TUYỂN CHỌN MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ĐỂ SẢN XUẤT BỘT BÀO TỬ DÙNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ĐỂ SẢN XUẤT BỘT BÀO TỬ DÙNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG Họ và tên s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ĐỂ SẢN XUẤT

BỘT BÀO TỬ DÙNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THU THẢO Ngành: BẢO QUẢN, CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM

Niên khóa: 2006 – 2010

Tháng 08/2010

TUYỂN CHỌN MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ĐỂ SẢN XUẤT BỘT BÀO

TỬ DÙNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

Tác giả

NGUYỄN THỊ THU THẢO

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản và vi sinh thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

ThS Nguyễn Minh Hiền ThS Phạm Tuấn Anh

Tháng 8 năm 2010

LỜI CÁM ƠN

Suốt cả cuộc đời tần tảo khó nhọc ba mẹ nuôi con khôn lớn thành người Công lao to lớn đó con xin dành trọn những thành quả mà mình đạt được cho đến ngày hôm nay dâng lên ba mẹ

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, các thầy cô, đặc biệt là quý Thầy Cô ở Khoa công nghệ thực phẩm đã hướng dẫn, giảng dạy và truyền cho em những kiến thức

vô cùng quý báu làm hành trang cho em vững bước trên đường đời

Thật là vô cùng hạnh phúc, nhờ vào lòng từ bi của Hòa Thượng Trụ Trì Thiền viện Thường Chiếu, Thiền viện Trí Đức Chính tại nơi đây con đã được tạo mọi điều kiện hoàn thành đề tài và học tập được những kinh nghiệm sản xuất nước tương truyền thống

Em xin bày tỏ sự biết ơn tới Thầy Phạm Tuấn Anh, Cô Nguyễn Minh Hiền, đã tận tâm chỉ dạy, hướng dẫn suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới Bác Lâm Minh Thuận, Cô Vũ Thị Lâm An và các bạn bè đã động viên em trong quá trình thực hiện đề tài

TÓM TẮT 

Đề tài “Tuyển chọn mốc Aspergillus oryzae để sản xuất bột bào tử dùng trong

sản xuất nước tương” được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Khoa công nghệ

thực phẩm – Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và Thiền viện Thường chiếu số 1C – Huyện Long Thành – Đồng Nai Thời gian tiến hành đề tài từ tháng 4/2010 đến tháng 7/2010

Kết quả nghiên cứu cho thấy: Quan sát đại thể 5 khuẩn lạc của mẫu nấm mốc thu nhận từ 5 nguồn khác nhau không có sự khác biệt về màu sắc và sợi khuẩn ty Tuy nhiên, sau khi nuôi cấy 72 giờ, đường kính khuẩn lạc của các mẫu nấm mốc đo được cho thấy, M3 từ Thường viện Thường Chiếu sinh trưởng mạnh mẽ nhất vì có đường kính lớn nhất (4,3cm), sau đó là tới mẫu M4 (4,3cm) phân lập tự nhiên và M5 (4,1cm) từ Khoa Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Đồng thời, kết quả đo vòng phân giải tinh bột của 5 mẫu cũng chỉ ra rằng: mốc M3 là có hoạt lực enzyme amylase mạnh nhất, hiệu số vòng phân giải tinh bột là 2cm sau 48 giờ nuôi cấy và tăng lên thành 4cm sau 72 giờ, kế tiếp là mẫu M4 và M5 ( cùng được 3,5cm sau 72 giờ), hoạt lực enzyme amylase kém nhất là thu nhận từ mẫu M1 và M2, hiệu số vòng phân giải chỉ đạt được 3cm sau 72 giờ

Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên quá trình sản xuất bột

bào tử Aspergillus oryzae , kết quả thu được NT1 (150 g bã đậu nành : 30 g bắp mảnh : 15

g trấu) nấm Asp oryzae phát triển tốt nhất Với việc bổ sung 1% MgSO4(w/w) so với bã

đậu nành, đã kích thích sự phát triển của Aspergillus oryzae

MỤC LỤC

Trang

TRANG TỰA i

LỜI CÁM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Nội dung 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về nước tương 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng 3

2.2 Phương pháp sản xuất 4

2.2.1 Phương pháp vi sinh 4

2.2.2 Phương pháp hóa học 4

2.2.3 Phương pháp enzyme 5

2.3 Phương pháp sản xuất nước tương truyền thống 5

2.3.1 Quy trình sản xuất 5

2.3.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng trong sản xuất nước tương 8

2.3.2.1 Giới thiệu chung về Asp oryzae 8

2.3.2.2 Điều kiện sinh trưởng và phát triển 10

2.4 Sản xuất bột bào tử Asp oryzae trên môi trường bán rắn 10

2.4.1 Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae 11

2.4.2 Các nguyên liệu sử dụng để sản xuất bột bào tử trong đề tài 11

2.4.2.1 Bã đậu nành 11

2.4.2.2 Bắp mảnh (ngô mảnh) 12

2.4.2.3 Trấu 13

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình sản xuất bột bào tử 13

2.5 Các sự cố thường gặp trong sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men 15

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men 16

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.1.1 Thời gian 17

3.1.2 Địa điểm 17

3.2 Nguyên vật liệu 17

3.3 Hóa chất – Môi trường – Thuốc nhuộm: 17

3.3.1 Môi trường 17

3.3.2 Hóa chất 18

3.3.3 Thuốc nhuộm 18

3.4 Thiết bị - Dụng cụ 18

3.4.1 Thiết bị 18

3.4.2 Dụng cụ 18

3.4.3 Tiến trình thực hiện……….19

3.5 Phương pháp thực hiện 19

3.5.1 Thí nghiệm 1: Thu thập nấm Asp oryzae từ các cơ sở và PTN 19

3.5.2 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn nấm Aspergillus oryzae có hoạt lực cao 20

3.5.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy tới quá trình sản xuất bột bào tử Aspergillus oryzae 20

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả thí nghiệm 1: Thu thập nấm Asp oryzae từ các cơ sở và PTN 23

4.2 Kết quả thí nghiệm 2: Tuyển chọn Aspergillus oryzae có hoạt lực cao 28

4.3 Kết quả thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy tới quá trình

sản xuất bột bào tử Aspergillus oryzae 31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh 7

Hình 2.2: Hình thái Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus 9

Hình 2.3: Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae 11

Hình 3.1 Tiến trình thực hiện đề tài 19

Hình 3.2: Quy trình sản xuất bột bào tử nấm mốc Asp oryzae 21

Hình 4.1: Khuẩn lạc M1 đến M5 sau 48 và 72 giờ nuôi cấy 26

Hình 4.2: Hình ảnh tế bào M1 – M5 dưới kính hiển vi vật kính x40 27

Hình 4.3: Vòng phân giải tinh bột 30

Hình 4.4: NT 1 (150 g bã đậu nành: 30 g bắp mảnh: 15 g trấu) sau 72 giờ nuôi Asp oryzae 32

Hình 4.5: NT 2 (150 g bã đậu nành: 50 g bắp mảnh: 15 g trấu) sau 72 giờ nuôi Asp oryzae 32

Hình 4.6: NT 3 (150 g bã đậu nành : 70 g bắp mảnh : 15 g trấu) sau 72 giờ nuôi Asp oryzae 33

Hình 4.7: NT 4 (150 g bã đậu nành : 30 g bắp mảnh : 15 g trấu : 1,5 g MgSO4) sau 72 giờ nuôi Asp oryzae 34

Hình 4.8: Bột bào tử Asp oryzae 34

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm Asp oryzae 10 

Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành 12 

Bảng 2.3: Thành phần hóa học trung bình của bắp mảnh 13 

Bảng 3.1: Bảng bố trí thí nghiệm 22 

Bảng 4.1: Đặc điểm của khuẩn lạc ở các thời điểm 24, 48, 72 giờ 24 

Bảng 4.2: Đường kính khuẩn lạc ở thời điểm 48h và 72h 24 

Bảng 4.3: Hiệu số vòng phân giải tinh bột 28 

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ bắp mảnh trong môi trường sản xuất bào tử tới sinh trưởng của Asp oryzae 31 

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nước tương là gia vị không thể thiếu trong ẩm thực của người dân châu Á nói chung

và người dân Việt Nam nói riêng Không những thế, loại gia vị này đang được ưa chuộng trên khắp trên thế giới (Mỹ, Úc,…)

Hiện nay, nước tương được sản suất chủ yếu bằng phương pháp hóa học Ưu điểm của phương pháp này là rút ngắn được thời gian và chi phí cho sản xuất Tuy nhiên, một nhược điểm lớn không thể chấp nhận là sự hình thành độc tố gây ung thư, đại diện là chất

3 - MCPD (3 - monochloropropanol), xuất phát từ tác nhân acid HCl trong quá trình thủy phân nguyên liệu có chứa dầu Vì thế, công nghệ hóa học không thể tạo ra sản phẩm nước tương an toàn được

Trong khi đó, từ ngàn xưa con người đã biết và làm ra nước tương mà không cần dùng đến bất cứ một chất hóa học nào, đó là phương pháp lên men nước tương truyền thống Bằng cách sử dụng mốc trong tự nhiên, ngày nay được biết tới với tên khoa học là

Aspergillus oryzae Nấm mốc này có khả năng tạo ra các loại enzyme (amylase,

protease,…) thủy phân cơ chất (tinh bột, protein,…) trên hạt đậu nành thành các chất dinh dưỡng (đường, acid amin,…) Phương pháp này không sinh ra độc tố 3 – MCPD, đồng thời tạo cho sản phẩm có hương vị thơm ngon đặc trưng Phương pháp truyền thống thường được áp dụng ở các cơ sở nhỏ nên chưa được kiểm soát chặt chẽ, cụ thể là ở khâu tuyển chọn mốc giống, nhân giống mốc, ủ mốc Hiện nay, một số Chùa và Thiền viện của Việt Nam như chùa Bảo Hải ở Vũng Tàu, thiền viện Thường Chiếu ở Đồng Nai,…đã

và đang sản xuất nước tương theo phương pháp truyền thống Với mục đích tuyển chọn giống có hoạt tính cao và kiểm soát khâu nhân giống ở Thiền viện Thường Chiếu chúng

tôi thực hiện đề tài “Tuyển chọn mốc Aspergillus oryzae để sản xuất bột bào tử dùng

trong sản xuất nước tương”

1.2 Mục tiêu

Phân lập và tuyển chọn chủng Aspergillus oryzae cho hoạt lực enzyme amylase

Sản xuất bột bào tử nấm mốc Asp Oryzae

1.3 Nội dung

Phân lập, thuần chủng và định danh nấm mốc Aspergillus oryzae từ các nguồn mẫu

giống đã thu thập ở các cơ sở sản xuất

Tuyển chọn chủng Aspergillus oryzae cho hoạt lực enzyme amylase và protease cao

nhất

Sản xuất bột bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae từ chủng đã qua tuyển chọn

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về nước tương

2.1.1 Khái niệm

Nước tương là sản phẩm thủy phân từ protein có nguồn gốc thực vật hay động vật Nước tương được thủy phân từ protein thực vật còn gọi chung là HVP (hydrolyzed vegetable protein)

Ở Việt Nam, nước tương là sản phẩm thực phẩm truyền thống được dùng làm gia vị ở khắp ba miền Bắc, Trung, Nam Còn trên thế giới, nước tương cũng được dùng làm gia

vị, cụ thể như ở Nhật nổi tiếng với các sản phẩm như xì dầu tamari Koyo, xì dầu Shiro, xì dầu Saishikomi, Kikoman; còn ở Trung Quốc lại có các sản phẩm xì dầu đặc, xì dầu bột nhão…

Tương có vị ngọt của đường, vị đậm đà của đạm và mặn của muối ăn Thành phần hóa học chính của tương gồm đường đơn giản, acid amine, lipid, NaCl, nước Ngoài ra còn có các vitamine (đặc biệt là vitamine nhóm B) (Nguyễn Thị Hiền, 2007)

Các nguyên liệu trong sản xuất tương phải có đủ đạm và tinh bột Trong đó, chất đạm chiếm 70 - 80% chủ yếu từ nguồn protein thực vật như đậu nành, bánh khô dầu đậu nành hoặc đậu phộng Còn chất bột chiếm 20 - 30%, thường sử dụng bột gạo, nếp, bột mì…

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng

Tác giả Umeda (1969) phân tích nước chấm lên men từ đậu nành ở Nhật đã thấy: sản phẩm đạt hiệu suất chuyển hóa đạm 75,7% trong đó đạm amin đạt trên 50% Theo Yokotsuka (1960) trong đạm toàn phần của Shoyu có 40 – 50% đạm amin, 40 – 50% peptide và pepton, 10 – 15% amoniac và dưới 1% protein Trong đó có đầy đủ 17 acid amin phổ biến mà chủ yếu là acid glutamic và muối của nó, các base hữu cơ như Adenine, Guanine, Uracil, Cytosine Các loại đường như glucose, saccharose, galactose, arabinose,

maltose, rượu glycerol, acid hữu cơ là acetic, lactic… (Trích dẫn bởi Đồng Thị Thanh Thu, 2005)

2.2 Phương pháp sản xuất

2.2.1 Phương pháp vi sinh

Phương pháp này đã có từ lâu đời Người ta sử dụng mốc có màu vàng hoa cau trong

tự nhiên để phân giải đậu nành Mốc này có tên khoa học là Aspergillus oryzae Nấm mốc

tham gia thủy phân tinh bột và thủy phân protein Ngoài ra, còn tạo thành rượu và các este Các chất này tạo nên hương vị đặc trưng của tương Với tác nhân thủy phân là vi sinh vật sản phẩm không tạo thành 3 - MCPD Tuy nhiên có một loài nấm sợi có màu sắc

và hình thái rất giống với loài Aspergillus oryzae nhưng lại rất nguy hiểm rất có thể nhiễm

từ không khí hay có trong các nguyên liệu có dầu như đậu phộng, đậu nành bảo quản

không tốt Đó là loài Aspergillus flavus, một loài nấm có thể sinh ra độc tố Aflatoxin -

một loại độc tố có thể gây ung thư Loài nấm này có hình thái và màu sắc rất giống với

loài Aspergillus oryzae Chỉ có các chuyên gia có kinh nghiệm mới phân biệt được hai

loài này (Nguyễn Lân Dũng, 2007)

2.2.2 Phương pháp hóa học

Nhằm tăng hiệu suất thủy phân và rút ngắn thời gian sản xuất, người ta sử dụng các hóa chất để phân giải cơ chất Nguyên liệu dùng sản xuất nước tương thường bao gồm bã khô đậu nành, bã khô đậu phộng đã trích ly dầu có protein tổng hợp từ 42 - 50% Hàm lượng chất béo còn 5 - 8% trong bánh khô đậu phộng ép thủ công và 3 - 5% trong bánh khô dầu đậu phộng ép công nghiệp Dùng tác nhân xúc tác là acid mạnh (HCl, H2SO4) hay kiềm mạnh (NaOH) để thủy phân protein trong nguyên liệu sản xuất, sau đó quá trình tiến hành trung hòa dung dịch để đưa pH về 6,5 – 7 cuối cùng bổ sung NaCl đạt 23 – 25% nồng độ muối Khi thủy phân, chất béo phân giải thành glycerol và acid béo Trong môi trường acid (nếu dùng HCl) và nhiệt độ cao thì Glycerol tạo thành phản ứng với HCl tạo độc tố 3 – Monochlopropanol - 1,2 -diol 3 – Monochlopropanol - 1,2 - diol là hóa chất tiêu biểu thuộc nhóm Chloropropanol Cùng với 1,3 - dichloropropanol (1,3 - DPC), 3 - MCPD đã được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm nhất là trong nước tương

(http://vietsciences.free.fr) Nếu dùng H2SO4 thì sản phẩm lại có vị chát và bị cặn do tạo thành CaSO4 trong quá trình trung hòa.Phương pháp hóa học có ưu điểm là rút ngắn thời gian sản xuất từ vài tháng theo phương pháp lên men xuống chỉ còn 2 - 3 ngày/ mẻ, hiệu suất thủy phân cao từ 85 - 90% Sản phẩm giàu acid amin có mùi vị ngọt thơm, dễ bảo quản Nhưng nhược điểm không thể chấp nhận là tạo thành độc tố khi thủy phân bằng HCl đồng thời có ảnh hưởng xấu cho người sản xuất và môi trường

2.2.3 Phương pháp enzyme

Do nhược điểm phương pháp vi sinh là tốc độ phân giải cơ chất chậm làm thời gian sản xuất dài nên bổ sung enzyme để tăng hiệu quả thủy phân và rút ngắn quá trình sản xuất Người ta sử dụng các enzyme protease trong công nghiệp hoặc bổ sung các nguyên liệu có chứa enzyme như đu đủ, dứa… Yêu cầu các nguồn nguyên liệu kết hợp phải có hàm lượng thủy phân protein cao, không làm ảnh hưởng tới thành phần, mùi vị của sản phẩm Tuy nhiên, phương pháp này chưa tạo thành mùi vị đặc trưng cho sản phẩm

Trong phạm vi đề tài, chúng tôi đề cập chi tiết tới phương pháp sản xuất nước tương truyền thống

2.3 Phương pháp sản xuất nước tương truyền thống

2.3.1 Quy trình sản xuất

Trong phương pháp thủ công, mốc được dùng trong sản xuất tương thường có sẵn trong tự nhiên Người ta nấu nếp rồi trải nếp ra nia, phủ lá nhãn, lá sen để bẫy mốc Mốc bẫy xong sẽ được trộn với đậu nành hấp chín và ủ tương từ 3 đến 6 tháng Quá trình bẫy mốc diễn ra khoảng 3 ngày, khối ủ có thể gồm nhiều loại nấm mốc Điển hình là

Aspergillus oryzae khi còn non có màu vàng hoa cau, khi già chuyển qua màu xanh lục

Nấm mốc này có vai trò quan trọng nhất trong sản xuất tương Đôi khi trong khối ủ cũng

xuất hiện màu vàng cam do Monilia sitofila; màu trắng, xám do Mucor mucedo, M rouxii, Rhizopus nigicans Tuy nhiên mốc màu cam và màu trắng thường không gây nguy hiểm cho sản phẩm Các mốc gây ảnh hưởng xấu cho quá trình làm tương thường là mốc màu đen Asp niger hay xanh rêu, xanh dương do Penicillium notatum, P expansum, Trichoderma lignorum Đặc biệt nguy hiểm là nấm Asp flavus vì nấm này cũng có màu

xanh lục như Asp oryzae nhưng lại sinh ra độc tố aflatoxin có khả năng gây bệnh ung

thư

Nhằm khắc phục hiện tượng tạp nhiễm và kiểm soát không để các loài nấm mốc có hại

bị nhiễm vào khối ủ, người ta đã sử dụng bột bào tử Asp oryzae để rắc vào khối ủ Việc

làm này dựa trên nguyên tắc về quy luật cạnh tranh, nghĩa là khi chủ động cấy một lượng

Asp oryzae vào khối nguyên liệu thì nấm mốc này sẽ phát triển chiếm ưu thế và lấn át các

loài khác phát triển Do đó sẽ giảm thiểu sự tạp nhiễm và sản phẩm sẽ có chất lượng tốt

hơn Hình 2.1 trình bày về sơ đồ quy trình sản xuất nước tương bằng việc cấy bào tử Asp oryzae trong quá trình nhân giống

Hình 2.1: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh

Đậu nành

Làm sach Ngâm Hấp

Phối chế gia vị

Lọc Thủy phân Làm tơi

Ủ mốc

Để nguội

Nước cốt

Nước tương

Trong quy trình này, đậu nành là nguyên liệu chính, đồng thời là nguồn protein và glucid cho quá trình thủy phân Sau khi được loại bỏ tạp chất, đậu nành được ngâm khoảng 8 – 12 giờ để hạt đậu được trương nở rồi đem đi hấp chín Để khối đậu nguội xuống khoảng 40oC, người ta tiến hành trộn mốc giống đã chuẩn bị từ trước vào Hỗn hợp mốc giống và bột mì đã rang chín vàng được trộn sao cho “áo” đều xung quanh từng hạt đậu Theo Nguyễn Đức Lượng, 2006 thì tỉ lệ mốc giống được trộn chiếm 0,5 – 1% so với toàn khối lượng đậu hấp Sau đó, đậu được trải đều ra khắp mặt nia với độ dày khoảng 1,5 – 2 cm Kết thúc quá trình quá trình ủ đậu khoảng 3 – 4 ngày, những hạt đậu đã lên mốc đều có màu xanh hoa lý sẽ được bóp rời Lượng đậu này sẽ được thêm nước muối có độ mặn từ 20 – 22% để thực hiện quá trình thủy phân Thời gian phân giải tối thiểu là 3 tháng rồi lọc dịch thủy phân để cho nước tương cốt Có thể bổ sung thêm nước muối để tiếp tục thủy phân hoặc vớt đậu nành làm tương hột Nước tương cốt có vị rất mặn nên cần phối chế gia vị như đường, nước, caramen…để thu được nước tương thành phẩm

2.3.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng trong sản xuất nước tương

2.3.2.1 Giới thiệu chung về Asp oryzae

Theo quy luật quốc tế về danh pháp, Aspergillus oryzae thuộc giống Aspergillus; họ

nấm bông Moniliaceae có hệ sợi không màu, màu nhạt hoặc sáng; bộ nấm bông Moniliales; lớp nấm khuyết hay nấm bất toàn Deuteromycetes không có sinh sản hữu tính, sinh sản vô tính bằng bào tử; ngành nấm (mycota); giới thực vật

Nó được nghiên cứu nhiều nhất vì liên quan đến nông nghiệp, y tế, lương thực thực phẩm (Lê Thị Ngọc Mai, 1993)

Mốc Asp oryzae thường gọi là nấm màu vàng hoa cau Khi mới phát triển, hệ sợi có

màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng, khi già chuyển hẳn sang màu lục Chúng có hệ bào tử đính (hình 2.1) Bào tử đính là bào tử được sinh ra từ bộ cuống đính bào tử ngoài cùng, phát triển từ thành tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang

5 – 7 μm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào (nấm đa bào) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính

bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Asp oryzae thường dài

1,0 – 2,0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính vào nhau, nên

gọi là đính bào tử Đính bào tử của Asp oryzae có màu vàng lục và đây cũng chính là màu ta thường thấy ở mốc tương Nấm mốc Asp flavus cũng là mốc vàng rất giống Asp oryzae chỉ khác là Asp flavus có kích thước nhỏ hơn (chiều cao của cuống sinh bào tử từ 0,4 – 1 mm so với Asp oryzae từ 1 – 2 mm) Mốc này có thể sinh ra độc tố aflatoxin gây

ung thư

Hình 2.2: Hình thái Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus

(Vương Thị Việt Hoa, 2006)

Nấm mốc Asp oryzae có khả năng sinh enzyme rất mạnh, chủ yếu là amylase,

invertase, maltose, protease, lipase, cellulase, các enzyme oxy hóa khử Chúng có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho tương có vị ngọt

2.3.2.2 Điều kiện sinh trưởng và phát triển

Aspergillus oryzae là chủng mốc ưa không khí, khi có đủ oxy thì nó phát triển rất

mạnh Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc này được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Điều kiện sinh trưởng của nấm Asp oryzae

(Nguyễn Đức Lượng, 2006) Nếu nuôi mốc làm giống thì cần nuôi trong khoảng thời gian 60 - 70 giờ bào tử mới hình thành đầy đủ Còn nếu nuôi mốc để có enzyme amilase thì thời gian tối đa là 40 giờ còn để có enzyme protease cần thời gian tối đa là 42 giờ (Nguyễn Thị Diệu Bích, 2007)

2.4 Sản xuất bột bào tử Asp oryzae trên môi trường bán rắn

Người ta thường nuôi Asp oryzae trên môi trường bán rắn cho việc sản xuất bột bào

tử Nấm mốc sau khi gieo cấy sẽ phát triển trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dưới theo các kẽ hở, các cấu tử thành phần môi trường Môi trường bán rắn thường dùng các nguyên liệu tự nhiên như bã đậu nành, bột bắp, cám mì, cám gạo, bột ngô, hạt kê… Ngoài

ra có thể bổ sung thêm trấu, rơm băm vụn, lõi ngô, mùn cưa…để làm cho môi trường tăng

độ thông thoáng Tuy nhiên, vì các phụ liệu cho thêm vào thường nghèo chất dinh dưỡng nên lượng cho thêm vào phải ở lượng giới hạn Để đảm bảo đủ các chất dinh dưỡng trong môi trường người ta có thể bổ sung các nguồn N, P, K hoặc các chất sinh trưởng như Mg… Để đảm bảo cho mốc mọc đều trên bề mặt môi trường, lớp môi trường bán rắn cần phải mỏng, chiều dày chỉ vào khoảng 2 - 5 cm (Phan Thị Hiền, 2009)

2.4.1 Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae

Hình 2.3: Quy trình sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus oryzae

2.4.2 Các nguyên liệu sử dụng để sản xuất bột bào tử trong đề tài

2.4.2.1 Bã đậu nành

Bã đậu nành là phụ phế phẩm của quá trình chế biến hạt đậu nành sống làm tàu hũ (đậu phụ) hoặc sữa đậu nành Thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành thể hiện trong bảng 2.2

Sấy khô Xay nhỏ

Phối trộn Hấp tiệt trùng

Để nguội Cấy giống Nuôi nấm

Nguyên liệu (bã đậu nành, cám

mì, cám bắp,…)

Aspergillus oryzae

Bột bào tử

Asp.oryzae

Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành

Thành phần Trong 1kg tươi Trong 1kg chất

(Đinh Văn Cải, 1975) Qua bảng 2.2 thấy rằng thành phần dinh dưỡng phụ thuộc hàm lượng nước còn lại trong bã Tính về tỉ lệ chất khô, protein chiếm 25,3% cao nhất, tiếp theo tỉ lệ chất xơ và tinh bột xấp xỉ nhau 20,7% và 20,1% Trong khi đó, lượng chất béo chỉ chiếm 13,2% Ngoài ra, trong bã đậu nành còn chứa 2 loại muối khoáng Ca và P với tỉ lệ đáng kể

2.4.2.2 Bắp mảnh (ngô mảnh)

Bắp mảnh là một loại nguyên liệu chứa nhiều glucid, protein, lipid và cả những nguyên tố khoáng cần thiết cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật, đặc biệt là nấm sợi Ưu điểm lớn nhất của ngô mảnh là loại vật liệu rời, tinh bột có trong ngô mảnh thường không tạo thành khối kết dính nên rất thuận lợi để làm môi trường bán rắn trong nuôi cấy bề mặt Thêm nữa, loại nguyên liệu này dễ mua, giá rẻ và có thể bảo quản được lâu (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Vì thế, bắp mảnh được sử dụng trong các quá trình nuôi cấy các nấm sợi

như Asp oryzae để tạo ra hai enzyme quan trọng protease và amylase ứng dụng trong sản

xuất nước tương theo phương pháp lên men tự nhiên

Bảng 2.3: Thành phần hóa học trung bình của bắp mảnh

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình sản xuất bột bào tử

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sản xuất bột bào tử như thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy…

 Độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc là 55 - 58% Độ ẩm môi trường thích hợp sự hình thành bào tử là khoảng 45% Cần giữ cho độ ẩm môi trưởng không bị giảm trong quá trình phát triển

 Độ ẩm tương đối của không khí từ 80% trở lên đến bão hòa đều thích hợp cho nấm mốc Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường không bị khô

 Ảnh hưởng của không khí: Asp oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát

triển bình thường khi đầy đủ oxy Để đáp ứng điều kiện nuôi này môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5 – 3cm, phòng nuôi phải thoáng

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành

enzyme của Asp oryzae khoảng 28 – 32oC Trong quá trình sinh trưởng, phát triển, nấm mốc cũng sinh nhiệt và tỏa nhiệt vào môi trường làm khối ủ có thể lên tới

40oC hoặc cao hơn Do đó, để đảm bảo quá trình nuôi cấy nấm mốc tốt cần giữ cho nhiệt độ môi trường không thấp hơn 27oC và không cao quá 36oC

 Thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng Asp oryzae có hoạt động cực đại của

amylase ở khoảng giờ thứ 30 – 36, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36 –

42 Một số chủng cho hai cực đại amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ 60 Thời gian nuôi mốc giống để thu bào tử thường hết 60 – 70 giờ

 pH thích hợp cho Asp oryzae là môi trường acid yếu 5,5 – 6,5 Các môi trường

nhân giống có thành phần chính từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh pH

 Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ