BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THÀNH ĐẠT TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MICROPELLET CHỨA ESOMEPRAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THÀNH ĐẠT MÃ SINH VIÊN: 1401139 TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MICROPELLET CHỨA ESOMEPRAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thạch Tùng DS Bùi Quang Đông Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Viện KNATVSTPQG HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thạch Tùng, TS Trần Cao Sơn, DS Bùi Quang Đông động viên, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trình học tập hồn thành khóa luận Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên môn Bào chế, anh chị công tác Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, thầy cô giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tâm huyết truyền đạt cho em kiến thức quý báu trình học tập trƣờng Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn ngƣời anh, chị, em, ngƣời bạn bên ủng hộ, quan tâm, động viên, giúp đỡ em sống học tập, giúp em có thêm động lực để học tập, rèn luyện nghiên cứu Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Phạm Thành Đạt MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dƣợc chất esomeprazol 1.1.1 Công thức 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Đặc điểm dƣợc động học 1.1.4 Dƣợc lý, chế tác dụng định 1.1.5 Một số chế phẩm chứa esomeprazol thị trƣờng 1.1.6 Một số nghiên cứu esomeprazol 1.2 Hệ đa tiểu phân (multiparticulates) 1.2.1 Định nghĩa, ƣu nhƣợc điểm hệ đa tiểu phân 1.2.2 Các phƣơng pháp bào chế tạo hệ đa tiểu phân 1.3 Kỹ thuật xử lý mẫu QuEChERS 13 1.3.1 Lịch sử phát triển 13 1.3.2 Nguyên tắc phƣơng pháp xử lý mẫu QuEChERS 14 1.3.3 Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật xử lý mẫu QuEChERS 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Nghiên cứu tiếp tục khảo sát công thức màng bao micropellet chứa esomeprazol 17 2.2.2 Sơ xây dựng phƣơng pháp đánh giá sinh khả dụng động vật thí nghiệm 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phƣơng pháp định lƣợng esomeprazol sắc ký lỏng hiệu cao 17 2.3.2 Nghiên cứu tiếp tục khảo sát màng bao micropellet chứa esomeprazol 18 2.3.3 Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp đánh giá sinh khả dụng động vật thí nghiệm 23 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Phƣơng pháp định lƣợng esomeprazol sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 27 3.1.1 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 27 3.1.2 Độ độ lặp lại 28 3.2 Tiếp tục nghiên cứu khảo sát công thức màng bao micropellet chứa esomeprazol 28 3.2.1 Đánh giá chế phẩm đối chiếu 28 3.2.2 Khảo sát công thức màng bao cách ly micropellet chứa esomeprazol 29 3.2.3 Khảo sát màng bao tan ruột micropellet chứa esomeprazol 32 3.2.4 Đánh giá micropellet bào chế 37 3.3 Sơ nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng động vật thí nghiệm 39 3.3.1 Khảo sát phƣơng pháp phân tích 39 3.3.2 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu 40 3.3.3 Thẩm định phƣơng pháp 42 3.3.4 Đánh giá sinh khả dụng thông số dƣợc động học 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội nhà hóa phân tích) DĐVN IV Dƣợc điển Việt Nam IV EMZ Esomeprazol HPLC High performance liquid chromatography ( sắc ký lỏng hiệu cao) U.S.FDA US Food and Drug Administration (Cục Quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Mỹ) HPMC Hydroxypropyl methyl cellulose kl Khối lƣợng LC – MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần PSA Primary secondary amine (tên thƣơng mại) TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất SEM Scanning electron microscope (kính hiển vi điện tử quét) TEC Triethyl citrat tt Thể tích USP United States Pharmacopeia ( Dƣợc điển Mỹ) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên vật liệu 16 Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu 17 Bảng 2.3 Thành phần dịch bồi lớp dƣợc chất 19 Bảng 2.4 Thành phần công thức dịch bồi cách ly 20 Bảng 2.5 Thành phần công thức dịch bao lớp bao tan ruột 20 Bảng 2.6 Chƣơng trình dung mơi phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ 25 Bảng 3.1 Mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ EMZ 27 Bảng 3.2 Độ độ lặp lại phƣơng pháp HPLC 28 Bảng 3.3 Công thức khảo sát ảnh hƣởng việc phối hợp EEE vào lớp cách ly 30 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng việc phối hợp EEE vào lớp cách ly 30 Bảng 3.5 Công thức khảo sát ảnh hƣởng lƣợng tá dƣợc chống dính 31 Bảng 3.6 Công thức khảo sát ảnh hƣởng loại tá dƣợc chống dính 32 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng loại tá dƣợc chống dính đến q trình bao 32 Bảng 3.8 Công thức khảo sát ảnh hƣởng lƣợng tá dƣợc chống dính cơng thức dịch bao tan ruột 33 Bảng 3.9 Công thức khảo sát polyme phối hợp vào công thức dịch bao tan ruột 35 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng loại polyme phối hợp 35 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng phƣơng pháp phối hợp tá dƣợc chống dính 36 Bảng 3.12 Kích thƣớc micropellet 39 Bảng 3.13 Các ion phân tử ion phân tích khối phổ 40 Bảng 3.14 Tỷ lệ thu hồi ảnh hƣởng mẫu với loại dung môi phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng 40 Bảng 3.15 Khảo sát muối chiết phƣơng pháp QuEChERS 41 Bảng 3.16 Độ lặp lại độ thu hồi phƣơng pháp LC – MS/MS (n=6) 44 Bảng 3.17 Thông số dƣợc động học EMZ mơ hình thỏ 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức cấu tạo esomeprazol magnesi trihydrat Hình 1.2 Một số kiểu phận đùn thiết bị đùn – tạo cầu Hình 1.3 Quá trình thay đổi hình dạng tiểu phân trình vo tạo cầu Hình 1.4 Cơ chế tăng kích thƣớc tiểu phân q trình bồi dịch bồi dạng dung dịch hỗn dịch 11 Hình 1.5 Cơ chế hình thành tiểu phân phƣơng pháp bao rắc bột khơ 12 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan diện tích pic nồng độ esomeprazol 27 Hình 3.2 Đồ thị giải phóng dƣợc chất chế phẩm đối chiếu Nexium 10 mg (n=3), (102,29 ± 9,39%) 29 Hình 3.3 Ảnh hƣởng lƣợng Talc công thức dịch bao cách ly 31 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ tá dƣợc chống dính 34 Hình 3.5 Ảnh hƣởng bề dày màng bao tan ruột đến micropellet 37 Hình 3.6 Hình ảnh micropellet bào chế chụp kính lúp soi 38 Hình 3.7 Đồ thị giải phóng chế phẩm (n=3) 38 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn tƣơng quan nồng độ dung dịch chuẩn với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn diện tích pic nội chuẩn phƣơng pháp LC – MS/MS 43 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ EMZ huyết tƣơng thỏ theo thời gian chế phẩm đối chiếu chế phẩm micropellet bào chế 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Esomeprazol hoạt chất thuộc nhóm ức chế bơm proton có đặc tính bền mơi trƣờng acid dịch vị nên chế phẩm chứa esomeprazol đƣợc bào chế dƣới dạng thuốc giải phóng ruột [26] Trong đề tài trƣớc, DS Nguyễn Thị Yến sơ nghiên cứu độ ổn định esomeprazol số điều kiện khảo sát đƣợc tính tƣơng hợp dƣợc chất với số tá dƣợc bao màng nhƣng chƣa khảo sát chi tiết hệ màng bao micropellet chứa esomeprazol Do yếu tố cơng thức quy trình bao cần khảo sát thêm Để định hƣớng cho việc xây dựng cơng thức, quy trình bào chế; nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất huyết tƣơng khảo sát mơ hình dƣợc động học động vật cần thiết Với ƣu điểm độ nhạy độ xác cao, kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS) kết hợp với phƣơng pháp chiết QuEChERS cho thấy tiềm cao để ứng dụng phân tích nồng độ thấp số dƣợc chất huyết tƣơng cỡ ng/ml Từ lí khóa luận lựa chọn esomeprazol chất mơ hình để tiến hành tiếp tục nghiên cứu khảo sát cải thiện màng bao micropellet chứa esomeprazol sơ đánh giá thông số dƣợc động học động vật thí nghiệm Khóa luận thực đề tài “Tiếp tục nghiên cứu bào chế micropellet chứa esomeprazol” với hai mục tiêu sau: Khảo sát đƣợc thành phần cơng thức quy trình bao màng hệ màng bao micropellet chứa esomeprazol Thẩm định đƣợc số tiêu phƣơng pháp định lƣợng esomeprazol huyết tƣơng kỹ thuật LC – MS/MS ứng dụng đánh giá sơ thông số dƣợc động học động vật chế phẩm chứa esomeprazol CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dƣợc chất esomeprazol 1.1.1 Công thức: Theo tài liệu tham khảo [8]: - Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo esomeprazol magnesi trihydrat Tên khoa học: magnesi bis[5-methoxy-2-[(S)-[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2yl]-1H-benzimidazol-1-id] trihydrat - Công thức phân tử: C34H36MgN6O6S2.3H2O - Khối lƣợng phân tử: 767,17 g/mol 1.1.2 Tính chất hóa lý Theo tài liệu tham khảo [8], [4]: - Cảm quan: bột màu trắng trắng ngà, hút ẩm - Tính tan: tan nƣớc, tan methanol, tan phần heptan - pKa = 8,8 - Esomeprazol (EMZ) bị phân hủy nhanh môi trƣờng acid, bền mơi trƣờng trung tính mơi trƣờng kiềm Tại pH 6,8 thời gian bán hủy EMZ 19 25oC 37oC 1.1.3 Đặc điểm dược động học Về hấp thu, esomeprazol (EMZ) hấp thu nhanh, đạt đỉnh nồng độ huyết tƣơng sau đến Hiện tƣợng chuyển dạng R – isomer không đáng kể huyết tƣơng Sinh khả dụng EMZ tăng lên theo liều dùng dùng nhắc lại Với liều 40 mg, sinh khả dụng đạt khoảng 64% dùng liều, tăng lên 89% nhắc lại liều ngày; với liều 20 mg, sinh khả dụng dùng liều nhắc lại liều lần lƣợt 50% 68% Thức ăn làm chậm giảm hấp thu [23] So với dạng racemic dosage forms using micellar liquid chromatography", Biomedical Chromatography, 31(5), pp 3865-3879 33 Thompson MR, Xi C, et al (2004), "Experiments and flow analysis of a micropelletizing die", Polymer Engineering & Science, 44(7), pp 1391-1402 34 Tran Son Cao, Duc Nguyen Dinh, et al (2016), "Pharmacokinetic analysis of levotetrahydropalmatine in rabbit plasma by rapid sample preparation and liquid chromatography–tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography B, 1008, pp 81-86 35 USP 40 NF 35 (2017), Esomeprazole magnesium delayed - release capsules pp 36 Van Nguyen Hien, Baek Namhyun, et al (2017), "Enhanced gastric stability of esomeprazole by molecular interaction and modulation of microenvironmental pH with alkalizers in solid dispersion", International journal of pharmaceutics, 523(1), pp 189-202 37 Xu Min, Heng Paul Wan Sia, et al (2016), "Formulation and process strategies to minimize coat damage for compaction of coated pellets in a rotary tablet press: a mechanistic view", International journal of pharmaceutics, 499(1-2), pp 29-37 38 Yoo Angelina (2009), _K63-Carrageenan [Kappa-Carrageenan] Micropellets: Production and Dissolution Behavior, Cuvillier Verlag, pp 39 Repka Michael A, Battu Sunil Kumar, et al (2007), "Pharmaceutical applications of hot-melt extrusion: Part II", Drug development and industrial pharmacy, 33(10), pp 1043-1057 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh sắc kí đồ phƣơng pháp định lƣợng HPLC Phụ lục 2: Độ độ lặp lại phƣơng pháp định lƣợng nồng độ esomeprazol HPLC Phụ lục 3: Các thông số tối ƣu cơng thức cho q trình bao lớp Phụ lục 4: Định lƣợng micropellet chế phẩm đối chiếu Nexium 10 mg ( n=3) Phụ lục 5: Thông số thiết bị sắc ký lỏng khối phổ Phụ lục 6: Sắc ký đồ khảo sát thông số hệ thống LC – MS/MS Phụ lục 7: Kết khảo sát muối chiết phƣơng pháp QuEChERS Phụ lục 8: Đánh giá điểm nhận dạng (IP) kỹ thuật phân tích khối phổ Phụ lục 9: Sắc ký đồ thẩm định tính chọn lọc phƣơng pháp phân tích LC – MS/MS Phụ lục 10: Sắc ký đồ chất chuẩn EMZ nồng độ LOD 0,05 ng/ml nồng độ LOQ 0,1 ng/ml phƣơng pháp xác định nồng độ EMZ huyết tƣơng thiết bị LC – MS/MS Phụ lục 11: Thời gian lƣu diện tích pic chất chuẩn nội chuẩn thẩm định tính tuyến tính phƣơng pháp định lƣợng nồng độ EMZ huyết tƣơng hệ thống LC – MS/MS Phụ lục 12: Kết tính tốn độ lặp lại độ thu hồi, sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại phƣơng pháp định lƣợng nồng độ EMZ huyết tƣơng thiết bị LC – MS/MS Phụ lục 13: Độ lặp lại tối đa độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (AOAC) PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh sắc kí đồ phƣơng pháp định lƣợng HPLC Hình PL 1.1 Sắc ký đồ mẫu thử Hình PL 1.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Phụ lục 2: Độ độ lặp lại phƣơng pháp định lƣợng nồng độ esomeprazol HPLC Bảng PL Kết độ độ lặp lại phƣơng pháp Nồng độ µg/ml Thứ Nồng Nồng tự độ tính độ tốn thực 5,88 5,20 5,95 Nồng độ 100 µg/ml Nồng độ 200 µg/ml Nồng Nồng độ tính độ tốn thực 113,00 112,02 111,00 100,92 5,30 112,21 116,73 115,00 6,05 5,30 114,07 116,56 5,95 5,25 113,28 4,96 4,30 4,96 4,30 Độ Nồng Nồng Độ độ thực 196,45 196,00 100,23 101,50 201,27 204,00 98,66 115,00 101,35 233,19 228,00 102,28 111,93 113,00 99,06 233,17 228,00 102,27 115,46 99,98 100,00 99,98 239,40 236,00 101,44 115,46 99,87 101,00 98,89 239,21 234,00 102,23 Độ độ tính tốn TB 113,91 100,28 101,18 SD 1,34 1,15 1,47 RSD 1,18 1,14 1,45 Phụ lục 3: Các thơng số tối ƣu cơng thức cho q trình bao lớp Bảng PL 3.1 Các thông số tối ƣu cho q trình bao lớp dƣợc chất Thơng số Giá trị Nhiệt độ khí vào 70 độ C Áp suất súng phun 1,5 bar Tốc độ phun dịch 1,5 ml/phút Độ mở cửa gió Đƣờng kính súng phun Tốc độ rũ 20% 1,0 mm lần / 7,5 giây Bảng PL 3.2 Công thức dịch bồi lớp dƣợc chất Thành phần Nhân BBO Lƣợng 35,0 g Esomeprazole trihydrat magnesi 7,69% (kl/tt) HPMC E606 3,0% (kl/tt) Mg(OH)2 0,77% (kl/tt) Tween 80 0,5% (kl/tt) Dung môi AAA 130 ml Bảng PL 3.3 Các thơng số tối ƣu cho q trình bao cách ly Thơng số Giá trị Nhiệt độ khí vào 70 độ C Áp suất súng phun 1,5 bar Tốc độ phun dịch 1,5 ml/phút Độ mở cửa gió 25% Đƣờng kính súng phun 1,0 mm Tốc độ rũ lần / 7,5 giây Bảng PL 3.4 Công thức màng bao cách ly cho micropellet Thành phần HPMC E606 F3 4% EEE 0,8% Talc 2% Tween 80 Dung môi BBB 0,5% Vđ Bảng PL 3.5 Các thông số tối ƣu cho q trình bao lớp bao tan ruột Thơng số Giá trị Nhiệt độ khí vào 35 độ C Áp suất súng phun 1,5 bar Tốc độ phun dịch 2,1 ml/phút Độ mở cửa gió 30% Đƣờng kính súng phun Tốc độ rũ 1,0 mm lần / 7,5 giây Bảng PL 3.6 Công thức lớp bao tan ruột Thành phần Lƣợng XXX1 49,74% (kl/kl) CCC 2,24% (kl/kl) TEC 1,50% (kl/kl) Tween 80 0,15% (kl/kl) Nƣớc 46,38% (kl/kl) Phụ lục 4: Định lƣợng micropellet chế phẩm đối chiếu Nexium 10 mg ( n=3) Chế phẩm Hàm lƣợng (%) Micropellet bào chế 1,84 ± 0,03 (*) Gói pha hỗn dịch Nexium 10 mg 99,70 ± 4,82 (**) Chú thích: (*) hàm lƣợng dƣợc chất có micropellet (**) hàm lƣợng dƣợc chất so với hàm lƣợng ghi nhãn (10 mg) Phụ lục 5: Thông số thiết bị sắc ký lỏng khối phổ Thông số Giá trị Nguồn ion APCI Chế độ ion hóa Dƣơng Chế độ ghi phổ MRM Khí nguồn GS1 (psi) 30 Khí nguồn GS2 (psi) 30 Nhiệt độ nguồn (độ C) 450 Thế ion hóa (ion spray voltage) (V) 5500 Khí màng (curtain gas) (psi) 25 Khí va chạm Q2 (psi) Phụ lục 6: Sắc ký đồ khảo sát thông số hệ thống LC – MS/MS A B Hình PL 6: A,B lần lƣợt sắc ký đồ chất chuẩn EMZ nội chuẩn pantoprazole pha dung môi acetonitril Phụ lục 7: Kết khảo sát muối chiết phƣơng pháp QuEChERS S T T Hiệu Diện tích Diện tích suất so pic nội pic nội với chuẩn chuẩn chuẩn pantoprazol pantoprazol EMZ mẫu thử mẫu chuẩn 8541,0 90,68% 7401,5 8828,0 83,84% 8617,0 98,74% 8266,5 7918,0 104,40% 77,02% 7467,0 9555,0 78,15% 72,68% 7097,0 8681,0 81,75% 68,12% 9590,0 12951,0 74,05% 10150,5 9003,0 112,75% Diện Diện Muối tích pic tích pic chiết EMZ EMZ thử chuẩn 7745,0 8508,5 MgSO4 MgSO4 + NaCl MgSO4 + PSA MgSO4 + C18 CH3COO NH4 NH4Cl 8239,5 7660,5 10838,5 11271,0 10698, 10540, 15912, 10854, 103,84 % Hiệu suất so với nội chuẩn pantoprazol Phụ lục 8: Đánh giá điểm nhận dạng (IP) kỹ thuật phân tích khối phổ Bảng PL 8.1 Quan hệ kỹ thuật khối phổ số điểm IP đạt đƣợc Kỹ thuật khối phổ Số điểm IP đạt đƣợc với ion MS phân giải thấp (LR-MS) 1,0 LR-MS (ion mẹ) 1,0 LR-MS (ion con) 1,5 MS phân giải cao (HR-MS) 2,0 HR-MS (ion mẹ) 2,0 HR-MS (ion con) 2,5 Bảng PL 8.2 Số điểm IP đạt đƣợc kỹ thuật khối phổ khác Kỹ thuật Số ion Số điểm IP GCMS (EI CI) n n GCMS (EI CI) (EI) + (CI) GCMS (EI CI) hai dẫn xuất (dc A) + (dc B) LC – MS n n GC – MS – MS ion mẹ, ion LC – MS – MS ion mẹ, ion GC – MS – MS ion mẹ, ion mẹ có ion LC – MS – MS ion mẹ, ion mẹ có ion LC – MS – MS - MS ion mẹ, ion ion cháu 5,5 HR-MS n 2n GC – MS LC – MS 2+2 GC – MS HR – MS 2+1 Phụ lục 9: Sắc ký đồ thẩm định tính chọn lọc phƣơng pháp phân tích LC – MS/MS A B C Hình PL Sắc ký đồ thẩm định tính chọn lọc phƣơng pháp phân tích xác định nồng độ EMZ huyết tƣơng thiết bị LC – MS/MS A: Sắc ký đồ mẫu huyết tƣơng trắng, B: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn huyết tƣơng trắng, C: Sắc ký đồ mẫu chuẩn pha acetonitril Phụ lục 10: Sắc ký đồ chất chuẩn EMZ nồng độ LOD 0,05 ng/ml nồng độ LOQ 0,1 ng/ml phƣơng pháp xác định nồng độ EMZ huyết tƣơng thiết bị LC – MS/MS Hình PL 10.1 Sắc ký đồ mẫu huyết tƣơng thêm chuẩn EMZ nồng độ LOD 0,05 ng/ml Hình PL 10.2 Sắc ký đồ mẫu huyết tƣơng thêm chuẩn EMZ nồng độ LOQ 0,1 ng/ml Phụ lục 11: Thời gian lƣu diện tích pic chất chuẩn nội chuẩn thẩm định tính tuyến tính độ chệch phƣơng pháp định lƣợng nồng độ EMZ huyết tƣơng hệ thống LC – MS/MS Bảng PL 11.1 Thời gian lƣu diện tích pic chất chuẩn nội chuẩn thẩm định tính tuyến tính Nồng độ Chất chuẩn EMZ Chất nội chuẩn pantoprazole Thời gian lƣu Diện tích pic Thời gian lƣu (phút) EMZ (phút) 0,1 4,39 41300 4,55 7520000 0,5 4,39 122000 4,55 7560000 1,0 4,39 243000 4,55 6160000 5,0 4,39 1300000 4,55 7310000 10,0 4,39 2500000 4,55 7240000 20,0 4,38 4650000 4,55 7080000 (ng/ml) Diện tích pic Bảng PL 11.2 Khoảng làm việc độ chệch phƣơng pháp LC – MS/MS Nồng độ EMZ lý Nồng độ EMZ tìm lại theo Độ chệch (%) thuyết (ng/ml) đƣờng chuẩn (ng/ml) 0,1 0,100 0,0 0,5 0,478 4,4 1,090 9,0 5,070 1,5 10 9,940 0,6 20 19,000 5,0 Phụ lục 12: Kết tính tốn độ lặp lại độ thu hồi, sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại phƣơng pháp định lƣợng nồng độ EMZ huyết tƣơng thiết bị LC – MS/MS Bảng PL 12 Độ thu hồi độ lặp lại phƣơng pháp Mẫu Nồng độ lý Nồng độ thuyết (ng/ml) tính lại (ng/ml) Độ thu Nồng độ trung hồi (R%) bình (ng/ml) Spk0,1-1 0,1 0,059 59.00 Spk0,1-2 0,1 0,058 58.00 Spk0,1-3 0,1 0,061 61.00 Spk0,1-4 0,1 0,061 61.00 Spk0,1-5 0,1 0,063 63.00 Spk0,1-6 0,1 0,066 66.00 Spk5-1 4,950 99.00 Spk5-2 4,910 98.20 Spk5-3 4,870 97.40 Spk5-4 5,010 100.20 Spk5-5 4,840 96.80 SD RSD % 0,061 0,003 4,69 4,958 0,12 2,41 Spk5-6 5,170 103.40 Spk20-1 20 17,500 87.50 Spk20-2 20 18,500 92.50 Spk20-3 20 18,800 94.00 Spk20-4 20 17,800 89.00 Spk20-5 20 18,800 94.00 Spk20-6 20 18,900 94.50 18,383 0,59 3,22 Hình PL 12 Sắc ký đồ thẩm định độ lặp lại nồng độ chất chuẩn EMZ ng/ml phƣơng pháp định lƣợng nồng độ EMZ huyết tƣơng thiết bị LC – MS/MS Phụ lục 13: Độ lặp lại tối đa độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (AOAC) Bảng PL 13.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (AOAC) TT Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD % 100 100% 1,3 10 10-1 10% 1,8 10-2 1% 2,7 0,1 10-3 0,1% 3,7 0,01 10-4 100 µg/ml 5,3 0,001 10-5 10 µg/ml 7,3 0,0001 10-6 µg/ml 11 0,00001 10-7 100 ng/ml 15 0,000001 10-8 10 ng/ml 21 10 0,0000001 10-9 ng/ml 30 Bảng PL 13.2 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (AOAC) TT Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi % 100 100% 98 – 102 ≥ 10 10-1 10% 98 – 102 ≥1 10-2 1% 97 – 103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95 – 105 0,01 10-4 100 µg/ml 90 – 107 0,001 10-5 10 µg/ml 80 – 110 0,0001 10-6 µg/ml 80 – 110 0,00001 10-7 100 ng/ml 80 – 110 0,000001 10-8 10 ng/ml 60 – 115 10 0,0000001 10-9 ng/ml 40 – 120