TRƯỜNG ĐH TÂY NGUYÊN KHOA KHTN & CN LIỆU PHÁP GEN (Human Gene Therapy) GVHD: Võ Thị Phương Khanh SVTH: Nguyễn Thành Lợi Hồ Thị Lan Anh Nguyễn Thị Trang nguyenthanhloi_2@yahoo.com MỤC LỤC I Đặt vấn đề II Nội dung Khái niệm 1.1 Định nghĩa 1.2 Nguyên tắc điều trị liệu pháp gen Phân loại liệu pháp gen Các kỹ thuật liệu pháp gen Các loại vector thường dùng liệu pháp gen III Ứng dụng Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chức gen Liệu pháp gen chữa bệnh ung thư Liệu pháp gen chữa bệnh đo thay đổi chức Protein Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo liệu pháp gen chữa bệnh HIV /AIDS Liệu pháp gen chữa bệnh khác IV Vấn đề an toàn triển vọng liệu pháp gen Vấn đề an toàn Triển vọng liệu pháp gen Việt Nam V Kết luận Tài liệu tham khảo nguyenthanhloi_2@yahoo.com I ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiệm vụ hàng đầu CNSH giải vấn đề mạng sống người CNSH tập trung nỗ lực tìm hướng để chữa khỏi bệnh di truyền bệnh hiểm nghèo Trong liệu pháp gen kĩ thuật cao CNSH có ý nghĩa quan trọng giải nhiệm vụ Do đó, chúng tơi chọn chủ đề Liệu pháp gen để trình bày seminar hôm nguyenthanhloi_2@yahoo.com II NỘI DUNG Khái niệm 1.1 Định nghĩa liệu pháp gen Liệu pháp gen kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào thể thay cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt đựơc mục tiêu liệu pháp - Gen liệu pháp gen có chức sử dụng vào điều trị bệnh cho ngừơi Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm chức riêng nguyenthanhloi_2@yahoo.com 1.2 Nguyên tắc điều trị liệu pháp gen Theo Tổ chức Y tế giới quy định nhiều quốc gia điều trị liệu pháp gen cần tuân thủ số nguyên tắc sau: - Theo dõi hiểu biết cặn kẽ trình, chế phát sinh bệnh, đặc tính di truyền bệnh - Nắm vững cấu trúc chức gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến,…cấu trúc, chức gen liệu pháp dùng để thay - Dự đoán hiệu liệu pháp Nếu hiệu cao áp dụng - Cần thử nghiệm nhiều lần động vật áp dụng cho người nguyenthanhloi_2@yahoo.com Phân loại liệu pháp gen - Liệu pháp gen có hai nhóm phương pháp bản: + Liệu pháp gen soma: phương pháp điều trị thay hay sửa chữa gen hỏng, gen bệnh tế bào soma thể người, giúp cho người sống bình thường Các tế bào dùng để chữa trị tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt dùng tế bào gốc + Liệu pháp gen tế bào mầm: phương pháp điều trị, sửa chữa, thay gen hỏng cho giao tử (tinh trùng, trứng) nhằm tạo hệ sau bình thường nguyenthanhloi_2@yahoo.com Các kỹ thuật liệu pháp gen 3.1 Cơ sở liệu pháp gen Để chuyển gen, cần hội đủ số điều kiện sau đây: - Đầu tiên, phải có đầy đủ gen thích hợp với trình tự điều hồ thích hợp (trình tự khởi động) - Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích - Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: + Ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân + Ứng dụng tế bào tách khỏi người bệnh sau cấy trở lại người bệnh nguyenthanhloi_2@yahoo.com 3.2 Các bước liệu pháp gen Trong thực nghiệm, người ta dùng vector virus để chuyển gen vào tế bào động vật theo bước: - Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển Sau đó, vector tái tổ hợp đưa vào tế bào nuôi cấy (Tế bào tủy xương) - Bước 2: Vector virus mang gen lành đưa vào thể mà từ người ta tách tế bào tuỷ xương nguyenthanhloi_2@yahoo.com 3.3 Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp Khi tạo vector liệu pháp gen, cần phải có kỹ thuật chuyển gen liệu pháp vào tế bào, thể người Mục đích cuối gen liệu pháp thể người phải phiên mã, dịch mã tạo protein liệu pháp có tác dụng chữa bệnh Các vector liệu pháp sử dụng khác nhau, thích hợp cho loại tế bào đích, nhằm tạo protein liệu pháp nội bào, ngoại bào nguyenthanhloi_2@yahoo.com Hình thức chuyển gen thao tác thông qua số cách sau: Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh (liệu pháp in vivo), gồm bước sau: - Lựa chọn vector liệu pháp thích hợp - Tách tạo vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp, thường tạo vector virus để chuyển hiệu - Đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp kỹ thuật chuyển gen như: vi tiêm, súng bắn gen v.v… - Kiểm tra biểu gen liệu pháp nguyenthanhloi_2@yahoo.com 10 Liệu pháp gen chữa bệnh thay đổi chức protein Một số bệnh gây nên đột biến gen làm thay đổi cấu trúc bậc protein dẫn đến làm thay đổi chức protein Một bệnh bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm SCA (Sickle Cell Anemia) đột biến gen β globin Đột biến gen β globin làm biến đổi hemoglobin bình thường (HbA) thành dạng hemoglobin S (HbS) nguyenthanhloi_2@yahoo.com 41 - Có ba xu hướng liệu pháp gen để chữa bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, là: + Sửa chữa sai lệch ba mã hóa cho acid amin thứ gen βs globin + Sửa chữa sai lệch ba mã hóa cho acid amin thứ 22 acid amin thứ 87 gen β globin để tạo dạng HbF HbA2 bình thường + Thay gen βs globin Cắt bỏ gen bị hỏng ( gen β s globin), thay gen β globin bình thường cho tế bào máu tủy xương - Các bước điều trị bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm gồm có: + Tách tế bào tủy xương người bệnh, chiếu xạ để chọn tế bào khỏe mạnh Chuyển gen β globin bình thường nhờ retrovirus vào tế bào tủy xương Nhân nuôi tế bào mang gen β globin bình thường + Xạ trị kết hợp với điều trị hóa chất cho người bệnh để loại bớt tế bào tủy xương bị đột biến mang gen β s globin + Chuyển tế bào tủy xương mang gen β globin bình thường nhân nuôi vào người bệnh + Theo dõi, đánh giá lượng tế bào mang gen βs globin đột biến lại Nếu tế bào mang gen βs globin cịn nhiều phải tiến 42 hành thêm lần lặpnguyenthanhloi_2@yahoo.com lại Liệu pháp gen chữa bệnh rối loạn chuyển hóa ion Chlo - Đột biến gen NST (autosom) số người gây rối loạn chuyển hóa ion Cllàm xuất bệnh xơ nang CF ( Cystic fibrosis) - Bệnh xơ nang đột biến gen CF - Liệu pháp gen chữa bệnh xơ nang tổng hợp cDNA từ mRNA gen CF bình thường Dùng vector liệu pháp đưa gen liệu pháp cDNA vào người bệnh Các vector liệu pháp thường dùng để điều trị bệnh xơ nang vector adenovirus, AAV, vector retrovirus, vector lentivirus, liposom v.v nguyenthanhloi_2@yahoo.com 43 Liệu pháp gen chữa bệnh HIV/AIDS - Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) virus HIV (human immuno deficiency virus) gây nên bệnh đại dịch kỷ, gây tử vong lớn Virus HIV gồm có typ HIV typ I chiếm 98% HIV typ II chiếm khoảng 2% - Hệ gen HIV có kích thước khoảng 10kb bao gồm gen chính: gag, pol, env, vif, tat, vpu, nef, vpr rev nguyenthanhloi_2@yahoo.com 44 Sau xâm nhiễm vào tế bào người, hệ gen HIV gắn hoà nhập vào hệ gen người tạo nên dạng tiền HIV (provirus) vô số tế bào lympho T tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác, gây suy giảm miễn dịch người mắc phải Trong điều kiện định, dạng tiền virus HIV tạo virus HIV mới, xâm nhiễm vào nhiều tế bào khác tế bào lympho B, đại thực bào, bạch cầu, tế bào thần kinh v.v gây suy giảm nhanh chóng hệ miễn dịch người nguyenthanhloi_2@yahoo.com 45 Hướng điều trị AIDS sử dụng liệu pháp gen + Chuyển gen liệu pháp nhằm hạn chế khả xâm nhiễm nhân HIV + Kích thích gen thể để tăng cường miễn dịch chống phát triển HIV + Sử dụng gen tự sát (Suicide gene) biến đổi làm cho tế bào nhiễm HIV tự chết + Tạo vacine phịng chống nhiễm HIV cơng nghệ di truyền nguyenthanhloi_2@yahoo.com 46 - Một số liệu pháp gen điều trị HIV/AIDS là: + Phòng chống HIV/AIDS cách ức chế hoạt động gen HIV, làm biến đổi gen HIV: Thiết kế vector mang gen liệu pháp đưa vào tế bào, thể người bị nhiễm HIV nhằm phục hồi hệ thống miễn dịch lại không gây phản ứng phụ bất lợi cho người bệnh Các vector liệu pháp sử dụng để phòng chống HIV/AIDS andenovirus, AAV, oligonucletit, liposom v.v Khi đưa vector vào tế bào lây nhiễm HIV khả lây nhiễm HIV giảm Một số vector khác pCMVA9 (gen virus HIV1 cắt bớt gen, cài thêm promotor hCMV tín hiệu đóng gói SD), vector HIV chuyển dịch (mang gen GA, RRE promotor hCMV) góp phần ngăn cản chép, nhân HIV Bên cạnh cịn số vector liệu pháp khác như: oligo-antisens, ribozym, đựơc thử nghiệm nhằm hạn chế xâm nhiễm, hạn chế khả chép, nhân HIV nguyenthanhloi_2@yahoo.com 47 + Phòng chống HIV/AIDS tăng cường miễn dịch tế bào: Người ta sử dụng gen đột biến Rev10, gen tăng cường hoạt động gen cytokin, sử dụng gen tự tử gen độc tố (toxic gene) Cũng sử dụng liệu pháp gen tăng cường hoạt động gen cytokin tổng hợp protein đáp ứng miễn dịch Cytokin có nhiều loại khác nhau, interferon (IFNα, IFNβ IFNγ ) quan trọng Interferon ngăn cản xâm nhiễm loại virus có HIV Cytokin đựơc tổng hợp chủ yếu từ tế bào lympho T, có nhóm interleukin (IL1, IL2, , IL13) mà chủ yếu interleukin IL2 có tác dụng kích thích tăng sinh tế bào lympho TCD4 , đồng thời khống chế chép, nhân HIV nguyenthanhloi_2@yahoo.com 48 Sử dụng gen tự sát (Suicide gene) gen độc tố đưa vào tế bào bị xâm nhiễm HIV liệu pháp gen để phòng chống HIV Gen tự sát đưa vào tế bào bị HIV xâm nhiễm làm ức chế hoạt động enzym chép ADN polymerase tế bào, làm cho chép DNA tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại chết Do HIV khơng có khả lây nhiễm sang tế bào thường khác Việc sử dụng gen độc tố có thử nghiệm ban đầu chưa có kết đáng kể nguyenthanhloi_2@yahoo.com 49 Liệu pháp gen chữa bệnh khác Nhiều loại bệnh khác teo cơ, máu khó đơng, rối loạn chuyển hóa choresterol v.v thử nghiệm điều trị liệu pháp gen - Bệnh teo DMD đột biến lặn gen dystrophin nằm NST X gây nên Khi gen bị đột biến, làm cho protein dystrophin biến dạng, gây liệt hệ vận động, trơn gây bệnh cho người Liệu pháp gen chữa bệnh teo sử dụng vector mang cDNA dystrophin bình thường đưa vào thể bệnh nhân, nhằm thay gen dystrophin bị đột biến Việc đưa gen cDNA bình thường cách vi tiêm gen bao gói liposom, dùng vector retrovirus để đưa gen vào động vật chuột, sau đưa vào người Tuy nhiên, hiệu chưa cao - Liệu pháp gen chữa bệnh máu khó đơng (hemophilia) thử nghiệm Khi gen đột biến làm cho protein FVIII FIX chức năng, làm giảm yếu tố đông máu gây nên bệnh máu khó đơng Liệu pháp gen chữa bệnh sử dụng vector liệu pháp mang gen FVIII cDNA, gen FIX cDNA bình thường vào động vật, làm tăng khả đơng máu Từ hy vọng liệu pháp ứng dụng cho người nguyenthanhloi_2@yahoo.com 50 IV VẤN ĐỀ AN TOÀN VÀ TRIỂN VỌNG CỦA LIỆU PHÁP GEN Vấn đề an toàn liệu pháp gen Liệu pháp gen trường hợp đặc biệt chuyển gen liên quan trực tiếp đến tính mạng người, phải tuân thủ nghiêm ngặt quy định Quốc tế, Quốc gia để giảm thiểu rủi ro Các rủi ro liệu pháp gen việc gắn sai vị trí, gây đột biến gen, gen liệu pháp không biểu biểu không mong đợi; mặt khác, số loại vector liệu pháp đưa vào thể người adenovirus, retrovirus v.v biến đổi trở thành tác nhân gây bệnh, hiểu biết chế gây bệnh số gen đột biến chưa đầy đủ Kỹ thuật sử dụng liệu pháp gen phức tạp, địi hỏi xác mà số phịng thí nghiệm tiên tiến thực nguyenthanhloi_2@yahoo.com 51 Triển vọng liệu pháp gen Việt Nam Ở Việt Nam có số nghiên cứu điều trị ung thư liệu pháp miễn dịch nghiên cứu sản xuất interferon, interleukin (IL2) để điều trị ung thư Mặt khác, số sở nghiên cứu sản xuất vacine viêm gan tái tổ hợp để phòng chống bệnh viêm gan Hy vọng tương lai không xa, liệu pháp gen chữa bệnh cho người thực phát triển bước nước ta nguyenthanhloi_2@yahoo.com 52 V KẾT LUẬN Hiện có nhiều phương thức để chuyển gen đích tới tế bào nhằm thu hiệu liệu pháp Tuy nhiên cần nghiên cứu kỹ lưỡng hiệu ứng phụ tác động tới thơng tin di truyền người khía cạnh đạo đức, xã hội khác Song cần phải nhắc lại “Không hệ thống véctơ tối ưu cho tất kỹ thuật liệu pháp gen”, cần lựa chọn cách xác dự hiệu vector nhóm bệnh mà nghiên cứu Mặt khác, liệu pháp gen ứng dụng rộng rãi chữa bệnh, phục hồi cấu tạo chức phận thể, tạo quan nhân tạo thay cho người Một lượng lớn phác thảo liệu pháp gen điều trị loại bệnh tiến hành Kinh nghiệm thu từ thử nghiệm y học có ích phát triển liệu pháp gen điều trị loại bệnh người HIV, ung thư Đây lí để hy vọng liệu pháp gen tương lai giữ vai trò định việc điều trị bệnh người nguyenthanhloi_2@yahoo.com 53 Tài liệu tham khảo Khuất Hữu Thanh, 2005 Liệu pháp gen – Nguyên lý ứng dụng Nxb KH&KT Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi, 2003 Kỹ thuật di truyền ứng dụng Nxb ĐHQG Hà Nội Nguyễn Hồng Lộc, 2006 Cơng nghệ tế bào Nxb ĐH Huế Phạm Thành Hổ, 2005 Nhập môn Công nghệ sinh học Nxb Giáo dục Trịnh Đình Đạt, 2008 Công nghệ Sinh học - Tập bốn: Công nghệ di truyền Nxb Giáo dục nguyenthanhloi_2@yahoo.com 54 Rất mong nhận ý kiến đóng góp từ Cơ bạn ! nguyenthanhloi_2@yahoo.com 55 ... pháp gen Liệu pháp gen kỹ thuật đưa gen lành (gen liệu pháp) vào thể thay cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt đựơc mục tiêu liệu pháp - Gen liệu pháp gen. .. bào: Người ta sử dụng gen đột biến Rev10, gen tăng cường hoạt động gen cytokin, sử dụng gen tự tử gen độc tố (toxic gene) Cũng sử dụng liệu pháp gen tăng cường hoạt động gen cytokin tổng hợp protein... dùng súng bắn gen (gene gun): Kỹ thuật bắn gen nhờ súng bắn gen để chuyển gen liệu pháp vào tế bào đích thường đạt kết cao Thực kỹ thuật cần có thiết bị bắn gen, vi đạn có bọc gen liệu pháp để