BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS HỒNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh- 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan thông tin đƣợc viết luận văn thực hƣớng dẫn nhiệt tình Ts Hồng Quốc Khánh Mọi kết nghiên cứu nhƣ ý tƣởng, với thông tin nghiên cứu khác đƣợc trích dẫn rõ ràng, cụ thể luận văn Nội dung đề tài luận văn chƣa đƣợc bảo vệ Hội đồng khoa học bảo vệ luận văn Thạc sĩ chƣa đƣợc cơng bố Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm lời cam đoan Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019 Ngƣời cam đoan Ngô Đức Duy i LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ vào hƣớng dẫn nhiệt tình Ts Hồng Quốc Khánh tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thầy Cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi hoàn thành khóa học, Thầy Giảng viên Học Viện Khoa học Công nghệ Cảm ơn Gs Yasuo Igarashi, Gs Masahura Ishii Trƣờng GSALS (The Graduate School of Agricultural and Life Sciences), Đại học Tokyo Nhật Bản, hỗ trợ kỹ thuật tài cho nghiên cứu thuộc dự án “Kết hợp bền vững nông nghiệp địa phƣơng với công nghiệp chế biến biomass” JICA (Japan International Cooperation Agency), JST (Japan Science and Technology Agency) Đại học Bách Khoa TP.HCM Lời cảm ơn Anh Chị đồng nghiệp; Ts Kouji Yoshida, Ts Mannix Pedro, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Ngọc Phƣơng Thảo, Nguyễn Hoàng An, Nguyễn Ngọc Liên, Ts Nguyễn Hồng Dũng Em phòng Vi sinh hỗ trợ nhiều nghiên cứu Với chia vui buồn từ bạn Học viên Cao học động lực cho tơi hồn thành luận văn Đặc biệt gửi lời cảm ơn tới Mẹ Cha, vợ Trần Thị Hồng Vân, Ngô Đức Anh, Ngô Đức Dũng nhiều Anh Chị Gia đình ln ủng hộ điều kiện Ngô Đức Duy ii LỜI NÓI ĐẦU Hiện định danh chủng vi sinh khơng nhiều khó khăn nhƣ trƣớc, phát triển kỹ thuật sinh học phân tử đại với phƣơng pháp đa dạng độ xác cao Phần lớn định loại lồi trƣớc ln dựa vào trình phân lập chủng sàng lọc đặc tính quan trọng cho mục đích nghiên cứu Tuy nhiên có nghiên cứu đỏi hỏi biết rõ thành phần loài vi sinh tồn mẫu vật, trình thay đổi thành phần, số lƣợng chủng loài phụ thuộc nhiều vào thành phần chất, điều kiện sống trình trao đổi chất Trong tự nhiên vi sinh vật đa dạng, mức độ thay đổi theo điều kiện mơi trƣờng, phức tạp tính di truyền cộng đồng vi sinh thông qua việc xác định gene trƣớc tiên dựa kỹ thuật sinh học phân tử Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử dụng hầu hết lĩnh vực nghiên cứu gene công nghệ sinh học, có kỹ thuật phân tích PCR-DGGE tách độc lập riêng biệt trình tự gene với độ chuẩn xác khác biệt nuclotide Chính mà sử dụng kỹ thuật DGGE xác định cộng đồng vi khuẩn mẫu mà không cần giai đoạn phân lập làm chủng, bên cạnh kết hợp với kỹ thuật Tạo dòng nghiên cứu giúp hiệu suất nghiên cứu cao tăng tính ứng dụng đa dạng phƣơng pháp sinh học phân tử phân tích cộng đồng vi sinh vật Mục tiêu nội dung nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp PCRDGGE tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn rơm trƣớc sau ủ Nhằm phân tích đánh giá khả biến động đa dạng vi khuẩn có nguồn rơm ủ dựa kỹ thuật sinh học phân tử Tạo tảng cho việc phân lập, tuyển chọn loài vi khuẩn nhƣ chịu nhiệt, sinh cellulase định hƣớng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học tƣơng lai iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT APS: Ammonium Persulfate BA: Bis-Acrylamine bp: base pairs CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide DFB: Diffusion buffer DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DNA: Deoxylribonucleic acid dNTPs: Deoxyrinonucleotide triphosphates EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid PCR: Polymerase Chain Reaction PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis RAPD: Random amplified polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms RNA: Ribonucleic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris Acetic TEMED: Tetramethyl ethylene diamine UF: Urea Formamide UV: Ultra violet iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất Thế giới Bảng 1.2 Thành phần cấu tạo chung rơm rạ Bảng 1.3 Thành phần hóa học rơm rạ Bảng 1.4 Số liệu thống kê sản lƣợng gạo rơm rạ giới Bảng 1.5 Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định số bệnh lúa mì 17 Bảng 2.1 Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3 28 Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3 29 Bảng 2.6 Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine 30 Bảng 2.7 Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh 31 Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR 35 v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1.Diện tích gieo trồng, suất sản lƣợng gạo Việt Nam……….3 Hình 1.2 Qui trình phân giải cellulose thành glucose 10 Hình 2.1 Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu rơm 22 Hình 2.2 Qui trình thực nghiên cứu 25 Hình 2.3 Qui trình ly trích thu nhận DNA từ mẫu rơm 26 Hình 2.4 Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie 33 Hình 2.5 Cấu trúc pGEM@-T Easy vector hãng Omega 34 Hình 3.1 Biểu đồ thay đổi nhiệt độ qúa trình ủ rơm 38 Hình 3.2 Kết ly trích thu nhận DNA gene vi sinh mẫu R 39 Hình 3.3 Kết sản phẩm PCR DGGE đoạn gene V3 mẫu R 40 Hình 3.4 Cây phát sinh loài vi khuẩn mẫu R 41 Hình 3.5 Kết sản phẩm PCR DGGE đoạn gene V3 mẫu Rn 43 Hình 3.6 Kết thu nhận sản phẩm tạo dòng 44 Hình 3.7 Kết 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 45 Hình 3.8 Kết 30 sản phẩm DGGE chạy hệ thống BioRad 46 Hình 3.9 Cây phát sinh lồi vi khuẩn mẫu Rn 47 Hình 3.10 Thử khả sinh cellulase đĩa CMC mẫu Rn 48 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii LỜI NÓI ĐẦU iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ vi MỤC LỤC vii CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ 1.1 Rơm rạ 1.2 Thành phần cấu tạo rơm rạ 1.3 Giá trị kinh tế rơm rạ 1.2 HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM 1.2.1 Hệ Enzyme cellulase chế phân giải cellulose 1.2.2 Hệ vi sinh phân giải cellulose 11 1.3.KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH 12 1.3.1 Các phƣơng pháp ly trích thu nhận DNA vi sinh vật 12 1.3.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử định danh 14 1.3.2.1 Kỹ thuật PCR trong định danh vi khuẩn 16 1.3.2.2 Kỹ thuật PCR-DGGE định danh vi khuẩn 18 1.3.2.3 Kỹ thuật tạo dòng 20 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1.VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 22 Hóa chất 23 Thiết bị dụng cụ 24 2.2.CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 vii 2.2.1.Phƣơng pháp ly trích thu nhận DNA 26 2.2.2 Phƣơng pháp PCR nhân gene 16S rDNA vùng gene V3 27 2.2.3 Phƣơng pháp tinh sản phẩm gene V3 29 2.2.4 Phƣơng pháp thực kỹ thuật DGGE 30 2.2.4.1 Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine thực DGGE 30 2.2.4.2 Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide 32 2.2.4.3 PCR gene V3 sau thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F 517R 33 2.2.5 Phƣơng pháp tạo dòng 34 2.2.6 Giải trình tự gene V3 xây dựng phát sinh loài 35 2.3 Khảo sát sinh cellulase phƣơng pháp đĩa CMC 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết kiểm tra nhiệt độ 38 3.2 Kết thu nhận DNA genome vi sinh vật mẫu rơm 39 3.3 Kết thu nhận gene 16S rDNA gene V3 mẫu R 40 3.4 Kết phân tích liệu cộng đồng vi khuẩn mẫu R 41 3.5 Kết DNA, gene 16S rDNA gene V3 mẫu Rn 42 3.6 Kết tạo dòng vector pGEM@-T Easy hãng Promega 43 3.7 Kết thu nhận vùng gene V3 sau tạo dòng 44 3.8 Kết kiểm tra gene V3 sau tạo dòng kỹ thuật DGGE 45 3.9 Kết sơ định tính enzyme cellulase mẫu Rn 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 viii 45 Hình 3.7 Kết 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 thể gel agarose 1% đƣợc ly trích thu nhận từ vi kuẩn E.coli JM109 đƣợc chèn vào vector pGEM@-T Easy (A B) 3.8 Kết kiểm tra gene V3 sau tạo dòng kỹ thuật DGGE Lấy kết sản phẩm PCR hình 3.7(A, B) thực phƣơng pháp DGGE từ kết vị trí mẫu gene V3 cho thấy gene tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần lại 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 30 tƣơng ứng với gene Rn4 So sánh sản phẩm DGGE với hình 3.5D cho thấy vị trí đoạn gene phƣơng pháp DGGE tạo dòng điều cho kết giống 46 Hình 3.8 Kết 30 sản phẩm DGGE chạy hệ thống BioRad với nguồn điện 200volt/300phút gel polyarylamide 40-60% (A, B) Chọn đại diện đoạn gene V3 sản phẩm tạo dòng tƣơng ứng với vị trí đoạn gene Rn cho mẫu nhƣ sau; gene 5, 26, xem hình 3.8 (A,B) sản phẩm tạo dòng Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 sản phẩm DGGE xem hình 3.5(D) giải trình tự gene so sánh kết liệu gene đoạn V3 ngân hàng liệu NCBI với công cụ BLAST Kết trình tự đoạn gene giống Rn1, gene 26 giống Rn2, gene giống Rn3 tƣơng tự gene với Rn4 Dựa vào so sánh tính tƣơng đồng mẫu trình tự Rn với tham chiếu Genbank với mức cụ thể nhƣ sau; Kết cho thấy gene (Rn1) tƣơng đồng với chi Agrobacterium 96%, gene 26 (Rn2) gene (Rn3) thuộc chi Clostridium với mức độ tƣơng đồng gần với chủng Clostridium thermocellum, Clostridium aurantibutyricum lần lƣợt tƣơng ứng 99%, 98% gene (Rn4) có mức độ tƣơng đồng với lồi Agrobacterium 95% xem hình 1.9 Thơng qua kỹ thuật PCR-DGGE tạo dòng với kết thu đƣợc giống mẫu Rn, lại hai chi Clostridium, Agrobacterium Vì giai đoạn rơm ủ nhiệt độ tăng khoảng 70-800C thời gian ủ kéo dài khoảng 18 ngày, làm cho diện tính đa dạng dòng vi khuẩn khơng nhƣ mẫu rơm ban đầu nhƣ kết phân tích hình 1.1D 1.2 [70] 47 Hình 3.9 Cây phát sinh loài vi khuẩn mẫu Rn Dựa phân tích trình tự vùng gen V3 (Rn1, Rn2, Rn3 Rn4) với chủng vi khuẩn ngân hàng liệu NCBI Các vi khuẩn đƣợc xác định phổ biến gặp phải đống phân ủ giai đoạn cuối chu kỳ ủ phân đại diện cho vi khuẩn ƣa ấm, nhiệt độ 10-400C (mesophilic bacteria) phát triển nhƣ Staphylococcus sp, Staphylococcus aureus, Bacillus sp B subtilis, B brevis, B polymyxa lồi chiếm ƣu bắt đầu q trình ủ phân tất loại phân ủ dần biến hồn tồn sau 20 ngày, lại nhóm vi khuẩn Bacillus sp có khả tạo bào tử Ngồi có nhóm nấm Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Fusarium moniliforme, Rhizopus nigricans, Penicillium citrinum nhiều công bố nghiên cứu [69.70.71] 48 3.9 Kết sơ định tính enzyme cellulase mẫu Rn Xác định khả tồn enzyme cellulase mẫu Rn (Rn1, Rn2 Rn3) thông qua phƣơng pháp đĩa CMC nhằm kiểm tra kết sơ định tính có diện enzyme cellulase tạo vòng phân giải CMC mơi trƣờng thạch đĩa xem hình 3.10 Hình 3.10 Thử khả sinh cellulase đĩa CMC mẫu Rn Kết cho thấy mẫu rơm rạ sau có enzyme cellulase Chứng tỏ nhóm vi khuẩn tồn mẫu rơm rạ suốt trình ủ có khả sinh enzyme cellulase nhằm phân hủy cellulose rơm rạ cung cấp nguồn glucose cho tồn phát triển Tóm lại: Mẫu Rơm (Rn) đƣợc thu nhận xã Tân Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp cho kết sản phẩm PCR từ thu nhận DNA gene nhân đoạn gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA dựa cặp mồi chung 357F-GC 517R Thơng qua phân tích cộng đồng vi khuẩn kỹ thuật DGGE cho đoạn gene V3 Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 Kỹ thuật Tạo dòng cho phân đoạn gene tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần lại 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 30 tƣơng ứng với gene Rn4 Ngoài mẫu Rơm (R) cho thấy tính đa dạng vi khuẩn mẫu chƣa thơng qua ủ khoảng chi lại khoảng chi vi khuẩn sau giai đoạn ủ Kỹ thuật phân tích PCR-DGGE Tạo dòng áp dụng cho việc phân tích cộng đồng vi khuẩn nói riêng 49 nhóm vi sinh nói chung loại mẫu khác nhau, điều kiện hệ vi sinh ln ln thay đổi bên cạnh giúp định hƣớng phân lập giống vi khuẩn hỗ trợ cho nghiên cứu từ kết phân tích kỹ thuật PCR-DGGE tạo dòng 50 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Kết phân tích mẫu rơm trƣớc ủ (R) với phƣơng pháp PCR-DGGE thu đƣợc gene R1 ứng với chi Agrobacterium, R2 thuộc chi Clostridium, R3 tƣơng ứng với chi Bacteroidetes, R4 tƣơng tự chi Thermopolysporasa R5 thuộc chi Bacillus Kết phân tích mẫu rơm sau ủ (Rn) với phƣơng pháp PCR-DGGE tạo dòng cho thấy gene Rn1 (gene 5) gene Rn4 (gene 3) tƣơng đồng với chi Agrobacterium, gene Rn2 (gene 26) gene Rn3 (gene 8) thuộc chi Clostridium Kết liệu gene mẫu R có đa dạng vi khuẩn khoảng chi, mẫu Rn tính đa dạng vi khuẩn khoảng chi Điều cho thấy biến động đa dạng vi khuẩn giai đoạn rơm ủ Việc sử dụng so sánh kỹ thuật PCR-DGGE tạo dòng với mẫu Rn cho kết hồn tồn giống vị trí gel polyacrylamide trình tự gene đoạn gene V3 mẫu Rn Điều sử dụng độc lập kỹ thuật PCR-DGGE tạo dòng phân tích cộng đồng vi sinh vật kết hợp hai phƣơng pháp với 4.2 Kiến nghị Cần phân tích thơng số ngoại sinh ảnh hƣởng trực tiếp gián tiếp ụ rơm ủ nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, pH kết hợp kiểm tra thay đổi cộng đồng vi khuẩn liên tục theo ngày chất lƣợng rơm suốt giai đoạn ủ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2017, Rice Market Monitor FAO Su HJ., Bo SK.,Joo SK., 2008, Production of bio-oil from rice straw and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast pyrolysis plant equipped with a fluidized bed and a char separation system, J Anal Appl Pyrolysis, 82, pp 240–247 Kapoor M., Soam S., Agrawal R., Gupta RP., Tuli DK and Kumar R., 2017, Pilot scale dilute acid pretreatment of rice straw and fer-mentable sugar recovery at high solid loadings, Bioresour Technol, 224, pp.688-693 Wi SG., Choi IS., Kim KH., Kim HM., Bae HJ., 2013, Bioethanol production from rice straw by popping pretreatment, Biotechnol Biofuel, 6(1) Pp 1-7 Belal EB., 2013, Bioethanol production from rice straw residues, Braz Microbiol, 44(1), pp 225-234 Yang B., Dai Z., Ding SY., Wyman C E., 2011, Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass, Biofuels, 2(4), pp.421-449 Abe K., Yano H., 2009, Comparison of the characteristics of cel-lulose microÞ bril aggregates of wood, rice straw and potato tuber, Cellulose, vol 16(6), pp 1017-1023 Hallac BB., Ragauskas AJ., 2011, Analyzing cellulose degree of polymerization and its relevancy to cellulosic ethanol, Biofuels Bioprod Bioref, 5(2), pp.215-225 Lê Đức Ngoan, 2005, Giáo trình thức ăn gia súc, Nhà xuất Nơng nghiệp 10 Fan G., Wang M., Liao C., Fang T., Li J., Zhou R., 2013, Isolation of cellulose from rice straw and its conversion into cellulose acetate catalyzed by phosphotungstic acid, Carbohydr Polym, 94(1), pp.71-76 52 11 Wang H., Ben H., Ruan H., Zhang L., Pu Y., Feng M., 2017, Effects of lignin structure on hydrodeoxygenation reactivity of pine wood lignin to valuable chemicals, ACS Sustain Chem Eng, 5(2), pp.1824-1830 12 Oladosu Y., RaÞi MY., Abdullah N., Magaji U., Hussin G., Ramli A., 2016, Fermentation quality and additives: a case of rice straw silage, Biomed Res Int, p.1-14 13 Nguyen HV., Nguyen CD., Tran TV., Hau HD., Nguyen NT., Gummert M., Energy effciency, greenhouse gas emissions, and cost of rice straw collection in the mekong river delta of vietnam Field Crops Res, 198, pp.16-22 14 Balagurumurthy B., Srivastava V., Vinit KJ., Biswas B., Singh R., 2015, Value addition to rice straw through pyrolysis in hydrogen and nitrogen environments, Bioresour Technol, 188, pp.273-279 (2015) 15 Jung SH., Kang BS., Kim JS., 2008, Production of bio-oil from rice straw and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast pyrolysis plant equipped with a ß uidized bed and a char separation system, J Anal Appl Pyrolysis, 82(2), pp.240-247 (2008) 16 Wu W., Yang M., Feng Q., McGrouther K., Wang H., Lu H., 2012, Chemical characterization of rice straw-derived biochar for soil amendment, Biomass Bioenerg, 47, pp.268-276 (2012) 17 Nguyễn Đức Lƣợng, 2010, Công nghệ sản xuất enzyme Nhà xuất Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh 18 Yang B., 2011, Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass Biofuels 2, pp.421-449 19 Shewale J., 1982, β-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose, International Journal of Biochemistry, 14, pp.435443 53 20 Wiseman JWA., 1983, Fungal and other β-dglucosidases: their properties and applications, Enzyme and Microbial Technology, 4, pp 73– 79 21 Wilson DB., 2008, Three microbial strategies for plant cell wall degradation, Annals of the New York Academy of Sciences, 1125, pp.289297 22 Oyeleke S., Okusanmi T., 2008 Isolation and characterization of cellulose hydrolysing microorganism from the rumen of ruminants, African Journal of Biotechnology 23 Huang S., 2012, Isolation and identification of cellulolytic bacteria from the gut of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae), International journal of molecular sciences, 13, pp.2563-2577 24 Hu X., 2014, Cellulolytic bacteria associated with the gut of Dendroctonus armandi Larvae (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), Forests, 5, pp.455-465 25 Schwarz W., 2001, The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria, Applied microbiology and biotechnology, 56, pp.634649 26 Rastogi G., 2009, Isolation and characterization of cellulosedegrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA, Journal of industrial microbiology & biotechnology, 36, pp.585-598 27 Kluepfel D.,1986, Characterization of cellulase and xylanase activities of Streptomyces lividans, Applied microbiology and biotechnology, 24, pp.230-234 28 Semêdo L., 2004, Streptomyces drozdowiczii sp nov., a novel cellulolytic streptomycete from soil in Brazil, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 54, pp 1323-1328 54 29 Schrempf H., Walter S., 1995, The cellulolytic system of Streptomyces reticuli, International journal of biological macromolecules, 17, pp.353-355 30 Chang CC., 2009, Activity of cellulase from Thermoactinomycetes and Bacillus spp isolated from Brassica waste compost, Scientia Agricola, 66, pp.304-308 31 Mba CC., 1997, Rock phosphate solubilizing Streptosporangium isolates from casts of tropical earthworms, Soil Biology and Biochemistry, 29, pp.381-385 32 Shahriarinour M., 2011, Screening, isolation and selection of cellulolytic fungi from oil palm empty fruit bunch fibre, Biotechnology, 10, pp.108-113 33 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2008, Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục 34 Ausubel FM., Brent R., Kinhston RE.,, Moore DD., Seidman JG., Smith JA., Struhl K., 1992, Current protocols in molecular biology, New York: Greene Publishing Association; Wiley-Interscience, vol.1 35 Zhu H., Qu F., Zhu LH., 1993, Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride, Nucleic Acids Res, 21, pp.5279- 5280 36 Zhou J., Bruns MA., Tiedje JM., 1996, DNA recovery from soils of diverse composition, Appl Environ Microbiol, 62, pp.316 - 322 37 Jara C., Mateo E., Guillamón JM., Torija MJ., Mas A., 2008, Analysis of several methods for the extraction of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for characterization by PCR based methods, International Journal of Food Microbiology, 128, pp.336-321 38 Jia X., Han J., Zhao YH., Zhou YM., 2006, Comparisons of extraction and purification methods of soil microorganism DNA from rhizosphere soil, Journal of Forestry Research, 17, pp 31 - 34 55 39 Sabine W., Stephan S., Ralf C., 2001, Bacterial Populations Colonizing and Degrading Rice Straw in Anoxic Paddy Soil, Appl Environ Microbiol, 67, pp.1318- 1327 40 Sung HG., 2007, Low ruminal pH reduces dietary fiber digestion via reduced microbial attachment, Association Animal Production Societies, 20, pp 200 - 207 41 Vila RC., Kazuo M., Susumu A., Makoto K., 2003, Succession and phylogentic composition of bacterial communities responsible for the composting process of rice straw estimated by PCRDGGE analysis, Soil Sci Plant Nut, 49, pp 619 - 630 42 Haruta S., Cui Z., Huang Z., Li M., Ishii M., Igarashi Y., 2002, Construction of a stable microbial community with high cellulose degradation ability, Appl Microbiol Biotechnol, 59(4), pp 529 - 534 43 Saiki R., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H., 1985, Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science, 230, pp.1350-4 44 Arvind Kumar Singh, 2012, Molecular taxonomy: use of modern methods in the identification of species, Indian J.L.Sci, 2(1), pp.143-147 45 Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H., 1986, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 51, pp.63-73 46 Mullis K., Faloona F., 1987, Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, Methods Enzymol,155, pp.335-350 47 Arvind Kumar Singh, 2012, Molecular taxonomy: use of modern methods in the identification of species, Indian J.L.Sci, 2(1), pp.143-147 48 Adam K., Anna K., Hubert S., Michał N., Marta M., 2017, A Review of Conventional PCR Assays for the Detection of Selected Phytopathogens of Wheat, J Mol Microbiol Biotechnol, 27, pp.175–189 56 49 Daniela B., Paola C., Lorenzo B., Fabio Q., Milena B., Daniele D., Piero A., 2009, Endophytic bacterial diversity in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves described by 16S-rDNA gene sequence analysis and length heterogeneity-PCR, Journal of Microbiology, 47, pp 393 - 401 50 Lucia A., Ilaria M., Roberto P., Lucia C., Francesca C., 2004, Amplified ribosomal DNA restriction analysis for the characterization of Azotobacteraceae : a contribution to the study of these free-living nitrogenfixing bacteria, Journal of Microbiological Methods, 57, pp.197 - 206 51 Lu JJ., Perng CL., Lee SY., Wan CC., 2000, Use of PCR with universal primers and restriction endonuclease digestions for detection and indentification of common bacterial pathogens in cerebrospinal fluid, Journal of Clincical Microbiology, 38, pp.2076 – 2080 52 Elmilson RG., Yoko BR., 2002, Phylogentic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer sequences, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, pp.355- 361 53 Fircher SG., Lerman LS., 1983, DNA fragments differing by single base pair subtitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory, Proc Natl Acad Sci USA, 80, pp.1579 1583 54 Muyzer G., Brinkhoff T., Nuben U., Santegoeds C., Schofer H., Wawer C., 1997, Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology, Molecular Microbial Ecology manual, pp.1-27 55 Wang J., Ma T., Zhao L., Li J., Zhao L., Li G., 2008, PCR-DGGE method for analyzing the bacterial community in a high temperature petroleum reservoir, World of Journal Microbioal Biotechnol, 21, pp.19811987 56 Learn HLC., Shiran MS., Vui CMWL., Nurul SAM., Son R., Andrase HM., 2012, Andrade Identification of actinomycete communities 57 in Antarctic soil from Barrientos Island using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis, Genetics and Molecular Research, 11 , pp.277-291 57 Okada H., 2010, Technical report on the PCR-DGGE analysis of soil Nematode community, Ver.2.3 58 Tomoyukihori, Shin H., Yohiyuki U., Masaharu I., Yasuo I., 2006, Direct comparinson of singlestand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragments, Journal of Microbiological Methods, 6, pp 6165–169 59 Takeshi W., Susumu A., Asumi., Kazunari N., Makoto K., 2004, DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil FEMS Microbiology letters, 232, pp.15-163 60 Cheon J., Hidaka T., Mori S., Koshikawa H., Tsuno H., 2008, Applicability of random cloning method to analyze microbial community in full-scale anaerobic digesters, J Biosci Bioeng, 106(2), pp.134-40 61 Steger K., Sjogren AM., Jarvis A., Jansson JK., Sundh I., 2007, Development of compost maturity and Actinobacteria populations during full-scale composting of organic household waste, Journal of Applied Microbiology, 103, pp 487 – 498 62 Vila RC., Kazuo M., Susumu A., Makoto K., 2003, Succession and phylogentic composition of bacterial communities responsible for the composting process of rice straw estimated by PCRDGGE analysis, Soil Sci Plant Nut 49, pp.619 – 630 63 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng Đặng Thị Cẩm Hà, 2008, Xác định đa dạng vi khuẩn bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6, pp 59 - 65 64 Nghiêm Ngọc Minh, 2004, Sử dụng kỹ thuật điện di gel gradient biến tính để nghiên cứu đa dạng vi sinh vật, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, pp.397 - 406 58 65 Nguyễn Thanh Thủy, La Thị Phƣơng Đặng Thị Cẩm Hà, 2004, Sử dụng phƣơng pháp điện di gel gradient biến tính để xác định mức độ đa dạng vi sinh vật công thức thử nghiệm xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, pp.381- 388 66 N.Đ.Duy, H.N.P.Thảo, H.Q.Khánh, N.T.Nguyên, P.Đ.Tuấn, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Kouji Yoshida, Yasuo Igarashi, 2013, Sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE phân tích cộng đồng vi khuẩn Rơm rạ huyện Lai Vung, Đồng Tháp, Tạp chí Khoa học Công nghệ 51 (3A), pp.1-16 67 Ngo.Đ.D, Nguyen T T.V, Dao.T.T.H, Hoang Q K, Mannix P., Yamada C., Yoshida K., Igarashi Y, 2012, Phân tích Cộng đồng vi khuẩn phân ủ phƣơng pháp DGGE, Tạp chí Sinh học 34(SE), pp.118124 68 Brown TA., 1998, Gene cloning in Research and Biotechnology Gene cloning an introduction, Stanley Thornes (Publishers) Ltd 69 Mohd LCJ., Latifah AM., Puziah AL., 2013, Composting of rice straw with effective microorganisms (EM) and its influence on compost quality, Iranian J Environ Health Sci Eng, 10(1), pp 17 56 70 Irnis AZ., Siti NBK., Norhasykin MR., 2018, Effect of pH, temperature and moisture content during composting of rice straw burning at different temperature with food waste and effective microorganisms, International Conference on Civil & Environmental Engineering, vol 34 71 Mohamed H., Mohamed G., Osama MN., 2013, Microbial diversity during composting cycles of rice straw, International journal of Advanced Biological and Biomedical Research, 1, pp.232-245 72 Tang JC., Shibata A., Zhou Q., Katayama A., 2007, Effect of temperature on reaction rate and microbial community in composting of cattle manure with rice straw, J Biosci Bioeng, 104(4), pp.321-8 73 Yu S., Bukin Y., Galachyants P., Morozov IV., Bukin1 SV., Zakharenko AS., Zemskaya TI., 2019, Data Descriptor: The effect of 16S 59 rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results, https://doi.org/10.1038/sdata.2019.7 ... cứu sử dụng kỹ thuật tạo dòng PCR -DGGE để phân tích cộng đồng vi khuẩn chƣa cơng bố Mục tiêu nghiên cứu sử dụng hai kỹ thuật PCR- DGGE tạo dòng phân tích cộng đồng vi khuẩn rơm rạ Nhằm định hƣớng... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM HỌC VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR -DGGE VÀ TẠO... nhiễm chất độc hóa học [64], phân tích cộng đồng vi khuẩn phân ủ phƣơng pháp DGGE sử dụng kỹ thuật PCRDGGE phân tích cộng đồng vi khuẩn Rơm rạ huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp [65,66] Những liệu