VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** BÙI ANH VĂN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** BÙI ANH VĂN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ MAI HƯƠNG Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận nhiều giúp đỡ thầy cô, anh chị gia đình Với tất lịng chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Mai Hương người tận tình giúp đỡ, bảo, hướng dẫn thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa để tơi hồn thiện luận văn Tơi xin đươc bày tỏ lịng biết ơn đến đề tài “Nghiên cứu metagenome vi sinh vật đất vùng rễ số trồng Việt Nam: thuốc có củ (cây nghệ), cơng nghiệp (cà phê) nhằm tăng suất chất lượng trồng” MS: ĐTĐLCN.14/4 thuộc chương trình Hợp tác Nghiên cứu Việt Nam – Hà Lan, PGS.TS Lê Mai Hương chủ nhiệm cho hội thực nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Nguyên tận tình truyền đạt cho tơi kiến thức suốt năm học tập, tảng cho trình nghiên cứu luận văn, hành trang quý báu theo suốt đời Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Đình Luyện, Ths Hồng Kim Chi tập thể cán cơng tác phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học Hợp chất thiên nhiên giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình thân u tơi, người bên tôi, ủng hộ động viên chỗ dựa vững để yên tâm học tập hồn thành khóa học Cuối tơi xin kính chúc q Thầy, Cơ, Anh, Chị gia đình dồi sức khỏe, thành cơng nghiệp! Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, chưa sử dụng cho bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho hoàn thành luận văn cảm ơn Các thơng tin, tài liệu trình bày luận văn ghi rõ nguồn gốc./ Tác giả luận văn ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.) 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học 1.2 Đại cương khu hệ nấm vùng rễ 1.2.1 Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae) 1.2.2 Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae) 1.2.3 Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) 1.2.4 Một số loại nấm rễ khác 1.2.5 Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ 1.2.6 Tính chuyên hóa khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ 10 1.3 Vai trò khu hệ nấm vùng rễ 11 1.4 Nấm vùng rễ thuốc 15 1.5 Một số yếu tố tác động đến khu hệ nấm vùng rễ 15 1.5.1 Ảnh hưởng yếu tố lý học 15 1.5.2 Sự tương quan nhóm vi sinh vật với khu hệ nấm vùng rễ.17 1.6 Một số nghiên cứu khu hệ nấm vùng rễ 17 1.6.1 Trên giới 17 1.6.2 Việt Nam 21 1.7 Công nghệ metagenomics nghiên cứu khu hệ vi sinh vật 23 1.7.1 Giới thiệu công nghệ metagenomics 23 1.7.2 Công nghệ metagenomics nghiên cứu khu hệ vi sinh vật đất .24 CHƯƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 iii 2.1 NGUYÊN LIỆU 26 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 26 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 26 2.1.5 Môi trường 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 27 2.2.2 Phân lập bào tử AM 28 2.2.3 Phân lập chủng nấm vùng rễ 28 2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến khu hệ AM 29 2.2.5 Hoạt tính sinh enzyme ngoại bào 29 2.2.6 Tách chiết DNA tổng số 29 2.2.7 Kỹ thuật PCR 30 2.2.8 Phương pháp Tách dịng gen thơng qua vector pBT 31 2.2.9 Đọc phân tích trình tự 32 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh 34 3.2 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu đến khu hệ nấm AM vùng rễ Curcuma longa L 35 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến khu hệ AM 38 3.4 Phân lập chủng nấm vùng rễ khác 42 3.4.1 Phân lập mẫu rễ 42 3.4.2 Phân lập mẫu đất vùng rễ 43 3.5 Khả sinh enzyme ngoại bào 45 CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết Luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 56 iv DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Viết đầy đủ AM Endomycorrhizae EM Ectomycorrhizae AEM Nấm rễ nội cộng sinh khơng có màng ngăn SEM Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Cây nghệ vàng trơng Hưng n [48] Hình 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47] Hình 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46] Hình 1: Bào tử AM phân lập từ mẫu đất N1t N11t 35 Hình 2: Khả sinh enzyme ngoại bào 47 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Trình tự mồi sử dụng cho định danh chủng nấm 30 Bảng 2: Trình tự mồi cho định danh chủng nấm AM 31 Bảng 1: Số lượng bào tử AM tổng số 100g đất phân lập 34 Bảng 2: Số lượng thành phần nấm AM mẫu đất vùng rễ khoảng thời gian khác 35 Bảng 3: Số lượng thành phần nấm AM mẫu đất vùng rễ điều kiện nitơ khác 40 Bảng 4: Đặc điểm chủng nấm phân lập từ rễ nghệ 44 Bảng 5: Đặc điểm chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ nghệ .46 Bảng 6: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm phân lập vii 47 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Tổng số lồi chi nấm AM có mẫu đất 37 Biểu đồ 2: Tổng số lồi chi nấm AM có mẫu đất vùng rễ điều kiện bón nitơ khác 41 Biểu đồ 3: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm phân lập 47 viii CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá bảng 3.4, bảng 3.5 biểu đồ 3.3 nhận thấy số chủng nấm phân lập từ rễ củ, tương đồng với chủng phân lập từ đất đặc điểm khuẩn lạc, sắc tố tiết mơi trường, hoạt tính enzyme ngoại bào (NB02 - NB24, NB06 - NB29, NB07 - NB21, NB16 - NB37) Kết củng cố thêm tính đa dạng khu hệ nấm vùng rễ nghệ vàng 48 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết Luận  Từ mẫu đất vùng rễ nghệ vàng (Curcumin longa L.) thu thời điểm sau cấy tháng (N1t) 11 tháng (N11t), Phân lập bào tử AM cho tổng số bào tử 100g đất N1t: 19 ± 1bào tử N11t: 94 ± bào tử  Bằng phương pháp phân tích metagenomics mẫu đất thu được: - Đã đánh giá ảnh hưởng thời gian thu mẫu tới thành phần khu hệ nấm AM vùng rễ Xác định thời gian thu mẫu tối ưu thu hoạch (11 tháng) - Xác định ảnh hưởng, tác động nhân tố nitơ đến khu hệ nấm AM, hàm lượng nitơ 150kg/ha/năm điều kiện tối ưu nitơ tốt cho khu hệ nấm AM vùng rễ nghệ vàng  Từ mẫu rễ, đất vùng rễ nghệ vàng (Curcumin longa L.) phân lập phân nhóm 39 chủng nấm vùng rễ với màu sắc khuẩn lạc đa dạng, khuẩn lạc màu trắng đặc trưng - Xác định khả sinh enzyme sinh ngoại bào chủng phân lập - Một số chủng nấm tương đồng màu sắc khuẩn lạc, hoạt tính sinh enzyme ngoại bào (NB02 - NB24, NB06 - NB29, NB07 - NB21, NB16 - NB37) 4.2 Kiến nghị Từ kết nghiên cứu cho thấy nghiên cứu khu hệ nấm vùng rễ hướng nghiên cứu có tiềm lớn Đặc biệt lĩnh vực hợp chất thiên nhiên nhằm tìm hợp chất lĩnh vực y học nơng nghiệp Vì nên chúng tơi đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu khu hệ nấm vùng rễ nghệ vàng (Curcumin longa L.) phương pháp phân lập cổ điển kỹ thuật metagenomics 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Kim Liên, Lê Thị Thủy, Nguyễn Viết Hiệp, Nguyễn Huy Hoàng, Nghiên cứu đa dạng hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza đất rễ cam Quỳ Hợp, Nghệ An, Tạp chí sinh học, 34(4) (2012) 441 Lê Quốc Huy, Nguyễn Minh Châu, 2004 Công nghệ nấm rễ ứng dụng keo lai keo tai tượng vườn ươm rừng trồng Tạp chí KH & CN, Bộ NN&PTNT 3, tr 400-404 Phạm Quang Thu, Đặng Như Quỳnh (2008), “Đặc điểm sinh trưởng hệ sợi hình thành rễ nấm số lồi nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn nuôi cấy khiết”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn 12, tr.84-90 Phạm Quang Thu, Đặng Như Quỳnh, (2007), “Thành phần nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn thông” Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, số 18 tháng 11/2007 Tăng Thị Chính, Bùi Văn Cường, (2007) “Nghiên cứu đa dạng nấm cộng sinh Arbuscular mycorrhiza cỏ Vetiver từ đất nhiễm chì” Báo cáo khoa học Sinh thái Tài nguyên sinh vât, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật, 1, tr:216-221 Trần Thị Dạ Thảo, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2007), “Ảnh hưởng phân lân đến sinh trưởng, suất, tồn lưu dinh dưỡng mật độ nấm cộng sinh bắp (Zea mays L.) vùng đất xám tỉnh Tây Ninh vụ Đông Xuân năm 2004-2005”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nơng Lâm Nghiệp (1&2), tr 82-87 Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Nguyễn Đình Luyện, Posta Katalin, Lê Mai Hương, Phân lập, nhân nuôi lưu giữ định tên số 50 nấm rễ nội cộng sinh lúa cà chua Bắc Việt Nam, Tạp chí Khoa học Công nghệ 50 (4) (2012) 521 Trần Văn Mão (2004), “Ứng dụng nấm cộng sinh sinh vật phịng trừ sâu hại”, Sử dụng vi sinh vật có ích tập Võ Văn Chi (1997), “Từ điển thuốc Việt Nam”, Nxb Y học, Hà Nội, tr 267-270 TIẾNG ANH 10.Allen EE and Banfield JF (2005) Community genomics in microbial ecology and evolution Nat Rev Microbiol 3: 489-498 11.Bi Guochang, Zang Mu, Guo Xiuzhen (1989), “Distribution of ectomycorrhizal fungi under several chief forest types in alpine coniferou region of northwestern yunnan”, Scientia Silvae Sinicae, 25(1), pp 33-39 12.Cathy L Cripps and Leslie H Eddington (2005) Distribution of Mycorrhizal Types among Alpine Vascular Plant Families on the Beartooth Plateau, R°Cky Mountains, U.S.A., in Reference to LargeScale Patterns in Arctic–Alpine Habitats Arctic, Antarctic, and Alpine Research, 37, (2), 2005, pp 177–188 13.Chen K and Patcher L (2005) Bioinformatics for whole-genome shortgun sequencing of microbial communities PLoS Comput Biol 1: 24 14.Douds D.D., and Millner P.D., (1999) “Biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi in agroecosystems” Agr Eco Env, 74, pp 77-99 15.Douds D.D., and Millner P.D., (1999) “Biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi in agroecosystems” Agr Eco Env, 74, pp 77-99 16.Gallo M.B.C., Guimarase D O., Luciano da S Momesso, Monica T Pupo (2008), “Natural Products from Endophytic Fungi”, Microbial Biotechnology, pp 139-168 17.González-Chávez, C., D’Haen, J., Vangronsveld, J., Dodd, J.C., (2002) “Coper sorption and accumulation by the extraradical mycelium 51 ofdifferent Glomus spp (arbuscular mycorrhizal fungi) isolated from the same polluted soil” Plant and Soil 240, pp 287 – 297 18.Guhardja E., “Rainforest ecosystems of East Kalimantan” (2000), Springer, pp 1130-1154 19.Gupta, P.K., (2000), “Soil, plant, water and fertilizer analysis” Vedems eBooks(P)Ltd(India), chapter 13, pp 246-255 20.Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM (1998) Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products Chem Biol 5(10): 245-249 21.Healy FG, Ray RM, Aldrich HC, Wilkie AC, ILO and Shanmugam KT (1995) Direct isolation of functional genes encoding cellulases from the microbial consortia in a thermophilic, anaerobic digester maintained on lign°Cellulose Appl Microbiol Biotechnol 43: 667-674 22.Iqbal Z, Caccamo M, Turner I, Flicek P and McVean G (2012) De novo assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn graphs Nat Genet 44: 226-232 23.Jan-Erik Nylund (1978), “The ectomycorrhizal infection zone and its relation to acids polysaccharides of cortical cell walls”, New Phytologist, 106, pp 505-516 24 Julie C Lee, Emil Lobkovsky, Nathan B Pliam, Gary Strobel, and Jon Clardy (1995) Subglutinols A and B: Immunosuppressive compounds from the endophytic fungus Fusarium subglutinans 60 (22), pp 7076–7077 25.Luciano Avio, Maurizio Castaldini, Arturo Fabiani, Stefano Bedini, Cristiana Sbrana, Alessandra Turrini, Manuela Giovannetti (2013) Impact of nitrogen fertilization and soil tillage on arbuscular mycorrhizal fungal communities in a Mediterranean agroecosystem, Soil Biology and Biochemistry 67, P 285-294 26.Lussier FX, Chambenoit O, Côté A, Hupé JF, Denis F, Juteau P, Beaudet R and Shareck F (2011) Construction and functional screening of a 52 metagenomic library using a T7 RNA polymerase-based expression cosmid vector J Ind Microbiol Biotechnol 38 (9): 1321-1328 27.Mei-ling XU, Jiao-jun ZHU, Hong-zhang KANG, Jin-xin Zhang, Fengqin Li (2008), “Optimun conditions for pure culture of major ectomycorrhizal fungi obtained from Pinus Sylvestris var Mongolica plantation in southeastern Keerpin sandy lands, China”, Journal of Forestry Research, Springer, pp 113-118 28.Pace NB and Delong EF (1991) Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing Journal of Bacteriology 173 (14): 4371-4378 29.Pace NB, Stahl DA, Lane DJ and Olsen GJ (1985) Analyzing natural microbial populations by rRNA sequences ASM News 51: 4-12 30 Rai M.K., Varma A (2005) ”Arbuscular mycorrhiza like biotechnological potential of piriformospora indica, which promotes the growth of Adhatpda vasica Nees” Elect J Biotechnol Chile, 8, pp 107-112 31.Riesenfeld CS, Goodman RM and Handelsman J (2004) Uncultured soil bacteria are a reservoir of new antibiotic resistance genes Environ Microbiol 6: 981-989 32.Russell J., Rodriguez Regina S Redman Joan M Henson (2005), “Symbiotic Lifestyle Expression by Fungal Endophytes and the Adaptation of Plants to Stress: UNBaveling the Complexities of Intimacy”, Taylor & Francis Group, LLC 34, pp 683-695 33.S.E Smith and D.J Read (1997), “Mycorrhizal Symbiosis” (2nd Edition) Academic Press: London, UK, 2, pp 605 34.Stein JL, Marsh TL, Wu KY, Shizuya H, DeLong EF (1996) Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40- kilobase-pair genome fragment front a planktonic marine archaeon J Bacteriol 178: 591-599 53 35.Taylor T N, Remy W, Hass A, and Kerp H (1995) Fossil arbuscular mycorrhizae from the Early Devonian Mycologia 87, pp 560 – 573 36.Tringe SG, Von Mering C, Kobayashi A, Salamov AA, Chen K, Chang HW, Podar M, Short JM, Mathur EJ and Detter JC (2005) Comparative metagenomics of microbial communities Science 308: 554557 37.Turmel M.S.,(2004) “Exposing the Mycorrhizaes in Agriculture” University of Manitoba, Winnipeg, MB R3T 2N2 38.Tyson GW, Chapman J, Hugenholtz P, Allen EE, Ram RJ, Richardson PM, Solovyev VV, Rubin EM, Rokhsar DS and Banfield JF (2004) Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment Nature 428: 37-43 39.Vanden B.D.A., Vlietlinck A.J.,(1991), “Methods in Plant Biochemistry”, Academic press , NewYork 40.Venter JC; Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D, Eisen JA, Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson W, FOTUs DE, Levy S, Knap AH, Lomas MW, Nealson K, White O, Peterson J, Hoffman J, Parsons R, Baden-Tillson H, Pfannkoch C, Rogers Y, Smith HO (2004) Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea Science 304 (5667): 66-74 41.Vestberg M., Saari K., Kukkonen S., Hurme T., (2005) ”Mycotrophy of crops in rotation and soil amendment with peat influence the abundance and effectiveness of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi in field soil” Mycorrhiza 15(6), pp 447-458 42 X Hardeman F and S Sjoling (2007) Metagenomic approach for the isolation of a novel low-temperature-active lipase from uncultured bacteria of marine sediment FEMS Microbiol Ecol 59: 524-53 54 TÀI LIỆU WEBSIDE 43 httf://mycorrhizas.info/vam.html 44 https.//invam.wvu.edu 45 httf://invam.caf.wvu.edu/index.html 46 https://en.wikipedia.org/wiki/Ectomycorrhiza 47 https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Endomycorrhizal_fungi 48 http://vtvcantho.vn/cach-trong-va-cham-soc-cay-nghe-vang-6604.html 55 PHỤ LỤC Hình ảnh số chủng nấm phân lập STT Kí hiệu NB01 NB02 NB03 Đặc điểm khuẩn lạc 56 NB04 NB05 NB06 57 NB07 NB08 NB09 58 10 NB10 11 NB11 12 NB12 59 13 NB13 14 15 NB15 60 16 NB16 20 NB20 21 NB21 61 22 NB29 23 NB34 62 ... thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa để tơi hồn thiện luận văn Tơi xin đươc bày tỏ lịng biết ơn đến đề tài ? ?Nghiên cứu metagenome vi sinh vật đất vùng rễ số trồng Vi? ??t Nam: thuốc có củ (cây nghệ),. . .VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM VI? ??N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** BÙI ANH VĂN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ KHẢO... diện loài vi sinh vật khác, sản phẩm mà chúng tạo trình sống, tạo thành chất ức chế hoạt động sống? ?của lồi vi sinh vật như: + Vi sinh vật nitrat hóa tồn phát triển đất, có nhiều ammoniac, chất sản