BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC CHỦNG TRICHODERMA SPP TỪ ĐẤT VƯỜN CACAO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHÚNG VỚI NẤM PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY THỐI QUẢ CACAO Ngành: CNSH – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực : LÊ NHẬT ĐĂNG MSSV: 1151110082 Lớp: 11DSH03 - TP Hồ Chí Minh, 2015 - LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết Đồ án trung thực Mọi thơng tin trích dẫn Đồ án ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng năm 2015 Sinh viên thực Lê Nhật Đăng LỜI CÁM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình ln bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo điều kiện để học tập hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hai – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Đại Học Công nghệ Tp HCM tạo điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo sát tiến trình thí nghiệm Tơi học nhiều điều hay cô kiến thức chuyên mơn lòng nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm cơng việc, tình u thương người Cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành phụ trách phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện thiết bị thí nghiệm thuận lợi cho tơi hồn thành tốt đẹp Đồ án Xin cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm Môi trường giảng dạy truyền đạt cho kiến thức quan trọng tạo tảng kiến thức vững để hoàn thành tốt Đồ án sau ứng dụng vào công việc thực tiễn Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hoàn thành tốt khóa học 2010 – 2014 Và cuối tơi gửi lời cảm ơn đến bạn làm khóa, anh chị khóa 10, em khóa 12 giúp tơi hồn thành đồ án trao đổi kinh nghiệm làm việc trình làm đồ án Tp HCM, Ngày 10 tháng năm 2015 Sinh viên thực Lê Nhật Đăng Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cacao 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái .4 1.1.3 Đặc điểm sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học trái cacao .6 1.1.5 Tình hình trồng sản xuất cacao Việt Nam 1.1.6 Dịch hại cacao 1.1.6.1 Côn trùng gây hại 1.1.6.2 Bệnh hại cacao 10 1.2 Giới thiệu nấm Phytophthora 12 1.2.1 Vòng đời nấm phytophthora 14 1.2.2 Đặc điểm hình thái giống Phytophthora 14 1.2.3 Đặc tính chung nhóm nấm Phytophthora spp 15 1.2.4 Khả gây bệnh Phytophthora thực vật 16 1.2.5 Bệnh thối gây hại cacao 22 1.2.5.1 Thời gian xuất nguồn lây bệnh 22 1.2.5.2 Triệu chứng bệnh 23 - -4 i- - Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.3 Thiệt hại bệnh gây 23 1.2.5.4 Các nghiên cứu bệnh thối trái cacao 24 1.2.5.5 Một số phương pháp phòng ngừa bệnh thối trái cacao 24 1.3 Giới thiệu nấm Trichoderma 26 1.3.1 Phân loại: 26 1.3.2 Lịch sử nghiên cứu Trichoderma 26 1.3.3 Cấu tạo tế bào Tricoderma spp 27 1.3.4 Đặc điểm sinh học phân bố nấm Trichoderma spp 27 1.3.5 Đặc điểm hình thái nấm Tricoderma spp 29 1.3.6 Cơ chế đối kháng vai trò nấm Trichoderma đất 29 1.3.6.1 Cơ chế 29 1.3.6.2 Nấm Trichoderma spp phòng trừ sinh học bệnh hại trồng 31 1.3.6.3 Khả phân hủy chất hữu nấm Trichoderma spp 32 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.2 Vật liệu 33 2.1.1 Nguồn mẫu phân lập 33 2.1.1.1 Nguồn mẫu phân lập nấm bệnh 33 2.1.1.2 Nguồn phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp 33 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 33 2.2.4 Hóa chất 34 2.2.5 Các loại môi trường 35 2.4 Phương pháp nghiên cứu 37 - -5 i- - Đồ án tốt nghiệp 2.4.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thối trái cacao 37 - -6 i- - Đồ án tốt nghiệp 2.4.1.1 Phân lập từ mẫu trái cacao nhiễm bệnh thối trái 37 2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 38 2.4.3.1 Quan sát đại thể nấm sợi 38 2.4.3.2 Quan sát vi thể nấm 38 2.4.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch 39 2.4.2 Phương pháp phân lập nấm đối kháng Trichoderma spp 41 2.4.2.1 Các bước thu mẫu 41 2.4.2.2 Các bước phân lập 41 2.4.2.3 Cấy truyền làm mẫu nấm Trichoderma 42 2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 42 2.4.3.1 Quan sát đại thể nấm sợi 42 2.4.3.2 Quan sát vi thể nấm 43 2.4.5 Định tính khả sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng cacao 43 2.4.6 Khảo sát khả chịu mặn chủng nấm Trichoderma spp 44 2.4.6 Khảo sát tính đối kháng chủng nấm Trichoderma spp với chủng nấm bệnh Phytophthora palmivora điều kiện in vitro 44 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 46 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Phân lập nấm Phytophthora palmivora trái cacao 47 3.1.1 Kết phân lập nấm Phytophthora palmivora 47 3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm bệnh 47 3.1.3 Kết lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch điều kiện in vitro 49 -3- Đồ án tốt nghiệp 3.2 Kết phân lập số chủng nấm Trichoderma từ đất trồng cacao 51 -4- Đồ án tốt nghiệp 3.2.1 Kết phân lập Trichoderma từ đất trồng cacao 51 3.2.2 Kết quan sát hình thái sợi nấm 51 3.2.2.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc1 51 3.2.2.2 Đặc điểm hỉnh thái chủng nấm Tcc2 52 3.2.2.3 Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc3 53 3.2.2.4 Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc4 55 3.2.2.5 Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc5 56 3.2.2.6 Đặc điểm hình thái chủng nấm Tcc6 57 3.3 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào (chitinase cellulose) chủng Trichoderma phân lập từ đất vườn cacao 58 3.3.1 Kết khảo sát khả sinh enzyme chitinase ngoại bào 58 3.3.2 Kết khảo sát khả sinh enzyme cellulase ngoại bào 59 3.4 Khảo sát khả chịu mặn chủng Trichoderma phân lập 60 3.5 Khả đối kháng chủng nấm Trichoderma phân lập với nấm Phytophthora palmivora 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 4.1 Kết luận 70 4.2 Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 71 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 72 TÀI LIỆU INTERNET 74 -5- Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT -  CMC: Carboxymethyl cellulose ĐC: Đối chứng MSM: Minimal Synthetic Medium PDA: Potato D-Glucose Agar TN: Thí nghiệm VSV: Vi sinh vật NSC: Ngày sau cấy CMA: Cornmeal agar -6- Hình 23 : Biểu nấm Trichoderma nấm P.palmivora sau ngày đối kháng trực tiếp đĩa petri Hình 24: Biểu nấm Trichoderma nấm P.palmivora sau ngày đối kháng trực tiếp đĩa petri Hình 25: Biểu nấm Trichoderma nấm P.palmivora sau 11 ngày đối kháng trực tiếp đĩa petri Trichoderma Phytophthora palmivora Hình 26: Hiện tương giao thoa sợi nấm Trichoderma nấm Phytophthora palmivora (hình chụp kính hiển vi với độ phóng đại x100) Kết đối kháng nấm Phytophthora palmivora chủng Trichoderma trình bày bảng 3.5 3.6 cho thấy, tất chủng kháng với nấm Phytophthora palmivora Trong đó, chủng chủng Tcc4 cho hiệu đối kháng điều kiện in vitro Điều hòan tồn phù hợp với kết đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm Chủng nấm Tcc4 có khả sinh enzyme ngoại bào chitinase cellulase cao Vì nấm Phytophthora palmivora có cấu tạo vách tế bào cellulase nên chủng nấm đối kháng phải có hoạt tính enzyme cellulase chủng Tcc4 đáp ứng điều Bốn chủng Tcc1, Tcc3, Tcc5 Tcc6 có triển vọng việc phòng ngừa nấm Phytophthora palmivora với tỷ lệ đối kháng 94,06%, 93,09%, 99,08% 96,87% thời điểm 11 NSC Như với kết này, khẳng định chủng Trichoderma ký hiệu Tcc1, Tcc3, Tcc4, Tcc5, Tcc6 có khả đối kháng tốt với nấm Phytophthora palmivora Đây tiền đề để thực nghiên cứu hiệu phòng trừ nấm bệnh Phytophthora palmivora điều kiện in vivo sản xuất chế phẩm thử nghiệm đồng Riêng trường hợp chủng Tcc2, khả đối kháng không tốt với nấm Phytophthora palmivora, sinh viên khuyến cáo khơng sử dụng chủng nấm việc sản xuất chế phẩm Trichoderma nhằm mục đích ngăn chặn tiêu diệt nấm Phytophthora palmivora gây hại cacao cần đánh giá hiệu sử dụng chúng khía cạnh khác Như vậy: chủng Trichoderma ý hiệu Tcc1, Tcc3, Tcc4, Tcc5, Tcc6 có khả đối kháng tốt với nấm bệnh gây bệnh thối cacao nấm Phytophthora palmivora sinh viên bổ sung vào sưu tập nấm Trichoderma trường Hutech để làm nguồn giống cho đề tài 4.1 Kết luận CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - Đã phân lập chủng nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối cacao - Đã phân lập chủng nấm Trichoderma từ đất cacao Bến Tre ký hiệu Tcc1, Tcc2, Tcc3, Tcc4, Tcc5, Tcc6 Các chủng có khả sinh enzyme chitinase cellulase tốt - Các chủng Trichoderma phân lập sinh trưởng, phát triển nồng độ muối từ 0,5 đến 4% bị ức chế mạnh nồng độ muối 8% - Trong điều kiện invitro, chủng Tcc1, Tcc2, Tcc3, Tcc4, Tcc5, Tcc6 đối kháng với nấm Phytophthora palmivora Trong đó, mạnh chủng Tcc4 yếu chủng Tcc2 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát khả đối kháng chủng Trichoderma với nấm bệnh khác như: Pythium, Fusarium, Rhizoctonia - Đánh giá khả đối kháng nấm Phytophthora palmivora điều kiện invivo chủng có triển vọng sớm đưa chủng vào sản xuất chế phẩm để ứng dụng sản xuất nông nghiệp, đặc biệt sản xuất cacao - Định danh chủng nấm Trichoderma - Bổ sung chủng vào sưu tập phòng thí nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đơn, Nguyễn Tiến Thắng, Ngơ Kế Sương (2007) Khảo sát hoạt tính enzym chitinase, β-glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease chủng Trichoderma phân lập Việt Nam, Hội nghị khoa học toàn quốc "Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống", NXB Khoa học Kỹ thuật, trang 708-710 Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008) Khảo sát khả đối kháng in vitro chủng nấm Trichoderma loài nấm gây bệnh trồng (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophthora palmivora), Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 46, số 4A, trang 93-99 Đào Thị Lan Hoa ctv, 2012 Phòng trừ bệnh thối nấm Phytopthora palmivora gây hại cacao Buôn Ma Thuộc, Dak Lak Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Tây Nguyên, trang Lâm Thanh Hiền (1999), Chương 3: Hình thái vi sinh vật có nhân thật (Eukaryote) Vi sinh vật học đại cương Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, trang 59 – 61 Lê Cao Lượng, 2014 Giới thiệu vê sâu bệnh hại cacao: Phytophthora palmivora cacao Chương trình PPP 74 trang Nguyễn Đức Lượng (2006) Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học: Thí nghiệm vi sinh vật học, Tập 2, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Phạm Hơng Đức Phước, 2004, Kỹ thuật trồng cacao Việt Nam Dự án Success Alliance 140 trang Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Phương Chi (2003) Khả chịu muối số chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan Tạp chí Sinh học P.19-24 Phạm Trí Thơng, 1999 Bảo quản – Chế biến cacao Tủ sách đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh, 49 trang 10 Tô Duy Khương (2007) Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật, Luận văn thạc sĩ sinh học chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Agrios G.N (2005) Plant pathology, 5th edition, Elsevier Academic Press: San Diego, California Alexander M 1961 Microbial Ecology Pages 207 – 233 John Wiley & sons New York and London André Drenth and Barbara Sendall, 2001 Practical guide to detection and identification of Phytophthora P 12 – 39 André Drenth and David I Guest, 2004 Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia Australian Centre for International Agricultural Research 94-99 Bourke, P.M 1964 Emergence of potato blight Nature 203:805-808 Bowers, J.H., Bailey, B.A., Hebbar, P.K., Sanogo, S and Lumsden, R.D 2001 The impact of plant diseases on world chocolate production The American Phytopathology Society [accessed 22 June 2001] Brasier, P.M 1983 Problems and prospects in Phytophthora research In: Erwin, D.C., Bartnicki-Garcia, S and Tsao, P.H Phytophthora: its biology, taxonomy, ecology and pathology St Paul, Minnesota, USA, American Phytopathological Society Campbell, W.A 1949 A method of isolating Phytophthora cinnamomi directly from the soil Plant Disease Reporter, 33, 134 – 135 Canten C,E and Jinks, Spontanneous variability of single isolate of Phytophthora spp., Culture variation Canadian Journal of Botany, 46, P 329 – 348 10 Christian P Kubicek and Gary E Harman (Ed) (1992) Trichoderma & Gliocladium, Volume1, Basicliology, Taxonomy and genetics 11 Cook R.J., and Baker K F 1983 The Nature and Practice of Biological Coltrol of plant Pathogens American Phythopathological Society, St Paul, MN 539 pp 12 Cruz J D L, Pintor-Toro J A., T Benitez and A Llobell 1995 Purification and characterization of an Endo-b-1,6-Glucanase from Trichoderma harzianum that is related to its mycoparasitism In journal of bacteriology American Society for Microbiology 17(7): 1864 – 1871 13 Dennis C and J Webster 1971a Antagonistic properties of species- groups of Trichoderma (I.Production of non-volatile antibiotics) Transactions of the British Mycological Society, 57:25-39 14 Dennis C and J Webster 1971b Antagonistic properties of species groups of Trichoderma (II.Production of volatile antibiotics Transactions of the British Mycological Society, 57(1): 41-48 15 Drenth, A 1994 Molecular genetic evidence for a new sexually reproducing population of Phytophthora infestans in Europe PhD Thesis, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands 16 Erwin D C and O.K Ribeiro (1986) Phytophthora Diseases Wordwide The American Pathological Society APS Press.st.nl.p 346 – 349 17 F.Hardy, 1960 Cacao manual American Institute of Agricultural P.147-175 18 Gary J Samuels (2004) Trichoderma aguide to identification and biology, United States Department of Agriculture Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA 19 Harman G E., et al (2004) Trichoderma species opportunistic, avirulent plant symbionts Nat Rev Microbiol, 2(1): p 43-56 20 Hartman, G,L and Huang, Y.H (1995), Characterrization of Phytophthora infestans isolates and development of late blight on tomato in Tawain, Plant disease, vol 79, P 849-852 21 Hawksworth, D L., Kirk P M., Sutton B C., and Pegler D N 1995 - 73 - Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi 8th ed Wallingford, UK: - 74 - CAB International 22 Iwao Hachiya , 2003 Discourse on a history of chocolate: culture and sciencr (part 1) Foods food ingredients J Ipn Vol.208.No.3.2003 23 Joshi, C.P., and Mansfield, S.D (2007) Thecellulose paradox – Simple molecule, complex biosynthesis Curr Opin Plant Biol 10: 220–226 24 Klein D & Eveleigh D E 1998 Ecology of Trichoderma in Trichoderma & Gliocladium Volume (Edited by Kabicek Christian P & Harman Gary E) Taylor & Francis 25 Kredics L Z., Antal L., Manczinger A., Szekres F., Kevei and E Nagy 2003 Influence of environmental parameter on Trichoderma Strains with biocontrol potential Food Technol Biotechnol 41(1) 37 – 42 26 Papavizas, G.C., J.H Bowers, and S.A Johnston 1981 Selective isolation of Phytophthora capsici from soils Phytopathology 71:129-133 27 Siu-Wai Chiu and David Moore (2001) Deciphering Fungal Morphogenesis P.45-60 28 Stevenson B (1993), Re – emergence of potato and tomato late blight in the US Plant disease, vol 81, P.1349 – 1357 TÀI LIỆU INTERNET Ban diều phối cacao Việt Nam – VCC: http://cacao.khuyennongvn.gov.vn/news/tID157_-Ban-dieu-phoi-cacao.html Phòng trừ bệnh hại cacao Sở Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn tỉnh Bến Tre http://www.sonongnghiep.bentre.gov.vn/index.php/trongtrot/124-ca-cao/648phong-tr-sau-bnh-hi-ca-cao Quy trình phòng ngừa bệnh thối đen trái cacao Trung tâm Khuyến nông quốc gia - 75 - http://www.khuyennongvn.gov.vn/vi-VN/khoa-hoc-cong-nghe/khcn-trongnuoc/quy-trinh-phong-tru-tong-hop-benh-thoi-den-qua-cacao_t114c40n12165 - 76 - Tiến sĩ Phạm Hồng Đức Phước, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh http://phdphuoc.com/blog/2013/08/30/sau-benh-hai-ca-cao/ Trichoderma Home http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm Trung tâm khí tượng thủy văn, Sở Tài nguyên Môi trường tỉnh Bến Tre http://www.sotnmt- bentre.gov.vn/index.php? cires=News&in=viewcat&catid=6 Wikipedia: Nấm Phythopthora spp https://en.wikipedia.org/wiki/Phytophthora Wikipedia: Nấm Trichoderma spp https://en.wikipedia.org/wiki/Trichoderma Tình hình sâu bệnh gây hại cacao tỉnh Bến Tre Sở Khoa học – Công nghệ tinh Bến Tre http://www.khuyennongvn.gov.vn/vi-VN/khoa-hoc-cong-nghe/khcn-trongnuoc/quy-trinh-phong-tru-tong-hop-benh-thoi-den-qua-cacao_t114c40n12165 - 77 - Đồ án tốt nghiệp - 76 - ... chitinase) chủng nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng cacao 43 2.4.6 Khảo sát khả chịu mặn chủng nấm Trichoderma spp 44 2.4.6 Khảo sát tính đối kháng chủng nấm Trichoderma spp với chủng nấm bệnh... Phân lập nấm Phytopthora palmivora gây bệnh thối trái ca cao - Phân lập chủng nấm Trichoderma đất trồng cacao - Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào khả đối kháng nấm Phytopthora sp chủng nấm Trichoderma. .. đất vườn cacao đánh giá khả đối kháng chúng với nấm Phytophthora palmivora gây thối cacao Mục đích nghiên cứu đề tài: Tìm chủng nấm Trichoderma spp có hiệu khống chế nấm Phytopthora palmivora gây