PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM TRỨNG GIUN SÁN

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM TRỨNG GIUN SÁN Nội dung Phương pháp trực tiếp Phương pháp dội rửa nhiều lần gạn rửa sa lắng Phương pháp Füllerborn Phương pháp Darling Phương pháp Che

BÀI CHUẨN BỊ THỰC TẬP BỆNH KÝ SINH TRÙNG

BÀI I & 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM TRỨNG GIUN SÁN

Nội dung

Phương pháp trực tiếp

Phương pháp dội rửa nhiều lần (gạn rửa sa lắng)

Phương pháp Füllerborn

Phương pháp Darling

Phương pháp Cherbovich

Phương pháp Nổi lắng cặn

Phương pháp Baerman

Phương pháp Vaid

Phương pháp đếm trứng Stole

Phương pháp đếm trứng Mc Master

Phương pháp nuôi ấu trùng

Yêu cầu chung

 Nắm vững phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm trứng giun sán

 Bước đầu phân biệt trứng sán lá, sán dây, giun tròn

I Phương pháp trực tiếp

Cách lấy phân

Tiến hành lấy phân của con vật

cần xét nghiệm bằng cách lấy ở

cần thiết Ngoài ra có thể lấy phân trực tiếp từ trực tràng của súc vật dùng tay hoặc sử dụng các dụng cụ khác nhau

Tiến hành thí nghiệm: 1,2 giọt Glyxerin 50%

Dùng pince hoặc đũa

thủy tinh lấy 1 mẫu phân

to bằng hạt đỗ đặt lên

Nhỏ vào đó 1,2 giọt Glyxerin 50%, để giữ tiêu bản lâu khô và dễ nhìn (Nếu

không có Glyxerin có thể dùng nước sạch để thay thế) Dầm nát phân và gạt cặn bã ra hai đầu phiến kính Dung dịch phân bên trong được dàn mỏng

Tiêu bản đạt yêu cầu khi

Giữa dung dịch phân và mép của phiến kính tạo thành một hành lang sạch sẽ Dung dịch phân được dàn mỏng đến mức ánh sáng có thể qua được và không tràn ra mép phiến kính

Những tiêu bản này được đặt lên kính hiển vi để tìm trứng giun sán (Có thể

quan sát thấy trứng sán lá, trứng sán dây, trứng giun tròn, đốt sán dây…)

Ưu điểm của phương pháp

Dụng cụ đơn giản, dễ làm nên dễ áp dụng ở cả cơ sở sản xuất phương pháp này có thể phát hiện được các loại trứng giun sán

Nhược điểm

Do mẫu phân nhỏ nên độ chính xác không cao Khi xét nghiệm nên làm từ 8

-10 mẫu trên mỗi đối tượng cần xét nghiệm

Phương pháp này chỉ áp dụng để xét nghiệm phân của gia cầm và những súc vật có khối lượng phân nhỏ

II Phương pháp Fülleborn

Nguyên lý

Dựa vào sự chênh lệch tỷ trọng giữa trứng giun sán và một số dung dịch có tỷ trọng nặng hơn, để phân ly trứng ra khỏi phân

Mục đích

Phát hiện được nhiều loại trứng giun tròn và trứng sán dây.

Tiến hành thí nghiệm

Dùng pince hoặc đũa thủy tinh lấy một lượng phân khoảng 3-5gr của đối tượng cần

xét nghiệm để vào một cốc sạch (Cốc nhựa khoảng 200ml) đổ vào đó một khối lượng nước muối bão hòa gấp khoảng 10-20 lần khối lượng phân Dùng đũa thủy

tinh khuấy nát phân trong dung dịch sau đó toài bộ dung dịch được lọc qua phễu lọc (Có lưới thép hoặc nhựa với kích thước mỗi mắt lưới 0,3mm* 0,3mm) vào lọ tiêu bản có diện tích miệng lọ nhỏ hơn diện tích đáy lọ Điều chỉnh bằng cách cho

thêm dung dịch nước muối bão hòa đến phần có thiết diện nhỏ nhất và để yên

tĩnh trong 30-60 phút, để trứng nổi lên Dùng vòng vớt bằng thép nhỏ có đường kính 0,5mm để vớt lớp váng trên miệng lọ tiêu bản và đặt lên phiến kính Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi có độ phóng đại 7x10 hoặc 7x15 để tìm trứng giun sán Phương pháp này có thể lọc qua phễu lọc vào ống nghiệm, sau đó điều chỉnh lượng nước muối bão hòa sao cho đầy ống Để lamen lên ống nghiệm, sau đó để yên tĩnh trong thời gian 30-60 phút Chuyển lamen sang phiến kính và kiểm tra dưới kính hiển vi có độ phóng đại 7x10 hoặc 7x15 để tìm trứng giun sán

Trong phương pháp này có thể thay thế nước muối bão hòa bằng các dung dịch khác có tỷ trọng cao hơn như sodium hyposulfit, sodium nitrat, MgSO4

Phạm vi ứng dụng

Ứng dụng ở cơ sở sản xuất và phòng thí nghiệm

Ưu điểm

Tìm được tất cả các loài trứng giun tròn Ngoài ra có thể tìm thấy trứng sán lá sinh sản gia cầm (Prostogonimus), Trứng sán lá ruột gia cầm (Echinostoma) và trứng giun đầu gai ở vịt (Polymorphus)

Nhược điểm

Phương pháp này khó phát hiện những trứng giun sán có tỷ trọng cao

III Phương pháp gạn rửa sa lắng

Nguyên lý

Phương pháp này dựa vào sự chênh lệch tỷ trọng giữa nước và tỷ trọng trứng giun sán để phân ly trứng ra khỏi phân Trứng giun sán có tỷ trọng nặng hơn sẽ lắng xuống dưới

Mục đích

Tìm trứng các loài giun sán có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng nước

Cách tiến hành

Dùng đũa thủy tinh hoặc pince lấy 5-10gam phân (khoảng bằng hạt táo) của đối tượng cần xét nghiệm cho vào cốc nước sạch Đổ vào đó một lượng nước gấp 10 lần khối lượng phân Dùng đũa thủy tinh khuấy nát phân trong cốc Toàn bộ dung dịch phân được lọc qua phễu lọc (Có lưới thép hoặc nhựa với kích thước mỗi mắt lưới 0,3mm* 0,3mm) sang một cốc sạch khác Để yên tĩnh khoảng 5-10 phút Gạn bỏ lớp nước phía trên giữ lại phần cặn ở đáy Sau đó lại tiếp tục dội mạnh nước sạch vào cặn lắng Lặp lại thao tác này khoảng 3-5 lần đến khi cặn đã trở nên sạch Cuối cùng giữ lại cặn và đổ ra hộp lồng soi dưới kính hiển vi

Lưu ý của phương pháp này: Nên dùng loại cốc có đáy hẹp Lượng cặn đổ ra hộp lồng sao cho có thể soi được trên kính hiển vi có độ phóng đại 7x10 hoặc 7x15 để tìm trứng giun sán

Phạm vi ứng dụng

Ứng dụng ở cơ sở sản xuất và phòng thí nghiệm

Ưu điểm

Tìm được tất cả các loại trứng sán lá

Nhược điểm

Không tìm được trứng giun tròn

IV Phương pháp nổi lắng cặn

Nguyên lý

Kết hợp giữa phương pháp Fülleborn và phương pháp gạn rửa sa lắng Sau khi đã vớt lớp váng trên miệng lọ tiêu bản ở phương pháp Fülleborn Đổ phần nước trong phía trên đi, giữ lại phần cặn làm tương tự như phương pháp gan rửa sa lắng

Ưu điểm: tìm được tất cả các loài trứng giun sán

V Phương pháp đếm trứng Stole

Phương pháp đếm trứng Stole

Mục đích

-Xác định chính xác số lượng trứng giun, sán có trong 1g phân gia súc.

Vật liệu và dụng cụ

- Phân gian súc cần xét nghiệm: 3 – 5 g; NaOH 0,1N

- Đũa thủy tinh, pipete

- Bình chia độ, loại 100ml

- Bi sắt, hoặc sỏi: 2 – 3 viên

- Phiến kính, lam kính

- KHV độ phóng đại 7x10 – 7x15

Các tiến hành

- Đổ 56ml NaOH 0,1N vào bình chia độ.

- Từ từ đưa phân gia súc vào bình sao cho mực dung dịch trong bình đạt 60ml thì dừng lại.

- Dùng đũa thủy tinh nghiền nát phân trong dung dịch

- Thêm vào bình 2-3 viên bi sắt hoặc sỏi.

- Lắc đều bình chia độ để dung dịch phân và NaOH đồng nhất tại mọi vị trí.

- Dừng lại đột ngột, dùng pipete lấy 0,15ml dung dịch phân, đưa lên phiến kính, quan sát trên kính hiển vi, đếm trứng giun, sán.

Phạm vi ứng dụng

- Bằng phương pháp đếm trứng Stole, có thể tìm được trứng, các loại ấu trùng và giun, sán trưởng thành.

- Đếm và xác định được số lượng trứng có trong 1g phân.

- Qua đây xác định được cường độ nhiễm sán trên gia súc

- Đánh giá được hiệu quả thuốc tẩy giun, sán.

V. Phương pháp Darling

Nguyên lý

Dựa vào sự chênh lệch tỷ trọng giữa trứng giun sán và một số dung dịch có tỷ trọng nặng hơn, kết hợp với phương pháp ly tâm để phân ly trứng ra khỏi phân.

Mục đích

Phát hiện được nhiều loại trứng giun tròn và trứng sán dây.

Tiến hành thí nghiệm

Dùng pince hoặc đũa thủy tinh lấy một lượng phân khoảng 3-5gr của đối tượng cần xét nghiệm để vào một cốc sạch (Cốc nhựa khoảng 200ml) đổ vào đó một khối lượng nước muối bão hòa gấp khoảng 10-20 lần khối lượng phân Dùng đũa thủy tinh khuấy nát phân trong dung dịch sau đó toài bộ dung dịch được lọc qua phễu lọc (Có lưới thép hoặc nhựa với kích thước mỗi mắt lưới 0,3mm* 0,3mm) vào các cặp ống ly tâm Tiến hành ly tâm 1 - 2 phút với vẫn tốc 2000 vòng/phút Dùng vòng vớt bằng thép nhỏ có đường kính 0,5mm để vớt lớp váng trên miệng ống ly tâm và đặt lên phiến kính Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi có độ phóng đại 7x10 hoặc 7x15 để tìm trứng giun sán.

Trong phương pháp này có thể thay thế nước muối bão hòa bằng các dung dịch khác

có tỷ trọng cao hơn như sodium hyposulfit, sodium nitrat, MgSO 4

Phạm vi ứng dụng

Ứng dụng ở phòng thí nghiệm.

Ưu điểm

Tìm được tất cả các loài trứng giun tròn Ngoài ra có thể tìm thấy trứng sán lá sinh sản gia cầm (Prostogonimus), Trứng sán lá ruột gia cầm (Echinostoma) và trứng giun đầu gai ở vịt (Polymorphus).

Thời gian tiến hành thí nghiệm là ngắn.

Nhược điểm

Phương pháp này khó phát hiện những trứng giun sán có tỷ trọng cao.

Yêu cầu có máy ly tâm để có thể tiến hành được thí nghiệm.

Nguyên lý

- Một số giun sán không thải trứng mà thải ấu trùng ra ngoài môi trường hoặc thải trứng nhưng khi trứng qua trực tràng thì nở thành ấu trùng.

- Lợi dụng tính ưa hoạt động của ấu trùng giun ở điều kiện nhiệt độ 37⁰C để phân ly ấu trùng ra khỏi phân gia súc.

Dụng cụ

- Hệ thống Baerman bao gồm: 1 phễu thủy tinh (hoặc nhựa) nối với 1 ống nghiệm qua

1 ống cao su; toàn bộ được đỡ trên 1 giá đỡ.

- Nhiệt kế, nước ấm, lưới lọc, bông, đĩa lồng, kính hiển vi.

Cách tiến hành

- Cho 1 lượng nhỏ bông vào đáy phễu nhựa của hệ thống Baermann để tạo thành màng lọc mỏng

- Đưa lượng phân gia súc cần xét nghiệm lên phễu nhựa có qua lưới lọc.

- Đổ vào phễu 1 lượng nước ấm 37⁰C sao cho lượng phân ngập hoàn toàn trong nước ấm.

- Để yên tĩnh khoảng 30 – 45 phút.

- Nhẹ nhàng đưa phân ra khỏi phễu nhựa.

- Gạn bỏ lớp nước phía trên ống nghiệm, giữ lại phần cặn ở đáy cốc.

- Đổ toàn bộ phần cặn vào đĩa lồng, đưa lên KHV độ phóng đại 7x10 hoặc 7x15 quan sát tìm ấu trùng.

Phạm vi ứng dụng

- Dùng để xét nghiệm phân các loài đại gia súc có lượng phân lớn và nhão (trâu, bò) để tìm ấu trùng giun phổi gia súc nhai lại.

BÀI 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP MỔ KHÁM TÌM GIUN SÁN

Mục đích

 Đây là phương pháp chính xác nhất giúp ta tìm được mọi loài giun sán ở các giai đoạn phát triển khác nhau, ký sinh ở các vị trí khác nhau trong

cơ thể ký chủ

 Biết cách thu lượm bảo quản và phân loại giun sán trưởng thành

 Cho biết chính xác số lượng giun sán ký sinh trong ký chủ

 Quan sát được biến đổi bệnh lý do giun sán gây ra với ký chủ

I Phương pháp mổ khám toàn diện của K.I.Skrjabin

Mục đích

Tìm được mọi loài giun sán ký sinh ở các khí quan

Nội dung

Qua 5 bước:

Bước 1: Kiểm tra bên ngoài xác chết để tìm ký sinh trùng Dùng kính lúp

soi ở những vùng da mỏng, các điểm nghi ngờ có ký sinh trùng và các lỗ tự nhiên

Bước 2: Mổ khám các xoang tìm ký sinh trùng.

Ví dụ: Xoang mắt, xoang miệng, xoang mũi

Trên gia cầm ở xoang mắt thường có giun xoăn mắt gà Trên trâu bò ở xoang bụng có giun chỉ

Bước 3: Lột da tìm ký sinh trùng dưới da.

Dưới da thường có ấu trùng sán dây Thực hiện: Trâu, bò, gia cầm

Đối với Lợn không thực hiện bước này, vì hiện nay chưa có tài liệu nào dẫn chứng có ký sinh trùng ký sinh dưới da Lợn

Bước 4: Mổ khám phân lập các khí quan riêng rẽ.

Tách các khí quan để vào các dụng cụ đựng mẫu riêng rẽ

Để tránh nhầm lẫn giữa các mẫu cần viết nhãn tạm thời

MẪU NHÃN TẠM THỜI

Bước 5: Dùng các phương pháp thích hợp để xử lý đối với từng khí quan

Có 3 cách:

 Cách 1: Đối với chất chứa của các khí quan hình ống (Dạ dày,

ruột non, ruột già…) Lấy toàn bộ chất chứa xét nghiệm bằng phương pháp gạn rửa

sa lắng

Lưu ý:

Không sử dụng đũa thuỷ tinh khuấy mạnh như trong phương pháp gạn rửa sa lắng đối với phân gia súc để tránh tình trạng làm tổn thương đến ký sinh trùng (Trường hợp các đốt sán dây

bị đứt…) Chỉ dùng lực của dòng nước

 Cách 2: Đối với niêm mạc, các khí quan hình ống, dùng

phương pháp Nạo vét ép soi

Dùng vật cứng (phiến kính, chuôi dao mổ) nạo niêm mạc rồi

ép lên giữa hai phiến kính soi lên kính hiển vi với độ phóng đại 7x10 và 7x15

 Cách 3: Đối với các khí quan là thực thể như gan, thận, tim,

phổi, cơ dùng phương pháp Cắt lát ép soi

Dùng kéo cong cắt thành các lát mỏng ép giữa 2 phiến kính lớn

Chú ý: Khi xử lý đối với từng khí quan:

Phổi: dùng kéo cắt đến tận cuống các phế nang

Dạ dày kép (4 túi): Xử lý từng túi riêng rẽ

Loài gia súc

Số hiệu Tính biệt Khí quan

Dạ dày đơn: Cắt theo đường cong lớn.

Gia cầm: Phân tách dạ dày cơ riêng và dạ dày tuyến riêng

Ruột: Dùng kéo cắt theo đường cong lớn đối diện với màng treo ruột Thận: Bổ đôi thận để tìm giun sán trong bể thận

II Phương pháp mổ khám toàn diện ở 1 khí quan

Mục đích:

Tìm mọi loài giun sán ở một khí quan nhất định

III Phương pháp mổ khám không toàn diện

Mục đích:

Tìm 1 loài giun sán nào đó từ nhiều khí quan trong cơ thể

Phương pháp này thường áp dụng trong công tác kiểm soát giết mổ, ví dụ; bệnh giun bao, bệnh gạo lợn

IV Phương pháp thu giữ và bảo quản mẫu vật

Thực hiện các bước sau:

- Nhẹ nhàng tách giun sán ra khỏi các khí quan (Có thể dùng pince)

- Để giun sán chết tự nhiên trong nước lã

- Bảo quản giun sán trong các dung dịch thích hợp

- Đối với sán lá sán dây, giun đầu gai, bảo quản trong dung dịch cồn 70°

- Đối với giun tròn, bảo quản trong dung dịch Barbagallo

- Cách pha dung dịch Barbagallo: NaCl 7,5gr

Formol 30ml (38-40%) Nước cất: 1000ml Khi bảo quản phải để từng khí quan riêng rẽ và viết nhãn cố định đi kèm theo mẫu Nhãn được viết bằng bút chì cứng trên giấy can Nhãn có 2 mặt:

MẪU NHÃN CỐ ĐỊNH

Loài mổ khám Ngày tháng năm

Tính biệt Khí quan có KST Lớp

Số lượng

Nhãn được đặt trong lọ tiêu bản, mục đích của viết nhãn là để gửi đi phân loại giun sán và ghi vào sổ mổ khám

Phân loại:

Cách phân loại các loài giun sán khác nhau tuỳ thuộc vào loài

Đối với lớp sán lá sán dây, ép giữa 2 phiến kính và nhuộm bằng phương pháp nhuộm Carmin đối với giun tròn và giun đầu gai, làm trong suốt bằng dung dịch Glyxerin +

Ac Lactic tỷ lể 1:1

BÀI 1 CÁC LOÀI SÁN LÁ, SÁN DÂY KÝ SINH Ở GIA SÚC, GIA CẦM

Mục đích

Nắm vững các đặc điểm hình thái cơ bản của các loài sán lá sán dây ký sinh ở gia súc gia cầm

Phân biệt được các loài sán lá, sán dây

Giới thiệu chung

Sán lá thuộc lớp Trematoda ngành Nemathelmilthe

Hình thái

Hình lá dẹt theo hướng lưng bụng, có khi có hình chóp, hình lòng máng, hình trụ Màu hồng, xám hoặc màu trắng ngà

Cấu tạo

Có 2 giác bám Có 2 manh tràng nằm dọc hai bên cơ thể Cơ thể lưỡng tính

Vòng đời

Vòng đời phát triển gián tiếp, bắt buộc phải qua vật chủ trung gian

I Sán lá gan lớn ký sinh ở loài nhai lại.

Có 2 loài ký sinh là Fasciola hepatica và Fasciola gigantica

Hình thái

Hình lá, dẹt theo hướng lưng bụng, màu hồng

Cấu tạo

Hai manh tràng phân nhánh mạnh, hai tuyến noãn hoàng phân nhánh hai bên thân Hai tinh hoàn xếp trên dưới nhau ở khoảng giữa thân và phân nhánh Buồng trứng phân nhánh hình cành cây

Trứng: có kích thước lớn, phình rộng ở giữa, thon dần 2 đầu Đầu nhỏ

có nắp Trứng có màu vàng tranh

Vòng đời phát triển

Phát triển gián tiếp qua ốc nước ngọt (chỉ dẫn cụ thể theo hình)

II Sán lá ruột lợn

Do loài Fasciolopsis buski gây ra

Hình thái

Hình lá, màu hồng đỏ, cơ thể phình rộng phía sau.

Cấu tạo

Có 2 giác bám gần nhau nằm phía trước cơ thể

Hai tinh hoàn phân nhánh mạnh, xếp trên dưới nhau nằm phía sau than sán

Buồng trứng phân nhánh nằm phía trước tinh hoàn và hơi lệch bên trái Trứng: màu vàng chanh, vỏ mỏng, phình rộng ở giữa và thon dần đều về phía hai đầu Ở đầu hơi nhỏ có nắp Phôi bào phân bố đều, xếp kín vỏ trứng, ranh giới giữa các phôi bào không rõ

III Sán lá sinh sản gia cầm

Do nhiều loài thuộc họ Prothogonimus gây ra.

Hình thái

Hình quả lê, thon ở phía trước phình rộng ở phía sau, có gai nhỏ phủ lên

bề mạnh thân

Cấu tạo

Có 2 giác bám, hầu nhỏ, thực quản ngắn Tinh hoàn hình tròn Xếp đối xứng 2 bên than sán Buồng trứng phân thuỳ hình hoa nằm ngay sau giác bụng Tuyến noãn hoàng hình chùm, phân bố 2 bên than sán từ ngay mép trước giác bụng đến mép sau tinh hoàn

Nơi ký sinh

Các loài thuộc họ Prothogonimus ký sinh ở túi fabricius hoặc ống dẫn

trứng

B SÁN DÂY

Hình thái

Thân sán dài, dẹp, màu trắng nhạt, nhiều hình dạng chủ yếu là hình dải băng, hình thắt lưng, cơ thể chia 3 phần: Đầu, cổ và than Có nhiều đốt Trong mỗi đốt có cấu tạo của một cơ thể hoàn chỉnh, cấu tạo lưỡng tính Đầu có 4 giám bám, có loài có them móc bám

I Sán dây ký sinh ở loài nhai lại