Đồ án công nghệ GVHD:Ths PhạmTrần Vĩnh Phú Phụ lục MỞ ĐẦU Kháng kháng sinh tượng vi sinh vật đề kháng lại kháng sinh mà trước vi sinh vật nhạy cảm, dẫn đến giảm hiệu kháng sinh, thất bại điều trị nhiễm khuẩn chí lây lan sang bệnh nhân khác Kháng kháng sinh hậu sử dụng kháng sinh, đặc biệt trường hợp lạm dụng kháng sinh phát triển có đột biến hệ gen vi sinh vật vi sinh vật tiếp nhận gen kháng thuốc Kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính tồn cầu Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh xuất vào năm 1950, sau thời gian ngắn sau thuốc kháng sinh bắt đầu đưa vào sử dụng.Mặc dù vào đầu năm 1980, nhiều loại kháng sinh phát 30 năm trở lại đây, khơng có loại kháng sinh tìm thấy Điều có nghĩa tốc độ phát minh kháng sinh có dấu hiệu tụt lùi so với phát triển bất thường vi sinh vật, kéo theo gia tăng tất yếu tượng kháng kháng sinh nguy khơng kháng sinh để điều trị bệnh nhiễm khuẩn tương lai Vì vậy, việc phát vi sinh vật kháng kháng sinh gen đột biến gây nên tượng kháng kháng sinh cần thiết việc khắc phục tượng kháng thuốc phát triển loại kháng sinh Có nhiều phương pháp để phát kiểu hình kiểu gen vi sinh vật kháng thuốc phát vi sinh vật kháng thuốc bằng phương pháp D-test pha loãng thạch… Tuy nhiên, này, giới thiệu phương pháp xác định gen mã hóa cho kháng hai loại kháng sinh Erythromycin Vancomycin dựa nguyên tắc phương pháp PCR Đây phương pháp tương đối phổ biến việc phát kiểu gen kháng thuốc độ tin cậy cao CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH VÀ SỰ KHÁNG KHÁNG SINH Ơ VI KHUẨN SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH Đồ án công nghệ 1 GVHD:Ths PhạmTrần Vĩnh Phú Kháng sinh Kháng sinh (antibiotics) tất chất hóa học chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tởng hợp, chúng có khả kìm hãm phát triển tiêu diệt vi sinh vật bằng cách tác động chuyên biệt giai đoạn chuyển hóa cần thiết vi sinh vật Ngày nay, số lượng chủng loại kháng sinh nhiều đa dạng Tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo hóa học hiệu tác động, mà có nhiều chế tác động kháng sinh lên vi sinh vật chí có chế chưa hiểu biết đầy đủ Tuy nhiên, kháng sinh tác động lên vi khuẩn theo số chế sau: 1.1 Ức chế sinh tổng hợp màng tế bào Các kháng sinh điển hình cho chế tác dụng bao gồm nhóm β- lactam, nhóm Glycopeptide (Vancomycin), nhóm polymycine (baxitracin) Nhìn chung, kháng sinh có khả tác động vào nhiều giai đoạn trình tổng hợp màng tế bào vi sinh vật, cụ thể như: ngăn cản trình vận chuyển thành phần tạo màng màng, ức chế men tổng hợp yếu tố tế bào vi khuẩn… Bên cạnh đó, kháng sinh làm rối loạn trình nhân lên vi khuẩn; vi khuẩn nhân lên khơng có vách vách khơng hồn chỉnh Khi đó, vi khuẩn mỏng manh, kích thước dài ra, dễ bị tiêu diệt môi trường xung quanh bị đại thực bào bắt tiêu diệt 1.1.2 Gây rối loạn chức màng nguyên sinh chất Kháng sinh gây rối loạn tính thấm màng nguyên sinh chất, chất tởng hợp bị khỏi tế bào Vì vậy, kháng sinh ức chế trình chuyển hố lượng, ảnh hưởng đến hơ hấp vi khuẩn ức chế trình phân chia tế bào, ví dụ: kháng sinh Polymycin có chế tác dụng kiểu 1.1.3 Ức chế sinh tổng hợp protein acid nucleic - Tác dụng lên ribosom vi khuẩn: 1.1.4 + Kháng sinh gắn lên tiểu phần 30S ribosom ngăn cản ARN vận chuyển (tRNA) mang acid amin đối mã với phân tử ARN thông tin (mRNA), dẫn đến protein khơng tởng hợp Vì vậy, vi khuẩn bị ức chế tiêu diệt Kháng sinh có tác dụng theo chế phải kể đến: tetracyclin + Kháng sinh tác động lên tiểu phần 50S ribosom làm rối loạn tổng hợp protein ngăn cản trình hình thành liên kết peptid acid amin nên khơng hình thành chuỗi polypeptide, ví dục Macrolide (Erythromycin), Lincosamid Phenicol SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH Đồ án công nghệ GVHD:Ths PhạmTrần Vĩnh Phú - Kháng sinh tác động lên acid folic: acid folic sở cho tổng hợp methionin, purin pyrimdin, từ tởng hợp nên protein acid nucleic vi khuẩn Sulfamid trimethoprim có cấu trúc hố học tương tự acid folic acid paraaminobenzoic, sử dụng sulfamid trimethoprim để điều trị, phân tử cạnh tranh enzym chiếm chỗ trình tổng hợp protein acid nucleic làm cho hoạt động tế bào bị rối loạn -Kháng sinh gắn vào enzym gyrase làm cho enzym không cắt phân tử ADN hình vòng vi khuẩn thành dạng sợi thẳng Vì vậy, ADN khơng thể nhân lên được, đồng thời ngăn cản trình chép mã di truyền thành ARN thông tin Kết làm cho vi khuẩn không nhân lên không tổng hợp protein Kháng sinh tác dụng theo chế nhóm Quinolon Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 2.1 Các loại đề kháng kháng sinh 2.1.1 Đề kháng giả: Vi khuẩn có biểu đề kháng khơng có liên quan gen nên khơng di truyền Trên thực tế, số tượng đề kháng vi khuẩn nằm ổ ápxe lớn có tở chức hoại tử bao bọc dẫn đến kháng sinh không thấm vào ổ viêm nên không tác động vi khuẩn gây bệnh Tương tự, vi khuẩn trạng thái nghỉ (khơng phát triển, khơng chuyển hố) khơng chịu tác dụng thuốc ức chế q trình sinh tởng hợp chất vi khuẩn lao nằm hang lao Ngoài ra, gặp tượng kháng thuốc giả hệ thống miễn dịch thể bị suy giảm chức đại thực bào hạn chế thể không đủ khả loại trừ vi khuẩn bị kháng sinh ức chế, hết kháng sinh, chúng hồi phục phát triển trở lại 2.1.2 Đề kháng thật: Đây hình thức đề kháng gen quy định có tính di truyền - Đề kháng tự nhiên: Một số vi khuẩn không chịu tác động số kháng sinh định Pseudomonas không chịu tác dụng Penicillin, tụ cầu không chịu tác dụng colistin Đó dung nạp thuốc vi khuẩn khơng có vách Mycoplasma không chịu tác dụng kháng sinh ức chế sinh tởng hợp vách nhóm β-lactam - Đề kháng thu được: Do biến cố di truyền đột biến nhận gen đề kháng làm cho vi khuẩn từ khơng có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng Trên thực tế, kháng sinh nhân tố chọn lọc vi khuẩn SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH Đồ án công nghệ 2.2 GVHD:Ths PhạmTrần Vĩnh Phú Cơ chế đề kháng kháng sinh Gen đề kháng tạo đề kháng bằng cách: - Làm giảm tính thấm màng nguyên sinh chất: vi khuẩn đề kháng có khả tạo protein đưa màng ngăn cản kháng sinh thấm vào tế bào vi khuẩn làm khả vận chuyển qua màng cản trở protein vận chuyển Vì vậy, kháng sinh khơng vào tế bào - Sinh isoenzyme, dẫn đến vi khuẩn khơng chịu tác động kháng sinh (không thu hút kháng sinh) nên không chịu tác động kháng sinh Ví dụ: sulfamid trimethoprim - Làm thay đởi đích tác động: Đột biến gen làm thay đổi cấu trúc phân tử protein, receptor tiếp nhận kháng sinh bám vào Kết kháng sinh khơng gắn vào điểm nên khơng có tác dụng Ví dụ: protein cấu trúc nucleotid tiểu phần 30S 50S ribosom bị thay đổi giúp vi khuẩn kháng Streptomycin, Erythromycin - Sinh enzyme làm biến đởi cấu trúc hố học phân tử kháng sinh làm tác dụng kháng sinh phá huỷ cấu trúc hố học phân tử kháng sinh, ví dụ β-lactamase làm cho kháng sinh nhóm β-lactam tác dụng -Cơ chế bơm thuốc (efflux pumps): hệ thống bơm dòng có tác dụng chuyển kháng sinh ngoài, làm giảm nồng độ kháng sinh tế bào vi khuẩn - Những vi khuẩn kháng kháng sinh thường phối hợp chế đề kháng kháng sinh với Ví dụ: số vi khuẩn Gram (-) kháng β-lactam có men β-lactamase kết hợp với giảm khả gắn với kháng sinh giảm tính thấm màng nguyên sinh chất 2.3 Cơ chế lan truyền đề kháng Vi khuẩn mang gen đề kháng kháng sinh truyền dọc từ hệ sang hệ khác qua nhân lên tế bào truyền ngang từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác Cơ chế lan truyền gen đề kháng là: - Trong tế bào: Gen đề kháng truyền từ phân tử ADN sang phân tử ADN khác tế bào nhờ chế transposon - Giữa tế bào: Thông qua hình thức vận chuyển di truyền tiếp hợp, biến nạp, tải nạp, gen đề kháng chuyển từ tế bào sang tế bào khác loài khác loài SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH Đồ án công nghệ GVHD:Ths PhạmTrần Vĩnh Phú - Trong quần thể vi sinh vật: Thông qua chọn lọc tác dụng kháng sinh, vi khuẩn đề kháng chọn lọc phát triển thay vi khuẩn nhạy cảm - Trong quần thể đại sinh vật: Những vi khuẩn đề kháng lây lan từ người sang người khác qua đường trực tiếp gián tiếp 2.4 Macrolide chế kháng vi khuẩn 1.1.1 MACROLIDE 2.4.2.1 Cấu tạo phổ hoạt động 2.4.1 Cấu tạo phổ hoạt động macrolide Macrolide kháng sinh quan trọng sử dụng để điều trị nhiễm trùng vi khuẩn Gram dương gây Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes tác dụng hiệu chủng vi sinh vật kháng Penicilin Tetracyclin, đặc biệt Staphylococus người có biểu dị ứng với penicillin Erythromycin, chiết từ vi nấm Streptomyceserythreus, kháng sinh thuộc nhóm macrolide dùng rộng rãi nhất, bắt đầu sử dụng lâm sàng từ nǎm 1950.[1] Macrolide đặc trưng vòng lacton có 14, 15 16 cạnh mang nhiều gốc đường(cladinose, desosamine…) (bằng liên kết glycosit) gốc thay phụ liên kết với nguyên tử khác vòng lacton -Loại thuốc vòng 14 cạnh, chẳng hạn như: Erythromycin, Clarithromycin, Roxithromycin, Dirithromycin… -Loại thuốc vòng 15 cạnh như: azithromycin… -Loại thuốc vòng 16 cạnh như: tylosin, carbomycin A, josamycin, midecamycin, miocamycin, rokitamyin, spiramycin … Thế hệ họ Macrolide ketolide-được đặc trưng thay đường cladinose vị trí C3 với nhóm keto 2.4.2.2 Cơ chế tác đợng thuốc: 2.4.2 Cơ chế tác đợng macrolide Macrolide thuộc nhóm tác động đến q trình tởng hợp protein tế bào vi khuẩn ( tranh giành vị trí gắn ribosom ngăn cản vị trí chuyển dịch axit amin): Macrolide liên kết với tiểu đơn vị ribosome lớn (50S) vùng lân cận trung tâm SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH Đồ án công nghệ GVHD:Ths PhạmTrần Vĩnh Phú peptidyl transferase gây kiềm hãm tăng trưởng tế bào vi khuẩn ức chế tởng hợp protein Do đó, kháng sinh kìm khuẩn hay tĩnh khuẩn, tức khơng có tác dụng hủy diệt mầm bệnh mà có tác dụng ức chế nhân lên chúng Cơ chế xác phụ thuộc vào cấu trúc hóa học cụ thể thuốc, có kiểu ức chế tởng hợp protein Macrolide: - Ức chế tiến triển chuỗi peptit tạo thành; Xúc tiến phân li tRNA peptidyl khỏi ribosom; Ức chế hình thành liên kết peptit; Can thiệp vào lắp ráp tiểu đơn vị ribosom 50S 2.4.2.3 Vị trí gắn kết Macrolide ribosom: Vị trí chung nơi liên kết macrolid tiểu đơn vị ribosome lớn (50S) Cụ thể: - RNA tạo nên thành phần vị trí gắn Macrolide (một số dư lượng nucleotide miền V 23S rRNA tương tác với phân tử nhóm macrolid) Mối liên kết góp phần đáng kể cho sức mạnh tương tác phân tử macrolid với ribosome, hình thành chuỗi mono disaccharide C5 Macrolide vòng 14 - 15 - 16 cạnh rRNA 2.4.2.4 Cơ chế khángMacrolide vi khuẩn: 2.4.32 Cơ chế kháng macrolide vi khuẩn Vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh macrolide, lincosamide-streptogramin B cách: (1) thông qua chỉnh sửa mục tiêu bằng cách methyl hóa đột biến ngăn chặn gắn kết kháng sinh để ribosome mục tiêu (2) thơng qua chế bơm thuốc (efflux pumps) (3) Cơ chế enzyme khử hoạt tính thuốc 1.3.1.4.12.4.32.1 Cơ chế thay đổi vị trí mục tiêu thuốc: Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác vi khuẩn Các đích cho kháng sinh bị thay đởi bảo vệ gắn kết protein, thuốc khơng thể gắn vào tác động đến vi khuẩn Cơ chế đề kháng xảy với hầu hết kháng sinh Với loại vi khuẩn kháng Macrolide việc sửa đởi vị trí mục tiêu thơng qua việc methyl hóa ribosome mục tiêu, đột biến ribosome mục tiêu hay thông qua trung gian peptide SVTH: Thị Nhi, Thị Nhung,Khánh Phương, Ngọc Sinh- lớp 10SH Đồ án công nghệ a GVHD:Ths PhạmTrần Vĩnh Phú Methyl hóa ribosome Năm 1956, sau Erythromycin đưa vào điều trị, kháng thuốc xuất chủng thuộc Staphylococci Nghiên cứu sinh hóa cho thấy sức đề kháng methyl hóa mục tiêu ribosome thuốc kháng sinh, dẫn đến đề kháng chéo với Macrolide, Lincosamide, Streptogramin B, gọi MLSB kiểu hình Sau đó, kiểu hình MLS B mã hóa loạt gen erm (Erythromycinribosome methylase) báo cáo số lượng lớn vi sinh vật Các chủng kháng thuốc Erythromycin liên cầu khuẩn (Streptococci) báo cáo Vương quốc Anh vào năm 1959 Bắc Mỹ vào năm 1967[1] Cho đến nay, methyl hóa ribosome chế phở biến q trình kháng MLSB Trong vi khuẩn gây bệnh, protein tổng hợp từ gen erm đơn adenine 23S, phần tiểu đơn vị lớn (50S) ribosome Như hệ methyl hóa, liên kết Erythromycin với mục tiêu bị suy yếu Sự chồng chéo liên kết Macrolide, Lincosamide, Streptogramin B 23S rRNA dẫn đến kháng chéo loại thuốc Một loạt vi sinh vật kháng macrolid bao gồm vi khuẩn gram dương, xoắn khuẩn, vi khuẩn yếm khí, biểu gen Erm methylases Gần 40 gen erm báo cáo Trong vi khuẩn gây bệnh, yếu tố định chủ yếu sinh plasmid transposon tự transferable Có thể phân biệt 21 loại gen erm protein Erm tương ứng dựa vào tương đồng kiểu gen (= 21 Nhạy cảm (S) 16-20 Trung gian (I) = 19 Nhạy cảm (S) 16-18 Trung gian (I)