BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN VĂN CÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI SINH KHỐI VI TẢO Thalassiosira pseudonana ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS ĐỖ THỊ HOA VIÊN PGS TS ĐẶNG DIỄM HỒNG HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu Luận án trung thực chưa tác giả khác công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc hoàn thành Luận án cảm ơn thông tin trích dẫn Luận án ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu Luận án Hà Nội, ngày TM Tập thể hướng dẫn PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên tháng Nguyễn Văn Công i năm 2019 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đỗ Thị Hoa Viên - người Thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ bảo suốt thời gian học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - người Thầy giúp định hướng nội dung, giúp đỡ tinh thần, kiến thức chuyên môn, sở vật chất bảo tận tình giúp tơi vượt qua nhiều khó khăn để hồn thành Luận án suốt thời gian thực Tơi xin tỏ lòng thành kính biết ơn sâu sắc tới Cố PGS TS Nguyễn Kim Đường - người Thầy có góp ý chân thành hỗ trợ tơi tinh thần suốt chặng đường học tập hoàn thành Luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp đỡ tơi hồn thành thí nghiệm q trình hồn thành Luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn cán Phòng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam: TS Lưu Thị Tâm, TS Ngơ Thị Hồi Thu, NCS Lê Thị Thơm, NCS Nguyễn Cẩm Hà…đã tạo điều kiện giúp đỡ thực phần nội dung nghiên cứu Luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đồn Lan Phương, Phòng Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ hỗ trợ tơi thực phân tích lipít thành phần axít béo Luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn giải phẫu sinh lý Bệnh, Học viện Qn y, Bộ Quốc phòng giúp tơi thử nghiệm động vật thực nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý Thầy, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giúp đỡ hướng dẫn, bảo suốt thời gian thực Luận án Nhân dịp này, xin cảm ơn anh chị, em Phòng Đào tạo Trường Đại học Bách khoa Hà Nội ủng hộ tinh thần giúp đỡ tơi cơng việc phòng để tơi hồn thành Luận án Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ tạo điều kiện tốt cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành Luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Văn Công ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Những điểm luận án Cấu trúc luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung vi tảo nuôi trồng thủy sản 1.1.1 Giá trị dinh dưỡng vi tảo 1.1.2 Sử dụng vi tảo ương nuôi ấu trùng động vật thân mềm 1.1.3 Sử dụng vi tảo nuôi luân trùng artemia 1.1.4 Sử dụng vi tảo sản xuất giống cá biển 1.1.5 Vi tảo sử dụng trại sản xuất giống tôm biển tôm thẻ chân trắng 1.2 Giới thiệu Thalassiosira pseudonana 1.2.1 Vị trí phân loại Thalassiosira pseudonana 1.2.2 Đặc điểm sinh học sinh sản Thalassiosira pseudonana 1.2.3 Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana 10 1.2.3.1 Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana giới 10 1.2.3.2 Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana Việt Nam 14 1.2.4 Ứng dụng Thalassiosira pseudonana sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 18 1.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng Thalassiosira pseudonana 19 1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng giới Việt Nam 22 1.3.1 Trên giới 22 1.3.2 Ở Việt Nam 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu 30 iii 2.1.1 2.1.2 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 Đối tượng nghiên cứu 30 Hóa chất thiết bị 30 Các môi trường nuôi cấy 31 Phương pháp nghiên cứu 32 Phương pháp chụp ảnh hình thái tế bào 32 Phương pháp sinh học phân tử 33 Xác định điều kiện ni cấy thích hợp Thalassiosira pseudonana quy mơ phòng thí nghiệm pilot 34 2.3.4 Xác định thông số sinh trưởng Thalassiosira pseudonana 38 2.3.5 Phân tích thành phần sinh hóa sinh khối Thalassiosira pseudonana 39 2.3.5.1 Phương pháp phân tích hàm lượng lipít tổng 39 2.3.5.2 Phương pháp phân tích thành phần hàm lượng axít béo bão hòa khơng bão hòa đa nối đơi 40 2.3.5.3 Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng kim loại nặng 40 2.3.6 Nghiên cứu ứng dụng Thalassiosira pseudonana sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 40 2.3.6.1 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn hành vi động vật thực nghiệm sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana 40 2.3.6.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng loại thức ăn đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng 42 2.3.6.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng 43 2.3.6.4 Phương pháp thử nghiệm nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng với nguồn giống sản xuất Thalassiosira pseudonana 45 2.3.7 Xử lý số liệu nghiên cứu 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Đặc điểm sinh học Thalassiosira pseudonana 48 3.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào Thalassiosira sp 48 3.1.2 Định tên khoa học Thalassiosira sp kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA 50 3.1.3 Nghiên cứu lưu giữ, khả sinh sản sinh trưởng Thalassiosira pseudonana 52 3.1.3.1 Lưu giữ Thalassiosira pseudonana nhiệt độ phòng 53 3.1.3.2 Đặc điểm sinh học sinh sản Thalassiosira pseudonana 54 3.1.3.3 Sinh trưởng Thalassiosira pseudonana 54 3.2 Điều kiện nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana quy mô khác 55 iv 3.2.1 Điều kiện thích hợp để ni sinh khối Thalassiosira pseudonana quy mơ phòng thí nghiệm 56 3.2.1.1 Quy mơ bình thủy tinh 0,25 L 56 3.2.1.2 Quy mơ bình thuỷ tinh L 66 3.2.1.3 Quy mơ bình thủy tinh L 75 3.2.2 Điều kiện thích hợp để nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana quy mô pilot 84 3.2.2.1 Quy mô bể composite 0,2 m 84 3.2.2.2 Quy mô bể composite m 89 3.2.2.3 Quy mô bể composite 3,5 m 92 3.2.2.4 Quy trình cơng nghệ ni Thalassiosira pseudonana quy mơ phòng thí nghiệm pilot 96 3.2.3 Thành phần hóa học sinh khối Thalassiosira pseudonana quy mô pilot 99 3.3 Ứng dụng Thalassiosira pseudonana sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 105 3.3.1 Đánh giá độ an toàn tác dụng sinh dược sinh khối Thalassiosira pseudonana để làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng 105 3.3.1.1 Độc tính cấp Thalassiosira pseudonana 106 3.3.1.2 Độc tính bán trường diễn Thalassiosira pseudonana 107 3.3.1.3 Hành vi chuột thực nghiệm sau sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana 111 3.3.2 Sử dụng Thalassiosira pseudonana sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 111 3.3.2.1 Ảnh hưởng loại thức ăn đến sinh trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng 111 3.3.2.2 Ảnh hưởng mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng 117 3.3.2.3 Thử nghiệm nuôi thương phẩm với nguồn giống sản xuất Thalassiosira pseudonana 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 135 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 137 TÀI LIỆU THAM KHẢO 138 PHỤ LỤC 151 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt ALT Alanine aminotransferase ANOVA Analysis of variance Phân tích phương sai ARA Arachidonic acid Axít arachidonic AST Aspatate aminotransferase CĐAS Cường độ ánh sáng CĐSK Chế độ sục khí CFU/g Colony Forming unit per Đơn vị khuẩn lạc gram CHLB Cộng hòa liên bang C.P Charoen pokphand DHA Docosahexaenoic acid Axít docosahexaenoic DLG Daily length gain Tăng trưởng tuyệt đối chiều dài DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxiribonucleic DPA Docosapentaenoic acid Axít docosapentaenoic DWG Daily weigh gain Tăng trưởng tuyệt đối khối lượng ĐC EHP Đối chứng Enterocytozoon Bệnh vi bào tử trùng hepatopanaei EPA Eicosapentaenoic acid Axít eicosapentaenoic FCR Feed conversion ration Tỉ lệ chuyển đổi thức ăn HUFA Highly unsaturated fatty Axít béo khơng bão hòa acid IHHN Infectious hypodermal and Bệnh hoại tử vỏ quan tạo haematopoietic necrosis máu virus IMN Infectious myonecrosis Bệnh hoại tử KP Khẩu phần KPH Khơng phát L Lít LD Lethal dose Liều gây chết động vật thí nghiệm vi LM Light Microscope Kính hiển vi quang học M3 Cubic metre Mét khối MĐTB Mật độ tế bào MUFA Monounsaturated fatty acid Axít béo khơng bão hòa nối đơi NHP Necrotising Bệnh hoại tử gan tụy hepatopancreatitis NTTS Nuôi trồng thủy sản N/L Nauplii/lít PCR Polymerase chain reaction Phản ứng PCR PUFA Polyunsaturated fatty acid Axít béo khơng bão hòa đa nối đơi QCVN Quy chuẩn Việt Nam RNA Ribonucleic acid Axít ribonucleic rRNA Ribosomal ribonucleic acid ARN riboxom SEM Scanning electron Kính hiển vi điện tử quét microscope SFA Saturated fatty acid Axít béo bão hòa SKK Sinh khối khơ TATH Thức ăn tổng hợp TB Tế bào TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TFA Total fatty acid Axít béo tổng số TN TS Thử nghiệm Taura syndrome in Penaeus Hội chứng Taura vannamei TTCT VASEP Tôm thẻ chân trắng Vietnam association seafood exporters of Hiệp hội chế biến xuất thủy and sản Việt Nam producers VPA: Vibrio parahaemolyticus : Bệnh hoại tử gan - tụy cấp AHPND Acute hepatopancreatic necrosis disease VTDD Vi tảo dị dưỡng WSD White spot syndrome virus Bệnh đốm trắng YHD Yellow head disease Bệnh đầu vàng vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Một số loài vi tảo sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm biển tôm thẻ chân trắng Nhu cầu dinh dưỡng ấu trùng tôm thẻ chân trắng 26 Diện tích sản lượng, giá trị xuất tôm nuôi nước lợ 2010 - 2017 27 Thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi vi tảo Thalassiosira pseudonana 32 Chế độ cho ăn ấu trùng tôm thẻ chân trắng 44 Chế độ siphon thay nước bể ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng 44 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái tế bào Thalassiosira sp phân lập quan sát kính hiển vi LM SEM 49 Bảng 3.2 Tỉ lệ % độ tương đồng khoảng cách di truyền đoạn gen 18S rRNA loài thuộc chi Thalassiosira 51 Bảng 3.3 Thành phần hàm lượng axít béo sinh khối Thalassiosira pseudonana ni trồng bể composite 3,5 Bảng 3.4 m3 99 Thành phần hóa học Thalassiosira pseudonana 103 Bảng 3.5 Kết theo dõi biểu bất thường sau uống Thalassiosira pseudonana chuột 106 Bảng 3.6 Ảnh hưởng Thalassiosira pseudonana trọng lượng Bảng 3.8 thể chuột 107 Ảnh hưởng Thalassiosira pseudonana lên số tiêu huyết học chuột 108 Ảnh hưởng Thalassiosira pseudonana lên công thức bạch Bảng 3.9 cầu máu chuột 109 Đánh giá mức độ tổn thương tế bào chức gan, thận Bảng 3.7 chuột dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày 109 Bảng 3.10 Ảnh hưởng số phần thức ăn lên sinh trưởng ấu trùng tôm thẻ chân trắng 112 Bảng 3.11 Tăng trưởng khối lượng, tỉ lệ sống thời gian biến thái ấu trùng tôm thẻ chân trắng nuôi loại thức ăn khác 112 viii Bảng 3.12 Tăng trưởng chiều dài thân ấu trùng tôm thẻ chân trắng nuôi thức ăn phần 116 Bảng 3.13 Tăng trưởng khối lượng, tỉ lệ sống thời gian biến thái ấu trùng tôm thẻ chân trắng nuôi thức ăn phần 116 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Ảnh hưởng mật độ tơm ni đến tăng trưởng kích thước ấu trùng tôm thẻ chân trắng 118 Ảnh hưởng mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng khối lượng thời gian biến thái ấu trùng tôm thẻ chân trắng 120 Bảng 3.16 Tăng trưởng chiều dài ấu trùng tôm thẻ chân trắng mật độ tơm ni thích hợp 122 Bảng 3.17 Tăng trưởng khối lượng thời gian biến thái ấu trùng tôm thẻ chân trắng mật độ tơm ni thích hợp 123 Bảng 3.18 Thành phần axít béo tơm thẻ chân trắng giai đoạn postlarvae 12 nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana bể xi măng 30 m3 125 Bảng 3.19 Hàm lượng kim loại kháng sinh giống tôm thẻ chân trắng postlarvae 12 nuôi thức ăn Thalassiosira Bảng 3.20 pseudonana tươi sống bể nuôi 30 m3 126 Kết tăng trưởng chiều dài tôm thẻ chân trắng nuôi Bảng 3.21 thương phẩm 128 Tăng trưởng khối lượng tôm thẻ chân trắng nuôi thương phẩm 129 Bảng 3.22 Bảng 3.23 Tỉ lệ sống tôm thẻ chân trắng nuôi thương phẩm 130 Hàm lượng protein, kim loại kháng sinh tôm nguyên liệu ni từ mơ hình thử nghiệm 131 ix ... Thalassiosira pseudonana 1.2.2 Đặc điểm sinh học sinh sản Thalassiosira pseudonana 1.2.3 Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana 10 1.2.3.1 Công nghệ nuôi Thalassiosira pseudonana. .. trưởng Thalassiosira pseudonana 52 3.1.3.1 Lưu giữ Thalassiosira pseudonana nhiệt độ phòng 53 3.1.3.2 Đặc điểm sinh học sinh sản Thalassiosira pseudonana 54 3.1.3.3 Sinh. .. nhiễm tạp vi sinh vật; vi c lưu giữ tảo giống chưa nuôi trồng T pseudonana quy mơ lớn sử dụng lồi cho TTCT Vi c chứng minh tính an tồn sinh khối T pseudonana nuôi trồng sử dụng chúng cho sản xuất