Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm tạo kháng thể có ái lực cao với fumonisin B1 và B2 (FB1 và FB2), làm nguyên liệu khởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh các độc tố trên. Vật liệu và phương pháp: độc tố FB1 được gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gây miễn dịch cho gà mái.
Trang 1THU NHẬN KHÁNG THỂ IgY CÓ ÁI LỰC CAO VỚI ĐỘC TỐ
VI NẤM FUMONISIN SỬ DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH
Đỗ Như Bình*; Trần Thị Huyền Trang**
Tạ Mai Trang**; Lê Quang Hòa**
TÓM TẮT
Mục tiêu: tạo kháng thể có ái lực cao với fumonisin B1 và B2 (FB1 và FB2), làm nguyên liệu
khởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh các độc tố trên Vật liệu và phương pháp: độc tố FB1 được gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gây miễn dịch cho gà mái Kháng thể IgY tạo ra được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra độ đặc hiệu với FB1 và FB2 thông qua phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp Kết quả: thời điểm thu trứng tốt nhất
từ 9 - 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng và quy trình tinh sạch cho chế phẩm IgY có độ tinh sạch cao Giá trị IC 50 của FB1 và FB2 đối với chế phẩm IgY trong phản ứng ELISA cạnh tranh xác định
được lần lượt là 10 và 49 ng/ml Kết luận: chế phẩm IgY được tạo ra trong nghiên cứu có khả
năng sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất bộ kit nhanh phát hiện nhanh FB
* Từ khoá: Fumonisin; Kháng thể lòng đỏ trứng (IgY); ELISA
Obtaining High Affinity IgY Against Fumonisin with Potential Use
in Immunodiagnostic
Summary
Objectives: To produce high affinity antibody against fumonisin (FB) FB1 and FB2, that can be used as materials for some immunologic methods in detection of toxin Materials and methods: FB1-Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate was made to generate immunogenicity in hen Yolk immunoglobulin (IgY) antibody was purified by extraction and tested the specificity against FB1, FB2
by indirect competitive ELISA Results: The best time for egg collection was 9 - 14 days after the last immunisation and the extraction protocol obtains high purity IgY antibody The IC 50 value of IgY against FB1 and FB2 in the indirect competitive ELISA were 10 and 49 ng/ml, respectively Conclusion: IgY can be used as materials for developing rapid test kit to detect FB
* Key words: Fumonisin; Yolk immunoglobulin (IgY); ELISA
ĐẶT VẤN ĐỀ
Độc tố fumonisin nhóm B (FB), thường
tồn tại trong ngô cũng như các thực phẩm
có nguồn gốc từ ngô, được sản sinh từ
chủng nấm Fusarium moniliforme [1]
Trong đó, FB1 và FB2 được coi là hai độc
tố phổ biến, có độc tính cao nhất trong nhóm fumonisin, gây nhiều bệnh ở người
và động vật như chứng nhũn não ở ngựa, chứng phù phổi ở lợn, có độc tính đối với gan thận ở nhiều loài khác và ung thư thực quản ở người [5, 7]
* Học viện Quân y
** Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Như Bình (binhvef2006@gmail.com)
Ngày nhận bài: 10/04/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/05/2016
Ngày bài báo được đăng: 27/05/2016
Trang 2Hiện nay, phương pháp chuẩn để phát
hiện và định lượng FB1, FB2 trong các
mẫu thực phẩm đều dựa trên kỹ thuật sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương
pháp này yêu cầu cao về thiết bị cũng
như trình độ kỹ thuật viên, do vậy không
thích hợp với các phép phân tích sàng lọc
tại hiện trường Gần đây, nhờ ứng dụng
kỹ thuật sắc ký miễn dịch dưới dạng que
thử với hợp phần quan trọng nhất trong
que thử phát hiện FB là kháng thể [4] việc
phát hiện độc tố vi nấm nói chung và FB
nói riêng đã được đơn giản hóa Mục tiêu
của nghiên cứu: Sản xuất kháng thể IgY
kháng FB1 bằng cách gây đáp ứng miễn
dịch ở gà IgY được vận chuyển qua lòng
đỏ trứng, do vậy có thể tinh sạch với số
lượng lớn từ trứng gà bằng phương pháp
kết tủa đơn giản, chi phí thấp [2, 3]
V ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
Gà siêu trứng Ai Cập, số lượng 03 con
do Trang trại Gà giống Thụy Phương
(Long Biên, Hà Nội) cung cấp Hóa chất
sử dụng gồm: độc tố FB1 (Santa Cruz
Biotechnology), FB2 (Sigma), kháng thể
chuột đơn dòng kháng FB1 (Biotez), các
cộng hợp phát hiện gắn HRP kháng KLH
(Gallus Immunotech) và kháng IgY (Santa
Cruz Biotechnology) cùng những hóa
chất khác (Hãng Thermo Scientific, Sigma
và Promega)
2 Phương pháp nghiên cứu
* Chế tạo cộng hợp KLH-FB1 và
BSA-FB1:
Để tạo liên kết giữa FB1 với KLH,
chúng tôi sử dụng glutaraldehyde để nối
gốc -NH2 của KLH và FB1 Cuối cùng,
các cầu nối glutaraldehyde dư chưa gắn được với FB1 sẽ cho tác dụng với 6,5 mg L-lysine (Sigma) với điều kiện có khuấy trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng Sau quá trình thẩm tích loại FB1 tự do, sản phẩm cuối cùng tạo ra là cộng hợp KLH-FB1 Cộng hợp BSA-FB1 được chế tạo để làm đối chứng dương cho quy trình
* Kiểm tra hiệu quả tạo cộng hợp KLH-FB1:
Cộng hợp KLH-FB1 được đặc tính hóa thông qua kỹ thuật ELISA kẹp đôi Đo các giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng
450 nm và 630 nm bằng máy đọc khay vi thể (Synergy HT, BioTek) Hiệu số của các giá trị OD450nm và OD630nm thể hiện lượng cộng hợp KLH-FB1 có trong mẫu
* Tiêm cộng hợp gây miễn dịch trên gà mái:
02 gà mái đang thời kỳ đẻ trứng được tiêm gây đáp ứng miễn dịch với liều 0,2 mg cộng hợp KLH-FB1 trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá chất FCA (Freund’s complete adjuvant) ở ngày đầu tiên Sau
10 ngày (ngày thứ 10), tiêm nhắc lại gà lần thứ nhất với liều 0,1 mg cộng hợp KLH-FB1 trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá chất FIA (Freund’s incomplete adjuvant) 10 ngày tiếp theo (ngày thứ 20), tiêm nhắc lại gà lần thứ hai với liều lượng tương tự như lần tiêm nhắc lại thứ nhất Trứng gà không tiêm cũng như trứng gà tiêm KLH-FB1 ở các thời điểm sau khi tiêm thu lại để tinh sạch kháng thể IgY nhằm kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA
* Tinh sạch IgY từ trứng gà:
Tách kháng thể IgY trong trứng gà thu được ở các thời điểm tiêm khác nhau theo phương pháp kết tủa PEG (Polson
và CS, 1985) [6] Sau đó, hòa tan kết tủa
Trang 3thu được trong 3 ml PBS và đổi đệm
bằng cột 100 kDa (Ultracell, Millipore) với
PBS để thu nhận chế phẩm IgY tinh sạch,
định lượng bằng cách đo OD ở bước
sóng 280 nm và kiểm tra độ tinh sạch
bằng điện di SDS-PAGE (12%)
* Xác định thời điểm thu trứng có hiệu
giá kháng thể IgY cao nhất với FB1:
Tiến hành kỹ thuật ELISA gián tiếp để
tìm ra thời điểm thu trứng cho hiệu giá
kháng thể IgY cao nhất với FB1 Cường
độ màu càng mạnh, lượng IgY kháng FB1
có trong mẫu càng nhiều
* Xác định khả năng phản ứng của chế
phẩm IgY với FB1 và FB2:
Xác định khả năng phản ứng của chế
phẩm IgY với FB1 và FB2 bằng kỹ thuật
ELISA cạnh tranh Cho ủ lượng IgY lần
lượt với 0, 1, 10, 100 và 1.000 ng FB1
hoặc FB2 trong 30 phút ở 37oC trước khi
cho vào giếng Để đánh giá khả năng
phản ứng của chế phẩm IgY thu nhận
được với FB1 và FB2, tiến hành xác định
các giá trị IC50 của FB1 và FB2 (nồng độ
FB1 và FB2 ức chế 50% phản ứng của
IgY với BSA-FB1 trong ELISA cạnh
tranh) Tính giá trị này theo hàm hồi quy
logistic dựa trên mối liên quan giữa giá trị
log của lượng FB1 và FB2 với giá trị OD
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Đặc tính hóa cộng hợp KLH-FB1
bằng ELISA kẹp đôi
Cộng hợp KLH-FB1 chế tạo trong
nghiên cứu này trước khi tiêm gây miễn
dịch trên gà được kiểm tra hoạt tính bằng
phản ứng với kháng thể đơn dòng kháng
FB1
Hình 1: Hiệu quả phản ứng của cộng hợp KLH-FB1 với kháng thể đơn dòng chuột
kháng FB1
(Giá trị OD được tính bằng hiệu số
trung bình ± độ lệch chuẩn)
Khi lượng cộng hợp KLH-FB1 đạt
1 ng/giếng, tương ứng với nồng độ 10 ng/ml, giá trị OD thu được bắt đầu có sự sai khác có ý nghĩa so với mẫu kiểm chứng Kết quả này phù hợp với nghiên cứu về hiệu quả cộng hợp của FB1 với protein mang đã được công bố với lượng cộng hợp cho kết quả dương tính trong phép thử ELISA nằm trong khoảng từ 1 -
300 ng/giếng [7, 8] Từ đây, có thể nhận thấy đã tạo thành công cộng hợp KLH-FB1 và có thể sử dụng cộng hợp này để gây đáp ứng miễn dịch cho gà
2 Đánh giá độ tinh sạch của kháng thể IgY bằng SDS-PAGE
Sau quá trình tinh sạch bằng phương pháp kết tủa với PEG và siêu lọc với cột
100 kDa, lượng IgY thu được từ một quả trứng đạt 40 - 50 mg (căn cứ theo kết quả
đo OD ở bước sóng 280 nm, không trình bày trong bài báo) Đánh giá độ tinh sạch của các chế phẩm IgY bằng phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE
Trang 4Hình 2: Điện di SDS-PAGE (12%) kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể IgY sau các
bước của quy trình tinh sạch
(M: Marker protein Gangnam Stain; 1: 10 µg kháng thể IgY sau khi kết tủa với PEG;
2,3,4: 3, 10, 30 µg kháng thể IgY sau siêu lọc với cột 100 kDa)
Ngoài các băng ở vị trí 65 kDa, tương
ứng với tiểu phần lớn của IgY và 25 kDa,
tương ứng với tiểu phần nhỏ của IgY, chế
phẩm IgY sau khi kết tủa với PEG vẫn
chứa hai protein tạp có kích thước
khoảng 40 và 45 kDa Tuy nhiên, sau khi
siêu lọc qua cột 100 kDa, loại bỏ hoàn
toàn được protein tạp nhiễm này Ngay
cả khi điện di 30 µg chế phẩm IgY cũng
không quan sát được các băng nhiễm tạp
này Như vậy, quy trình tinh sạch kết hợp
kỹ thuật siêu lọc và kết tủa với PEG cho
phép tạo ra chế phẩm IgY có độ tinh sạch cao
3 Lựa chọn thời điểm thu trứng cho hiệu giá kháng thể cao nhất
IgY từ trứng gà không tiêm, trứng gà tiêm PBS và tá chất FCA/FIA, cũng như trứng gà thu ở các thời điểm khác nhau sau khi tiêm cộng hợp gây đáp ứng miễn dịch đã được tinh sạch và kiểm tra khả năng phản ứng cộng hợp BSA-FB1 thông qua kỹ thuật ELISA gián tiếp
Hình 3: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY.
Trang 5Kết quả thử nghiệm cho thấy IgY thu
được từ trứng gà không tiêm cũng như
trứng gà tiêm PBS và tá chất FCA/FIA
không phản ứng với BSA-FB1 Chứng tỏ
trước khi tiêm cộng hợp, gà không có đáp
ứng miễn dịch với FB1, cũng như PBS và
các thành phần tá dược không gây đáp
ứng miễn dịch trên gà tạo IgY có phản
ứng với FB1 Trong khi đó, gà được tiêm
cộng hợp KLH-FB1, kể từ ngày thứ 23
sau tiêm, trong trứng bắt đầu tạo IgY có
phản ứng với FB1 Hiệu giá kháng thể đối
với FB1 đạt mức cao nhất trong khoảng
29 - 34 ngày sau tiêm, hay 9 - 14 ngày
sau lần tiêm cuối cùng Như vậy, với quy
trình gây đáp ứng miễn dịch gồm 3 lần
tiêm, khoảng cách giữa các lần tiêm 10
ngày, lượng cộng hợp KLH-FB1 sử dụng
là 0,2 và 0,1 mg, hiệu giá kháng thể đạt cao nhất ở thời điểm 9 - 14 ngày sau lần tiêm cuối, phù hợp với nghiên cứu của Schade và CS [7] ít nhất cần phải có 2 lần tiêm kháng nguyên để gây tính đáp ứng miễn dịch trên gà, kháng thể tinh sạch từ lòng đỏ trứng, nên kiểm tra 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng xem còn tính đáp ứng miễn dịch hay không?
4 Xác định khả năng phản ứng của chế phẩm IgY với FB1 và FB2
Để đánh giá khả năng phản ứng của chế phẩm IgY thu nhận được với FB1 và FB2, chúng tôi tiến hành xác định các giá trị IC50 của FB1 và FB2 (nồng độ FB1 và FB2 ức chế 50% phản ứng của IgY với BSA-FB1 trong ELISA cạnh tranh)
Ngay ở nồng độ thử nghiệm nhỏ nhất
(10 ng/ml) (tương ứng với lượng độc tố
FB1 và FB2 đưa vào giếng 1 ng), các giá
trị OD thu được giảm mạnh so với mẫu
kiểm chứng Khi nồng độ FB1 và FB2 đạt
mức 1 µg/ml, giá trị OD hầu như không
giảm nữa, mặc dù nồng độ tăng lên đến
10 µg/ml Giá trị IC50 của FB1 xác định
được là 10 ng/ml, trong khi đó IC50 của FB2 là 49 ng/ml
So với nghiên cứu của Marcel và CS [5], các giá trị IC50 của FB1 với 14 dòng kháng thể chuột đơn dòng nằm trong khoảng 300 - 670 ng/ml Như vậy, có thể nhận thấy ái lực của chế phẩm IgY tạo ra trong nghiên cứu này cao hơn nhiều lần
Hình 4: Khả năng phản ứng của IgY với FB1 và FB2
A IgY và FB1 B IgY và FB2
Trang 6so với kháng thể đơn dòng trong nghiên
cứu trên Nghiên cứu của Yan-son và CS
(2012) [10], IC50 của FB1 với kháng thể
đơn dòng là 11 ng/ml, đồng thời kháng
thể đơn dòng này cũng có phản ứng chéo
với FB2 (60,4%) Các thông số này khá
trùng khớp với kết quả thu được của
chúng tôi
Xét về mặt giá thành, nếu sử dụng 0,5 µg
chế phẩm IgY cho một phép thử miễn
dịch như đã nêu ở trên, theo tính toán, từ
một quả trứng gà lựa chọn ở thời điểm tối
ưu, chúng tôi có thể tinh sạch được 40 -
50 mg chế phẩm IgY đủ để thực hiện từ
80.000 - 100.000 phản ứng miễn dịch
Đây chính là ưu điểm cơ bản của việc sử
dụng kháng thể IgY để chế tạo phép thử
miễn dịch phát hiện nhanh FB nói riêng
và các tác nhân gây bệnh nói chung
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã tạo thành công chế
phẩm IgY có ái lực cao với FB1 và FB2,
có khả năng sử dụng trong các sinh phẩm
miễn dịch phát hiện độc tố Hiện nay, chế
phẩm này đang được sử dụng để chế tạo
que thử sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh
các độc tố FB trong thực phẩm Phản
ứng chéo của kháng thể IgY với độc tố vi
nấm khác như aflatoxin, ochratoxin A,
zearalenone sẽ được tiếp tục đánh giá
trong thời gian tới
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Antonissen G et al Fumonisins affect
the intestinal microbial homeostasis in broiler
chickens, predisposing to necrotic enteritis
Vet Res 2015, 46 (1), p.98
2 Chalghoumi R, Y Beckers, D Portetelle,
A Théwis Hen egg yolk antibodies (IgY),
production and use for passive immunization
against bacterial enteric infections in chicken:
a review Biotechnol Agron Soc Environ
2009, 13 (2), pp.295-308
3 Dias dSW; DV Tambourgi IgY:
a promising antibody for use in immunodiagnostic and in immunotherapy Vet Immunol Immunopathol 2010, 135, pp.173-180
4 Kadir MKA, IE Tothill Development of
an electrochemical immunosensor for fumonisins detection in foods Toxins Basel 2010, 2 (4), pp.382-398
5 Marcel H, Elissalde et al Development
of an improved monoclonal antibody‐based Elisa for fumonisin b1–3 and the use of molecular modeling to explain observed detection limits 7 (2), Food and agricultural immunology 1995, pp.109-122
6 Polson A, T Coetzer, J Kruger, E vonMaltzahn, KJ vanderMerwe Immunol
Invest 1985, 14, p.323
7 Schade R, Calzado EG, Sarmiento R, Chacana PA, Porankiewicz-Asplund J, Terzolo HR Chicken egg yolk antibodies
(IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine Altern Lab Anim
2005, 33 (2), pp.129-154
8 Venkataramana M, K Navya CS, SR Priyanka, HS Murali, HV Batra Development
and validation of an immunochromatographic assay for rapid detection of fumonisin B1 from cereal samples J Food Sci Technol 2014, 51 (9), pp.1920-1928
9 Wang DS, Liang YX, Nguyen TC, Le
DD, Tanaka T, Ueno Y Natural co-occurrence
of fusarium toxins and aflatoxin B1 in corn for feed in north Vietnam Nat Toxins 1995, 3 (6), pp.445-449
10 Yan-Song L, Z Yu, L Shi-Ying, G De-Jun, R Hong-Lin, M Xian-Mei, BHZL Chao, W Zhe, L Xiao-Bing, L Zeng-Shan Development
of a one-step test strip for rapid screening of fumonisins B1, B2 and B3 in maize Food Control 2012, 24, pp.72-77
