lệ tinh trùng bị đứt gẫy ADN Quầng nhiễm sắc rộng Kít tự pha chế Quầng Quầng nhiễm sắc vừa nhiễm sắc nhỏ Tỷ lệ tinh trùng bị đứt gẫy ADN Người thực (Ký tên) Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu (Ký, ghi rõ họ tên) Phụ lục BẢNG PHÂN PHỐI CHUẨN STUDENT Phụ lục ĐỘ LẶP LẠI TỐI ĐA CHẤP NHẬN (THEO AOAC) TT 10 Hàm lượng % 100 10 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001 Tỷ lệ chất 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Đơn vị 100% 10% 1% 0,1% 100ppm 10ppm 1ppm 100ppb 10ppb 1ppb RSD 1,3 1,8 2,7 3,7 5,3 7,3 11 15 21 30 ... mục tiêu sau: Hồn thiện quy trình pha chế xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng So sánh kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng nam giới vô sinh xét nghiệm tự pha với kit thương... định mức độ đứt gẫy DNA tinh trùng 51 4.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đánh giá tương đương kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN MINH THU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ VÀ SỬ DỤNG BỘ XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG Chuyên ngành