BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Thanh Vân ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG BIFENTHRIN TRONG MỰC KHÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Thanh Vân ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG BIFENTHRIN TRONG MỰC KHƠ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG TRUNG TS VŨ ĐỨC NAM Hà Nội – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung, số liệu, kết nghiên cứu nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khoa học khác TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thị Thanh Vân LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 104.04-2018.331 Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Quang Trung TS Vũ Đức Nam tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt q trình thực viết luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công Nghệ anh chị Phòng thí nghiệm trọng điểm An tồn thực phẩm Mơi trường tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu môi trường đại Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo giảng dạy khoa Hóa, đặc biệt thầy mơn Hóa Phân tích, cho em kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô tị Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện tốt để em dược học tập hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hóa k27, đặc biệt người bạn nhóm hóa phân tích k27 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình học tập thực đề tài Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ khó khăn tơi Hà Nội, ngày tháng Học viên năm 2019 Nguyễn Thị Thanh Vân MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Tác hại thuốc bảo vệ thực vật 10 1.1.4 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật 11 1.1.5 Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật 13 1.2 GIỚI THIỆU VỀ HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT LOẠI THUỐC TRỪ SÂU 13 1.3 GIỚI THIỆU VỀ HÓA CHẤT THỰC VẬT NHÓM PYRETHROID 14 1.3.1 Giới thiệu chung 14 1.3.2 Cấu tạo tính chất bifenthrin 15 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 17 1.4.1 Phương pháp chiết lỏng-lỏng 17 1.4.2 Phương pháp chiết pha rắn SPE 18 1.4.3 Phương pháp chiết siêu âm 18 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 19 1.5.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao 19 1.5.2 Phương pháp sắc ký khí 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ – KHỐI PHỔ 24 2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 27 2.3.1 Thiết bị 27 2.3.2 Dụng cụ 27 2.3.3 Hóa chất 27 2.4 QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM 28 2.4.1 Khảo sát điều kiện tối ưu phân tích thiết bị GC/MS 28 2.4.2 Xây dựng đường chuẩn 28 2.4.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 29 2.4.4 Đánh giá phương pháp 30 2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 30 2.5.1 Giới hạn phát (MDL), giới hạn định lượng (MQL) 30 2.5.2 Hiệu suất thu hồi 31 2.5.3 Độ lặp lại 31 2.5.4 Độ tái lặp 32 2.5.5 Độ khơng đảm bảo đo mẫu phân tích 32 2.6 THÔNG SỐ THU THẬP MẪU 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 35 3.1.1 Scan lựa chọn mảnh khối cho hợp chất bifenthrin đánh giá độ ổn định thời gian lưu 35 3.1.2 Khảo sát, tối ưu hóa tốc độ khí mang phân tích bifenthrin GC/MS 36 3.1.3 Khảo sát thể tích bơm mẫu 38 3.1.4 Xây dựng đường chuẩn xác định Bifethrin thiết bị GC/MS 38 3.1.5 Đánh giá phương pháp phân tích thiết bị GC/MS 39 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN XỬ LÝ MẪU VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 40 3.2.1 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết siêu âm 40 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm 41 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bay dung mơi khí nitơrogen 42 3.2.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi hợp chất sau qua cột làm 44 3.2.5 Kết thẩm định phương pháp 45 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ATTP: An toàn thực phẩm EPA: Cục Bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ, Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ ADI: Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận LD50: Liều lượng gây chết cho 50% nhóm động vật dùng thử nghiệm HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao GC: Sắc ký khí ECD: Detector cộng kết điện tử MSD: Detector khối phổ MDL: Giới hạn phát MQL: Giới hạn định lượng IDL: Giới hạn phát thiết bị IQL: Giới hạn định lượng thiết bị MDL: Giới hạn phát phương pháp MQL: Giới hạn định lượng phương pháp SIM: Chế độ chọn lọc ion ACN: Acetonitrile MDL: Mức tồn dư tối đa BVTV: Bảo vệ thực vật DANH MỤC BẢNG Bảng Dư lượng tối đa cho phép bifenthrin số 16 Bảng Một số thông số cài đặt thiết bị GC/MS 26 Bảng 2.2 Cách pha điểm chuẩn xây dựng đường chuẩn………………………… 29 Bảng Kết chạy lặp lại thiết bị GC/MS GC/MS/MS 40 Bảng 3 Kết khảo sát thổi khí N2 43 Bảng Hiệu suất thu hồi Bifenthrin qua cột làm 44 Bảng Kết thẩm định phương pháp 46 39 Đường chuẩn Bifenthrin 3000 y = 13.994x - 52.009 R² = 0.9995 Diện tích peak 2500 2000 1500 1000 500 0 50 100 150 200 250 Nồng độ ppb Hình 3 Đường chuẩn Bifenthrin Đường chuẩn xây dựng khoảng nồng độ từ 10 ppb đến 200ppb cho phương trình hồi qui có hệ số tương quan = 0,9995 Điều chứng tỏ có phụ thuộc tuyến tính diện tích peak vào nồng độ chất phân tích khoảng nồng độ 3.1.5 Đánh giá phương pháp phân tích thiết bị GC/MS Giới hạn phát (IDL), Giới hạn định lượng (IQL) thiết bị Giá trị giới hạn phát (IDL) giới hạn định lượng (IQL) thiết bị chất phân tích thơng số quan trọng phương pháp phân tích Việc định lượng xác nồng độ chất phân tích nằm khoảng tuyến tính, tức từ giá trị IQL đến giới hạn tuyến tính (limit of linearity LOL) Trước hết, chúng tơi tính tốn giới hạn định tính giới hạn định lượng thiết bị dựa độ lệch chuẩn 10 lần đo lặp lại điểm chuẩn 10 ppb Chất chuẩn phân tích lặp lại 10 lần điểm chuẩn thiết bị GC/MS/MS ( Thermo scientific) để khẳng định lại khả đáp ứng thiết bị với hợp chất bifenthrin 40 Bảng Kết chạy lặp lại thiết bị GC/MS GC/MS/MS Lần 10 TB SD IDL (ppb) IQL (ppb) GC/MS GC/MS/MS Nồng độ (ppb) 9,46 9,16 10,34 9,34 9,06 10,58 11,00 9,73 10,12 9,95 10,50 10,84 9,06 10,54 10,64 10,93 9,16 9,04 9,08 10,70 9,84 10,08 0,757 0,727 2,13 2,05 7,57 7,27 Kết cho thấy IDL= 2,13 ppb IQL=7,57 ppb hệ thiết bị GC/MS tương đối tốt, phù hợp để phân tích hàm lượng nhỏ hợp chất bifethrin mẫu thực phẩm So sánh với kết thiết bị GC/MS/MS giới hạn phát hạ thấp chi phí phân tích sử dụng thiết bị sắc ký lần khối phổ cao nhiều Điều giúp chứng đáp ứng thiết bị nghiên cứu phù hợp với hợp chất phân tích bifenthrin 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN XỬ LÝ MẪU VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 3.2.1 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết siêu âm Tiến hành khảo sát chiết siêu âm với loại dung môi Diclomethane; hexane; Acetonitrile; Acetone; Toluen Quy trình chiết siêu âm tham khảo theo method EPA 3550C Thời gian chiết siêu âm 40 phút; mẫu chất chuẩn đưa vào vail thủy tinh kín 20 mL, đảm bảo hệ chiết siêu âm kín Kết khảo sát lựa chọn dung mơi chiết đưa hình 3.4 41 Kết khảo sát dung môi chiết Hiệu suất thu hồi 100 80 65.46 60.32 83.12 60 25.42 40 20.12 20 Hexane Toluen Acetone Acetonitrle Diclomethane Loại dung mơi Hình Kết khảo sát dung mơi chiết Biểu đồ hình 3.4 cho thấy dung môi không phân cực hexane, toluen không phù hợp để chiết tách hợp chất bifethrin mẫu mực khô Bản chất bifethrin hợp chất phân cực dung mơi phân cực có khả chiết tách hợp chất Dựa vào hình 3.4 nhận thấy dung mơi acetonitrile cho hiệu suất thu hồi cao = 83,12%; acetone diclomethane 65,46 60,32% Hai loại dung môi dung môi phân cực, nhiên hai dung mơi có nhiệt độ bay thấp qua bước chuyển đổi, dung môi bay nhanh theo chất phân tích Vì để đảm bảo tồn q trình xử lý mẫu bảo tồn tối đa chất phân tích dung mơi acetonitrile lựa chọn để chiết tách hợp chất bifethrin mẫu mực khô 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm Kết đánh giá ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm thay đổi từ 10 đến 70 phút đến hiệu suất thu hồi mẫu thêm chuẩn nồng độ 100 ppb trình bày biểu đồ hình 3.5 42 100 Bifethrin 82.97 84.72 82.84 83.09 Hiệu suất thu hồi (%) 80 65.46 58.49 60 41.62 40 20 20 40 60 Thời gian rung siêu âm (phút) 80 Hình Ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất thu hồi Kết cho thấy với 40 phút siêu âm, hiệu suất thu hồi chất ổn định, tiếp tục tăng thời gian, hiệu suất thu hồi chất khơng tăng Như thấy biểu đồ, hiệu suất thu hồi tối đa phương pháp đạt tới 84,72% Nguyên nhân thất bên ngồi loại bỏ sử dụng vial kín, việc giảm hiệu suất sóng siêu âm làm phân hủy phần chất phân tích Từ thấy vai trò thời gian chiết siêu âm quan trọng Thời gian chiết siêu âm lựa chọn 50 phút cho phương pháp chiết siêu âm mẫu mực khơ phân tích bifenthrin 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bay dung mơi khí nitơrogen Kết khảo sát ảnh hưởng điều kiện thổi khí nitơ đánh giá qua hiệu suất thu hồi mẫu thêm chuẩn thể bảng 3.3 43 Bảng 3 Kết khảo sát thổi khí N2 Nhiệt độ khảo sát Hiệu suất thu hồi (oC) (%) Thời gian dung môi bay (min) 97,23 31,32 10 82,12 28,97 15 75,45 24,23 20 70,87 21,36 25 62,12 18,23 30 38,47 10,65 Kết cho thấy nhiệt độ 30oC tốc độ bay dung môi 10,65 phút, nhanh nhiệt độ 5oC 31,32 phút, nhiên theo bảng 3.3 ta thấy hiệu suất thu hồi với điều kiện 30oC bị giảm = 38,47%, giảm nhiệt độ thổi khí Nitơ hiệu suất thu hồi chất phân tích cao, hợp chất dễ bị phân hủy điều kiện môi trường Ngược lại 5oC thời gian thổi lâu hơp gấp lần hiệu suất thu hồi =98% Do nhận thấy , yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến khả thất thoát chất Mỗi chất hòa tan vào dung mơi có áp suất bão hòa, từ diễn qua trình cân lỏng – Khi làm bay dung môi nitrogen thay đổi cân lỏng hơi, làm tăng tốc độ hóa dung mơi sử dụng, đồng thời thay đổi cân hợp chất phân tích Q trình chuyển pha bay dung mơi thu nhiệt, thực nhiệt độ thấp, cân dịch chuyển sang pha lỏng làm giảm q trình chuyển hóa chất Vì lựa chọn điều kiện thổi bay dung mơi khí Nitơ 5oC thời gian xử lý mẫu kéo dài 44 3.2.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi hợp chất sau qua cột làm Cột làm nhồi Silicagel hoạt hóa cách sấy 130oC vòng 16 tiếng, Na2SO4 [21] Silicagel có tác dụng loại màu tạp chất mẫu, Na2SO4 có tác dụng loại nước dư sau q trình rung siêu âm Tiến hành thí nghiệm thêm chuẩn vào dịch chiết mẫu trắng sau chiết siêu âm với khoảng nồng độ khác Kết đưa bảng 3.4 Bảng Hiệu suất thu hồi Bifenthrin qua cột làm STT Nồng độ thêm chuẩn (ppb) Hiệu suất thu hồi (%) 10 83,56 20 93,24 50 90,54 100 95,56 Kết nhận thấy cột làm silicagel phù hợp để loại bỏ tạp chất có mẫu sau chiết hiệu suất thu hồi khoảng thêm chuẩn nằm khoảng 83,56 – 95,56% phù hợp với tiêu chuẩn AOAC đưa 45 Cân khoảng gam mẫu đồng Chuyển vào vial 50 mL Thêm 30 mL dung môi Acetonitrile Rung siêu âm 50 phút Chuyển 15 mL dịch chiết sang Cột làm Rửa Acetonitrile Cơ quay sau chuyển qua ống thổi Nitơ Thổi N2 5oC đến gần cạn Định mức đến VmL Phân tích GC/MS Hình Quy trình phân tích bifenthrin mẫu mực 3.2.5 Kết thẩm định phương pháp Dựa giá trị IDL thiết bị 2,13 ppb Tiến hành thí nghiệm lặp lại 10 lần mẫu mực khơ thêm chuẩn 10 ng/g , nồng độ đo thiết bị 10 ppb ( 46 khoảng từ 3-5 lần giá trị IDL ) để xác định giới hạn phát định lượng phương pháp Tiến hành thí nghiệm tái lặp thí nghiệm xác định giới hạn phát vào ngày khác tiến hành so sánh hai giá trị trung bình để xác định tính ổn định phương pháp phân tích Thêm chuẩn 100 ppb vào mẫu tiến hành phân tích lặp lại 10 lần xác định hiệu suất thu hồi phương pháp Kết thẩm định phương pháp đưa bảng 3.5 Bảng Kết thẩm định phương pháp Lặp lại Tái lặp Mẫu thêm chuẩn Hiệu suất thu hồi (%) 9,21 8,33 96,76 96,76 10,01 8,34 81,12 81,12 9,14 8,21 98,70 98,70 10,59 10,27 102,68 102,68 10,26 9,57 82,48 82,48 9,38 8,46 83,88 83,88 9,96 9,89 97,62 97,62 10,43 8,17 86,03 86,03 10,62 8,13 94,60 94,60 10 9,46 8,21 90,01 90,01 TB (ng/g) 9,91 8,76 47 SD (ng/g) 0,57 0,82 %RSD 5,77 9,33 MDL (ng/g) 1,61 MQL (ng/g) 5,71 Kết giới hạn phát phương pháp MDL = 1,61 ng/g ; MQL= 5,71 ng/g, nồng độ phù hợp để phân tích lượng vết hợp chất bifethrin mẫu mực khô Hiệu suất thu hồi nằm khoảng ( 80-100%) phù hợp với tiêu chuẩn AOAC cho phép mức hàm lượng 100 ppb Độ lệch chuẩn tương đối RSD% thí nghiệm lặp lại thí nghiệm tái lặp 5,77 % 9,33 % < 15% phù hợp với yêu cầu cho phép AOAC 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU Các mẫu mực khô lấy chợ buôn khu vực tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng,Thanh Hóa, Đà Nẵng Để đảm bảo tính xác chúng tơi tiến hành lấy song song mẫu mực tươi khu vực để phân tích Từ kết luận hàm lượng bifethrin có mực khơ có nguồn gốc tự nhiên hay qua trình chế biến tẩm thêm vào để làm chất bảo quản Theo thực tế thu thập mẫu, mẫu mực khơ ngồi lớp “phấn trắng” tự nhiên có số mẫu xuất lớp bột trắng dễ bong dính vào tay cầm phải Kí mẫu Khơ hiệu QN QN Tươi - Hàm lượng (ng/g) QN QN QN QN QN QN9 - QN QN 10 - 48 Kí mẫu Khơ hiệu ĐN ĐN Tươi Kí mẫu Khơ hiệu HP HP Tươi Kí mẫu Khô hiệu TH TH Tươi - Hàm lượng (ng/g) ĐN ĐN ĐN ĐN ĐN ĐN Hàm lượng (ng/g) HP HP HP HP HP HP Hàm lượng (ng/g) TH TH TH TH TH TH - ĐN ĐN 10 - HP HP 10 - TH 25,67 TH 10 - Chú giải : “-” Không phát (