BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MALITA KHOUNTHAVONG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, PHÂN LOẠI LOÀI ASPERGILLUS FLAVUS VÀ A.PARASITICUS TRÊN VỊ THUỐC CAM THẢO (RADIX GLYCYRRHIZAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MALITA KHOUNTHAVONG MÃ SINH VIÊN: 1401327 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, PHÂN LOẠI LOÀI ASPERGILLUS FLAVUS VÀ A.PARASITICUS TRÊN VỊ THUỐC CAM THẢO (RADIX GLYCYRRHIZAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Quỳnh Lê Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh Sinh Học HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Lê – Giảng viên Bộ môn Vi Sinh Sinh Học trường Đại Học Dược Hà Nội , cô người trực tiếp hướng dẫn tận tình , giúp đỡ tạo điều kiện để em thực hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo, cô giáo, chị kỹ thuật viên Bộ môn Vi sinh Sinh học tồn thể thầy trường Đại học Dược Hà Nội chia sẻ giúp đỡ em có kiến thức quý báu học tập hành trang q trình thực khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình bạn bè ln động viên giúp đỡ em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Malita KHOUNTHAVONG MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chi Aspergillus Fr.: Fr 1.1.1 Loài Aspergillus flavus Link 1.1.2 Loài Aspergillus parasiticus Speare 1.2 Tình hình nghiên cứu vi nấm mycotoxin thảo dược nước 1.3 Tình hình nghiên cứu vi nấm mycotoxin thảo dược nước CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Môi trường phân lập xác định nấm mốc 13 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 14 2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu 14 2.3.3 Phương pháp phân lập nấm mốc 15 2.3.4 Phương pháp phân loại nấm mốc 15 2.3.5 Các số đánh giá mức độ nhiễm nấm 16 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 Hàm ẩm mẫu cam thảo bắc nghiên cứu 17 3.2 Mức độ nhiễm loài A flavus A parasiticus mẫu cam thảo bắc nghiên cứu 17 3.2.1 Kết phân lập phân loại 17 3.2.2 Đặc điểm sinh hóa chủng thuộc loài A flavus,A parasiticus số loài khác chi Aspergillus Fr.: Fr phân lập 25 3.2.3 Đặc điểm khuẩn lạc vi học loài A flavus, A parasiticus số loài khác phân lập chi Aspergillus Fr.: Fr từ mẫu cam thảo bắc nghiên cứu 28 3.3 Một số ý kiến bàn luận……………………………………………… 30 3.3.1 Hàm ẩm dược liệu…………………………………………… 30 3.3.2 Phương pháp xác định chủng thuộc loài A flavus A parasiticus phương pháp sinh hóa 30 3.3.3 Phương pháp xác định chủng thuộc lồi phương pháp hình thái 32 3.3.4 Mức độ nhiễm loài A.flavus A parasiticus vị thuốc cam thảo bắc 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 Kết luận 33 Đề xuất 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADM Aspergillus Differentiation Medium Base AFAP Aspergillus flavus and parasiticus Agar CREA Creatine Sucrose Agar DĐVN Dược điển Việt Nam IV DGM Dichloran Glycerol Medium Base HPLC High Performe Liquid Chromatography LÔ LÃN ÔNG MEA Malt Extract Agar PDA Potato Dextrose Agar DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Hàm ẩm mẫu cam thảo bắc nghiên cứu 17 Bảng 3.2 Mức độ nhiễm loài A flavus, A Parasiticus số 18 loài chủ yếu khác từ 10 mẫu cam thảo bắc nghiên cứu Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc loài A flavus, A parasiticus 28 số loài khác phân lập từ mẫu cam thảo bắc Bảng 3.4 Đặc điểm vi học loài A flavus, A parasiticus số loài khác phân lập từ mẫu cam thảo bắc 29 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Loài A flavus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc 20 Hình 3.2 Lồi A parasiticus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc 21 Hình 3.3 Lồi A niger nhiễm vị thuốc cam thảo bắc 22 Hình 3.4 Lồi A fumigatus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc 23 Hình 3.5 Lồi A terreus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc 24 Hình 3.6 Các chủng thuộc lồi A flavus & A parasiticus 26 Hình 3.7 Các chủng khơng thuộc lồi A flavus & A parasiticus 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Thảo dược sử dụng chế biến phương thuốc gia truyền nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp dược ngày tăng Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu chưa đáp ứng u cầu chất lượng, độ an tồn tính hiệu Trong trình thu hoạch, vận chuyển, bảo quản phân phối, thảo dược mục tiêu lây nhiễm nhiều loại nấm mốc khác nhau, đặc biệt loài sinh độc tố aflatoxin Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Cam thảo bắc (Radix Glycyrrhizae) vị thuốc thông dụng đông y tây y Vị thuốc có tác dụng bổ tỳ vị, nhuận phế, nhiệt, giải độc thường dùng để trị loét dày - ruột, bệnh addison … [2] Tuy nhiên, đề tài nước nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc mycotoxin vị thuốc Để góp phần đảm bảo chất lượng thuốc an tồn cho người sử dụng dược thảo nói chung, vị thuốc cam thảo bắc nói riêng, đề tài: “Nghiên cứu phân lập, phân loại loài Aspergillus flavus A parasiticus vị thuốc cam thảo (Radix Glycyrrhizae)” triển khai với mục tiêu sau: Phân lập chủng thuộc loài Aspergillus flavus A parasiticus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc Phân loại chủng thuộc loài Aspergillus flavus A parasiticus phương pháp sinh hóa hình thái CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chi Aspergillus Fr.: Fr Chi Aspergillus Micheli mô tả lần đầu vào năm 1729, sau đến năm 1832 Fries chấp nhận theo luật quốc tế danh pháp thực vật, chi Aspergillus thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries Sau Fries lại xem xét bổ sung nên mang tên Aspergillus Fries ex Fries [8] Về mặt phân loại học chi Aspergillus có số đặc điểm sau (hình 1.1): Hình 1.1: Đặc điểm vi học chi Aspergillus [20] - Hệ sợi nấm: gồm sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hay số trường hợp có màu nâu nâu sẫm khác vùng khuẩn lạc - Bộ máy mang bào tử trần: phát triển từ tế bào có đường kính lớn hơn, thành tế bào dày tế bào lân cận sợi nấm (tế bào chân – foot cell) - Giá bào tử trần (Conidiophore): phát triển từ tế bào chân, nhánh sợi nấm, gần thẳng góc với trục tế bào chân thường bề mặt chất Giá bào tử trần khơng phân nhánh, khơng có có vách ngăn (a) (b) (c) (d) Hình 3.4 Loài A fumigatus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc: (a): Lồi A fumigatus nhiễm mẫu 62LƠ (mơi trường phân lập DGM); (b) (c): Mặt trước sau khuẩn lạc loài Czapek Dox (25OC, ngày nuôi); (d): Conidi cấu trúc sinh conidi tầng lồi ( Dạng C , Đường kính bọng: 18-32 μm , Thể bình: 5,5-8 x 2-3,5 μm, Conidi:1,5-3,5 μm ) 23 (a) (b) (c) (d) Hình 3.5 Lồi A terreus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc: (a): Loài A terreus nhiễm mẫu 30LƠ (mơi trường phân lập DGM); (b) (c): Mặt trước sau khuẩn lạc lồi Czapek Dox (25oC, ngày ni); (d): Conidi cấu trúc sinh conidi tầng loài ( Dạng C, Đường kính bọng: 8-20 μm, Cuống thể bình: 4-8 x 2-3,5 μm, Thể bình: 4-7 x 2-3 μm, Conidi: 1,5-3 μm ) 24 3.2.2 Đặc điểm sinh hóa chủng thuộc lồi A flavus, A parasiticus số loài khác chi Aspergillus Fr.: Fr phân lập Như nêu phần phương pháp, chủng thuộc loài A flavus, A parasiticus có đặc điểm sinh hóa quan trọng khác biệt rõ với chủng loài nấm khác là: Khi nuôi cấy môi trường ADM AFPA nhiệt độ 30oC thời gian 42-48h cho phản ứng màu vàng cam sáng mặt trái khuẩn lạc (bright orange-yellow reverse colour) Nhờ vào phản ứng sinh hóa này, chủng thuộc lồi nấm sinh aflatoxin phân lập từ vị thuốc cam thảo bắc xác định [hình 3.6] [hình 3.7] Tuy nhiên, kết không xác định chủng thuộc loài A flavus, chủng thuộc loài A parasiticus Để giải tiếp phần công việc này, chủng lồi ni cấy mơi trường Czapek Dox Agar (25oC, nuôi) Tiến hành xác định đặc điểm hình thái (đặc điểm khuẩn lạc vi học chủng) để phân loại đến cấp loài 25 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 3.6 Các chủng thuộc loài A flavus & A parasiticus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc (32 LÔ) xác định PP sinh hóa: (a), (b), (c), (d), (e) (f): Mặt trước sau khuẩn lạc (ADM, 25oC, 48 giờ) 26 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 3.7 Các chủng khơng thuộc lồi A flavus & A parasiticus nhiễm vị thuốc cam thảo bắc xác định PP sinh hóa: (a), (b), (c), (d), (e) (f): Mặt trước sau khuẩn lạc (ADM, 25oC, 48 giờ) 27 3.2.3 Đặc điểm khuẩn lạc vi học loài A flavus, A parasiticus số loài khác phân lập chi Aspergillus Fr.: Fr từ mẫu cam thảo bắc nghiên cứu - Đặc điểm khuẩn lạc vi học chủng nấm khảo sát nuôi cấy đơn điểm đĩa Petri chứa môi trường chuẩn Czapek Dox Agar ủ 25oC sau ngày Bảng 3.3 trình bày đặc điểm khuẩn lạc loài A flavus, A parasiticus số loài quan trọng khác chi Aspergillus Fr.: Fr phân lập từ mẫu cam thảo bắc nghiên cứu Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc loài A flavus, A parasiticus số loài khác phân lập từ mẫu cam thảo bắc (môi trường Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi) Tên Màu sắc khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc TT lồi A flavus A parasiticus A niger A fumigatus A terreus Mặt phải Mặt trái (cm) Xanh vàng Trắng xám 3,8-6,1 Xanh tối Xám 2,8-4,2 Đen Vàng nhạt 4-5,7 Xanh xám Không màu 4,3-5,6 Nâu quế nhạt Xám vàng 2,5-5 - Đặc điểm vi học loài A flavus, A parasiticus số loài quan trọng khác phân lập từ mẫu cam thảo bắc nghiên cứu trình bày bảng 3.4 28 Bảng 3.4 Đặc điểm vi học loài A flavus, A parasiticus số loài khác phân lập từ mẫu cam thảo bắc (môi trường Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi) Cấu trúc sinh Đường Cuống Tên conidi kính thể Thể bọng bình bình lồi (conidial head) (μm) (μm) 5-10 x 6-12 x 3-7 3-8 Dạng A flavus R Số tầng (μm) 22-54 A parasiticus R 25-45 A niger R 45-100 A fumigatus C 18-32 7-10 x 3,5-6 13-26 x 6,5-10 4-6 x 3-4,5 5,5-8 x 2-3,5 4-8x A terreus C (μm) 3,0-4,5 3,5-5 3,5-5 1,5-3,5 4-7 x 8-20 1,5-3 2-3,5 2-3 (Ghi R: dạng phóng xạ; C: dạng cột; G: dạng cầu) 29 Conidi 3.3 Một số ý kiến bàn luận 3.3.1 Hàm ẩm dược liệu - Từ kết xác định hàm ẩm mẫu cam thảo bắc nghiên cứu kết phân lập, phân loại chủng thuộc loài A flavus, A parasiticus (bảng 3.1 3.2) cho thấy: Tất mẫu thảo dược (có hàm ẩm đạt khơng đạt u cầu DĐVN IV) bị nhiễm nấm; khác biệt mức độ nhiễm nấm mẫu có hàm ẩm đạt không đạt yêu cầu Dược điển Việt Nam IV không thật rõ ràng Đây điều chưa hợp lý hàm ẩm yếu tố thuận lợi cho lây nhiễm phát triển nấm mốc Giải thích cho kết này, theo chúng tơi mẫu thảo dược thu thập từ hiệu thuốc đông dược, nguồn gốc, xuất xứ, điều kiện thu hái, chế biến, làm khô bảo quản Các mẫu thảo dược bị nhiễm nấm (ở đồng ruộng, trang trại, trình thu hoạch, vận chuyển, chế biến bảo quản) trước bán hiệu thuốc đơng dược Do vậy, theo chúng tơi để kiểm sốt nhiễm vi sinh vật nói chung, nấm mốc nói riêng đánh giá ảnh hưởng hàm ẩm tới mức độ nhiễm nấm, thảo dược cần phải giám sát (có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng) q trình ni trồng, thu hái, chế biến (đặc biệt q trình làm khơ) vận chuyển phân phối đến tận tay người tiêu dùng 3.3.2 Phương pháp xác định chủng thuộc loài A flavus & A parasiticus phương pháp sinh hóa Mơi trường AFPA (Aspergillus flavus and parasiticus agar) Pitt cộng đề xuất năm 1983 [27], xuất phát từ môi trường ADM (Aspergillus Differential Medium Bothast Fennell đề xuất năm 1974) Với nguồn nitrogen hợp lý môi trường, loài sinh độc tố aflatoxin A flavus, A parasiticus sinh acid aspergillic noraspergillic Các acid phản ứng với sắt III amoni citrat (ferric ammonium citrate) tạo thành chất màu vàng cam sáng rõ ràng Khác với ADM, môi trường AFPA chứa dichloran chloramphenicol giúp ức chế lan tràn nấm vi khuẩn Do vậy, môi trường ADM, để phân lập thuận lợi nên bổ sung thành phần 30 Một số lồi nấm khác (A ochraceus, A niger, ) tạo màu tương tự A flavus mơi trường AFPA Lồi A niger nguồn gây nhầm lẫn Loài phát triển nhanh A flavus tạo màu vàng màu vàng cam (orange) mặt sau khuẩn lạc Tuy nhiên, sau 48 giờ, khuẩn lạc loài A niger bắt đầu tạo thành cấu trúc sinh conidi (conidial heads) màu đen nâu đen khác biệt với loài A flavus A parasiticus Sau giai đoạn nuôi dài hơn, 3-4 ngày, khuẩn lạc loài A ochraceus (rất dễ nhầm lẫn màu sắc khuẩn lạc với lồi A flavus A parasiticus q trình phân lập) tạo thành màu vàng mặt sau (mặt trái) khuẩn lạc, loài phát triển chậm 30oC, phản ứng màu không xuất vòng 48 [25] Về thành phần mơi trường AFPA (Aspergillus flavus and parasiticus agar, g/l): - Peptone vi khuẩn 10 - Cao nấm men 20 - Sắt amoni citrat 0,5 - Chloramphenicol 100 (mg) - Thạch 15 - Nước cất 1lit - Dichloran mg (1ml dung dịch 0,2% ethanol) Sau bổ sung tất thành phần, hòa tan, điều chỉnh thể tích vừa đủ 1lít; tiệt trùng 121oC 15 phút Khi ủ 30oC vòng 42-48 giờ, khuẩn lạc loài A flavus A parasiticus xuất màu vàng cam sáng mặt trái khuẩn lạc Lưu ý pH cuối (sau tiệt trùng) môi trường 6,2 Môi trường AFPA thường khuyên dùng để phát đếm loài nấm sinh aflatoxin loại hạch (nuts), ngô, loại quả, hạt, gia vị loại hàng hóa khác Các ưu điểm sử dụng môi trường là: Nhanh, ủ (ni) vòng 42-48 thường đủ, đặc hiệu đơn giản, không yêu cầu kỹ cao trình thực để thu kết mong muốn Môi 31 trường hiệu việc đếm chủng A flavus đất (soils), nơi mà mức độ bào tử (conidi) giảm xuống 5/g đất phát Tuy nhiên, đất mơi trường có nhiều vi khuẩn, cân nhắc tăng gấp đôi lượng chloramphenicol bổ sung kháng sinh khác điều cần thiết 3.3.3 Phương pháp xác định chủng thuộc loài phương pháp hình thái Q trình phân loại lồi phương pháp hình thái, chủng thường cấy điểm môi trường Czapek Dox Agar nuôi (ủ) 25 oC, ngày hầu hết lồi hình thành bào tử (conidi) ngày Đây cơng việc đòi hỏi tính cẩn thận kỹ tốt thu kết tốt Bên cạnh đó, việc phân biệt lồi A flavus, A parasiticus, A oryzae loài tương tự khác thường khó khăn thường xuất nhiều chủng trung gian [34] Ngồi mơi trường Czapek Dox Agar, môi trường CREA, MEA với 2040% đường kính (sucrose) hiệu việc ni cấy để nhận diện loài chi nấm Với đĩa Petri, kết nuôi cấy xác định cho thấy, đĩa Petri thủy tinh cho kết tốt Với thuốc nhuộm để làm tiêu quan sát, ngồi dung dịch lactophenol cotton blue (LCB), dùng acid lactic có khơng có aniline blue bổ sung giọt cồn etylic (70-90% để loại bọt khí quan sát tốt cấu trúc nấm [24] 3.3.4 Mức độ nhiễm loài Aspergillus flavus A parasiticus vị thuốc cam thảo bắc - Từ kết phân lập, phân loại nấm từ 10 mẫu cam thảo trình bày bảng 3.2 cho thấy: Các mẫu vị thuốc bị nhiễm chủ yếu loài chi Aspergillus Trong lồi A flavus chiếm tỷ lệ chủng cao (50,3%) lồi A parasiticus chiếm vị trí thứ (12,4%) cho thấy mẫu vị thuốc có khả cao bị nhiễm độc tố aflatoxin Kết phù hợp với kết nghiên cứu Trần Trịnh Công cộng 2016 [4], Aiko cộng 2016 [6], Chien cộng 2018 [14], Do cộng 2015 [16] 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Qua trình phân lập, phân loại chủng nấm nhiễm 10 mẫu vị thuốc cam thảo bắc, thu thập từ hiệu thuốc đông dược địa bàn Hà Nội, phương pháp phân lập đặt trực tiếp, kết hợp với phương pháp phân loại sinh hóa hình thái, rút số kết luận sau: - Từ 10 mẫu cam thảo nghiên cứu phân lập 106 chủng thuộc loài A flavus A parasiticus tổng số 169 chủng thuộc loài chi Aspergillus Fr.: Fr., đó: - Lồi A flavus chiếm tỷ lệ cao số chủng phân lập được, với tỷ lệ 50,3% (85/169) tỷ lệ có mặt loài mẫu nghiên cứu 70% (7/10 mẫu nghiên cứu) - Lồi A parasiticus có tỷ lệ chủng phân lập 12,4% (21/169), xếp vị trí thứ số chủng phân lập so với tổng số chủng thuộc loài chi Aspergillus Fr.: Fr số có mặt lồi 60% Các loài chủ yếu khác chi Aspergillus phân lập gồm: - Lồi A niger xếp vị trí thứ tỷ lệ số chủng phân lập chi 20,1% (34/169) với số có mặt 50% (5/10 mẫu nghiên cứu) - Xếp thứ lồi A fumigatus, với số có nhiều có mặt 11,8% (20/169) 70% (7/10 mẫu nghiên cứu) - Xếp thứ loài A terreus, với số có nhiều số có mặt theo 5,3% (9/169) 60% (6/10 mẫu nghiên cứu) Đề xuất 2.1 Tiếp tục nghiên cứu mức độ nhiễm loài A flavus A parasiticus vị thuốc cam thảo bắc việc tăng số lượng mẫu nghiên cứu 2.2 Nên có qui định cụ thể mức nhiễm độc tố aflatoxin thảo dược nói chung vị thuốc cam thảo bắc nói riêng Hiện Việt Nam có qui định mức nhiễm tối đa cho phép aflatoxin (B1, aflatoxin toàn phần M1) lương thực thực phẩm [1] 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y tế (2007), “Giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm”, Ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 Bộ trưởng Bộ Y tế Bộ Y tế (2015), “Dược điển Việt Nam IV”, Nhà xuất Y học Trần Trịnh Công cộng sự, “Phân lập nghiên cứu khả sinh độc tố số nấm mốc số vị thuốc đông dược Việt Nam”, Đề tài NCKH cấp Bộ Y tế, 2008 Trần Trịnh Công cộng (2016), “Nghiên cứu hệ vi nấm vị thuốc cam thảo bắc (Radix Glycyrrhizae) lưu hành hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội”, Tạp chí Y học thực hành Trần Trịnh Công cộng (2017), “Nghiên cứu hệ vi nấm vị thuốc kha tử (Fructus terminaliae) lưu hành số hiệu thuốc đông dược địa bàn Hà Nội”, Tạp chí Dược học Tiếng Anh: Aiko V., Mehta A (2016), “Prevalence of toxigenic fungi in common medicinal herbs and spices in India”, Biotech 6:159, pp 1-10 Al-juraifani A.A (2011), “Natural occurrence of fungi and aflatoxins of cinnamon in the Saudi Arabia”, Afr J food Sci., Vol 5(8), pp.460-465 Amaike S, Keller NP (2011), "Aspergillus flavus", Annu Rev Phytopathol, 49, pp 107-133 Ashiq S., et al (2014), “Natrural occurrence of mycotoxins in medicinal plants: A review”, Fungal genetics and biology 66, pp.1-10 10 Aziz N H et al (1998), “Contamination of some common medicinal plant samples and spices by fungi and their mycotoxins”, Bot Bull Acad Sin., 39, pp.279-285 34 11 Barnett H L., Hunter B B (1972), Illustrated Genera of Imperfect Fungi, Burgess Publishing Company, Third Edition 12 Chang PK, Ehrlich KC (2010), "What does genetic diversity of Aspergillus flavus tell us about Aspergillus oryzae?", International Journal of Food Microbiology, 138, pp 189–199 13 Chen A J et al (2015), “Mycobiota and mycotoxins in traditional medicinal seeds from China”, Toxins 7, pp 3858-3875 14 Chien M-Y et al (2018), “Investigation of aflatoxins contamination in herbal materia medica in a Taiwan pharmaceutiacl factory”, Journal of food and drug analysis 26, pp 1154-1159 15 Cho S Y et al (2009), “Co-contamination of aflatoxins with ochratoxin A and zearalenone in Thuja orientalis semen”, Toxicol Res., 25(3), pp.125131 16 Do K H et al (2015), “Nation-based occurrence and endogenous biological reduction of mycotoxins in medicinal herbs and spices”, Toxins, 7, pp 4111-4130 17 Donia A (2008), “Microbiological quality and aflatoxinogenesis of Egyptian spices and medicinal plants”, Global veterinaria, (4), pp.175181 18 Gautam A K., et al (2016), “Mycotoxins: the silent killers inside herbal drugs A critical review of the literature”, Bio bulletin, Vol 2(1), pp.26-39 19 Gautam AK, Bhadauria R (2012), "Characterization of Aspergillus species associated with commercially stored triphala powder", African Journal of Biotechnology, 11(104), pp 16814-16823 20 Gonzalez H H L et al (1999), “Relationship between Fusarium and Alternaria alternate contamination and deoxynivalenol occurrence on Argentinian durum”, Mycopathologia, 144, pp 97-102 35 21 Haas et al (2013), “Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tae”, International Journal of food microbiology 166, pp.316-322 22 Hedayati MT, Pasqualotto AC, Warn PA, Bowyer P, Denning and D W (2007), "Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer", Microbiolog, 153, pp 1677–1692 23 Horn BW, Ramirez-Prado JH, Carbone I (2009), "The sexual state of Aspergillus parasiticus", Mycologia, 101(2), pp 275-280 24 Khati P (2014), “Mycoflora and aflatoxin assessment of crude herbal drugs during storage in Haridwar, Uttarakhand, India”, Indian Phytopath., Vol 67(4), pp.407-411 25 Mahajan S et al (2014), “Isolation and identification of fungal contamination in stored medicinal plants”, American journal of pharmacology and pharmacotherapeutics, 1(2), pp.052-058 26 Martins LM, Ana AS, Fungaro MH, Silva JJ, Nascimento MS, Frisvad JC, Taniwaki MH (2017), "The biodiversity of Aspergillus section Flavi and aflatoxins in the Brazilian peanut production chain", Food Res Int, 94, pp 101-107 27 Pitt J I., Hocking A D (2009), Fungi and Food Spoilage, Academic Press 28 Prado JH, Moore GG, Horn BW, Carbone, I (2008), "Characterization and population analysis of the mating-type genes in Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus", Fungal Genetics and Biology, 45, pp 1292-1299 29 Raper K B., Fennell D I (1965), Genus Aspergillus, Baltimo, Williams and Wilkins, USA 30 Rashidi M., Deokule S S (2013), “Natural occurrence of fungal and aflatoxins contamination in some genuine and market herbal drugs”, Int J Pharm Sci Rev Res., Vol 18(1), pp.121-125 36 31 Rashidi M., Deokule S.S (2013), “Associated fungal and aflatoxins contamination in some fresh and market herbal drugs”, J Microbiol Biotech Res., 3(1), pp.23-31 32 Rizzo I., et al (2004), “Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs”, Microbiological Research 159, pp.113-120 33 Salari et al (2012), “Assessment of the microbiological quality and mycotoxin contamination of Iranian red pepper spice”, J Agr Sci Tech., Vol 14, pp.1511-1521 34 Samson R A et al (1995), Introduction to food-borne fungi, Fourth edition, CBS press 35 Siddique N A et al (2013), “Determination of aflatoxins in medicinal plants by high-performance liquid chromatography - tandem mass spectometry”, J Pharam Sci., Vol 16(2), pp.321-330 36 Tosun H et al (2016), “Occurrence of aflatoxins (B1, B2, G1, G2) in herbal tea consumed in Turkey”, Journal of consumer protection and food safety, pp.1-5 37 ...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MALITA KHOUNTHAVONG MÃ SINH VIÊN: 1401327 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, PHÂN LOẠI LOÀI ASPERGILLUS FLAVUS VÀ... tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Malita KHOUNTHAVONG MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ