LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Chu Hồng Hà tận tình hướng dẫn tơi thực luận văn Tơi xin cảm ơn: Phòng Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa SinhKTNN, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường ĐHSP Hà Nội 2; Lãnh đạo Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS La Việt Hồnggiảng viên trường ĐHSP Hà Nội 2; TS Phạm Bích Ngọc, Th.S Hồng Đăng Hiếu - phòng Cơng nghệ tế bào thực vật tận tình bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Xin cảm ơn sinh viên Nguyễn Nguyệt Quỳnh giúp đỡ tơi suốt q trình làm thí nghiệm Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường ĐHSP Hà Nội Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè, người động viên, giúp đỡ thời gian học tập nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 11 năm 2016 Học viên Đào Văn Kiên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Long tu kỹ thuật ni cấy in vitro” cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Những số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, tháng 11 năm 2016 Tác giả Đào Văn Kiên MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi lan Dendrobium 1.1.1 Hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố vùng sinh thái 1.1.4 Giá trị lan Dendrobium 11 1.2 Tình hình nghiên cứu hoa lan giới Việt Nam 13 1.3 Nhân giống in vitro 14 1.3.1 Cơ sở khoa học nhân giống in vitro 14 1.3.2 Ý nghĩa nhân giống in vitro 15 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro 17 1.3.5 Quy trình sản xuất cấy mô 22 1.3.6 Thành tựu nuôi cấy mô giới Việt Nam 24 1.4 Ứng dụng DNA barcode vào việc xác định loài 25 1.4.1 Giới thiệu DNA barcode 25 1.4.2 Các đặc điểm trình tự barcode 26 1.4.3 Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật 27 1.4.4 Tình hình nghiên cứu DNA barcode thực vật 30 Chương VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu 32 2.2 Dụng cụ hóa chất 32 2.3 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Nhận dạng loài Dendrobium sp kỹ thuật DNA Barcode 32 2.3.2 Nhân giống lan Dendrobium sp kỹ thuật nuôi cấy mô 33 2.3.3 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 36 2.3.4 Phương pháp phân tích thống kê 36 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 Kết nhận dạng loài thị DNA 37 3.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số 37 3.1.2 Kết nhận dạng lồi dựa trình tự trnL, matK ITS 38 3.2 Kết nghiên cứu nhân giống in vitro 42 3.2.1 Nhân nhanh protocorm tạo chồi từ protocorm 42 3.2.2 Nhân chồi 46 3.2.3 Tạo rễ - hình thành 50 3.2.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism BAP Benzyl aminopurin bp Base pair CT Công thức CTAB Cetyltrimethyl ammoium bromide ĐC Đối chứng DNA Desoxyribo nucleic acid GA3 Giberellic acid IAA Indol acetic acid ITS Internal transcribed spacer KIN Kinetin KTNN Kỹ thuật nông nghiệp matK Gen mã hóa Maturase K MS Murashige and Skoog NAA Naphthaleneacetic acid NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid SSR Simple Sequence Repeates DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin mồi sử dụng nghiên cứu 33 Bảng 3.1 Hệ số tương đồng mẫu nghiên cứu lồi cơng bố ngân hàng Genbank dựa thị trnL 38 Bảng 3.2 Hệ số tương đồng mẫu nghiên cứu lồi cơng bố ngân hàng Genbank dựa thị matK 39 Bảng 3.3 Hệ số tương đồng mẫu nghiên cứu lồi cơng bố ngân hàng Genbank dựa thị ITS 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kinetin đến khả nhân nhanh protocorm loài D transparens 43 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nước dừa đến khả tạo chồi từ protocorm D transparens 44 Bảng 3.6 Ảnh hưởng KIN lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy 47 Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP lên khả nhân chồi lan Long tu sau tuần nuôi cấy 48 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy .49 Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro lan Long tu sau tuần nuôi cấy 51 Bảng 3.10 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số lồi Phong lan thuộc chi Dendrobium 12 Hình 3.1 Điện di kiểm tra 37 Hình 3.2 Cây phân loại dựa thị trnL mẫu lan nghiên cứu (TTP11) với lồi cơng bố Genbank 39 Hình 3.3 Cây phân loại dựa thị matK mẫu lan nghiên cứu (TTP9) với lồi cơng bố Genbank 40 Hình 3.4 Cây phân loại dựa thị ITS mẫu lan nghiên cứu (TTP12) với lồi cơng bố Genbank 41 Hình 3.5 Protocorm phát sinh từ protocorm D transparens 44 Hình 3.6 Chồi phát sinh từ protocorm D transparens môi trường MS +10% ND 45 Hình 3.7 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trường MS + 0,5 mg/l KIN 47 Hình 3.8 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trường MS (a) + 2,0 mg/l BAP, (b) + 0,5 mg/l BAP 49 Hình 3.9 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trường MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA 50 Hình 3.10 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 51 Hình 3.11 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 53 Hình 3.12 D transparens in vitro rèn luyện ngồi tự nhiên 54 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Từ xưa tới nay, Phong lan biết đến thứ hoa đại diện cho cao quý Hoa Phong lan vô đa dạng chủng loại, loài mang vẻ đẹp khác nhau, mn hình vạn sắc tất chúng ánh lên vẻ đẹp sáng, vẻ đẹp hồn hảo, tinh tế vơ cao Từ lồi Phong lan ẩn tán rừng, giò Phong lan treo vách núi đá cao vời vợi mang đến thở núi rừng hoang dại, vẻ mộc mạc hoang sơ lại gần gũi thiết tha Đối với người chơi Phong lan tâm hồn thú chơi tao nhã lành mạnh, khiến tâm trạng người thư thái, hay đơn giản ta bắt gặp nơi đâu cần không gian đẹp sang trọng, có xuất hoa Phong lan [14] Ngoài giá trị vẻ đẹp thẩm mỹ, Phong lan biết đến vị thuốc Đông y phổ biến nhiều thuốc chữa bệnh Có thể kể đến như: Phong lan Thạch hộc có tác dụng chữa ho, đầy hơi, gầy còm [10]; Phong lan Kim tuyến coi “vua thuốc” “cỏ vàng” thường sử dụng điều trị bệnh tiểu đường, cao huyết áp, bệnh tim, viêm phổi, viêm gan cấp mãn tính, viêm thận bệnh khác Với giá trị vậy, Phong lan hứa hẹn mang lại nguồn doanh thu khổng lồ cho ngành sản xuất, kinh doanh loại mặt hàng Cùng với phát triển ngành trồng lan thời gian qua, loài hoa quý không làm giàu cho người nông dân mà làm đẹp hình ảnh Việt Nam mắt du khách quốc tế Trong loài Phong lan mang lại giá trị kinh tế cao nước ta kể đến lồi thuộc chi Dendrobium, chi thực vật phổ biến giới, chi có khoảng 1200-1500 loài phân bố rộng khắp Châu Á, Bắc Australia New Zealand Các loài thuộc chi sinh trưởng nhanh, dễ dàng tái sinh hệ mới, hoa đẹp, hoa quanh năm [19] Ngoài giá trị thương mại, số lồi lan thuộc chi Dendrobium thành phần thuốc truyền thống Trung Quốc Ấn Độ [48] Cũng lợi ích to lớn mà Phong lan nói chung, lồi Phong lan thuộc chi Dendrobium nói riêng mang lại làm cho loài hoa tự nhiên bị người săn lùng khai thác cách triệt để, nhiều giống Phong lan rừng quý đến gần nguy tuyệt chủng Trong tự nhiên, loài lan sinh trưởng chậm, tái sinh chủ yếu hạt Tuy nhiên, khả nảy mầm tự nhiên hạt lan thấp Do đó, phục hồi quần thể lan rừng tự nhiên khó [6], [7] Đứng trước thực trạng này, việc nhân giống cung cấp cho sản xuất bảo tồn vốn gen loài lan quý trở nên cấp thiết Để giải vấn đề này, việc áp dụng nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mơ giải pháp hữu ích, phương pháp nhằm cung cấp số lượng lớn lan giống bệnh thời gian ngắn cho nghiên cứu sản xuất Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trải qua trăm năm hình thành phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người Hiện nay, hầu hết sở nghiên cứu giống trồng giới áp dụng cơng nghệ với mục đích khác Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu nghiên cứu ứng dụng từ năm 70 kỷ XX Trong bước đầu nghiên cứu ứng dụng đạt kết khả quan số đối tượng trồng chuối, khoai tây, mía, lúa…, đặc biệt Phong lan Trong trình nghiên cứu nhân giống Phong lan, đặc biệt áp dụng phương pháp ni cấy mơ tế bào việc xác định rõ nguồn gốc lồi nghiên cứu ni cấy việc làm quan trọng nhầm lẫn định hướng áp dụng sai kỹ thuật nuôi cấy kết cuối khơng nhân giống lồi Phong lan mong muốn Việc phân loại loài chi Dendrobium thường khó khăn chúng có đặc điểm quan sinh dưỡng tương đồng, số lượng loài chi lớn, nhiều đặc điểm hình thái lồi chồng lấn Trong năm gần đây, với đời nghiên cứu hệ thống học phân tử , nhiều phương pháp phân tích cho kết nhanh xác Để phân loại sinh vật, phương pháp phân loại truyền thống chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái Hiện nay, cơng cụ phân tử dựa trình tự DNA phân đoạn gen chuẩn hay gọi DNA barcode phát triển mạnh mẽ để phân loại sinh vật mức độ lồi [18] Nhằm mục đích nhận dạng lồi Phong lan có tên địa phương Long tu (Dendrobium sp.) tiến hành nhân giống in vitro loài Phong lan tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Long tu kỹ thuật nuôi cấy in vitro” Cơng trình thực Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Nhận dạng mẫu lan Long tu nghiên cứu kỹ thuật DNA Barcording - Xác định nồng độ Kinetin (KIN) bổ sung vào môi trường ni cấy MS có ảnh hưởng tốt đến khả nhân nhanh protocorm lan Long tu - Xác định tỉ lệ thể tích nước dừa bổ sung vào mơi trường ni cấy MS có ảnh hưởng tốt đến khả tạo chồi từ protocorm lan Long tu - Xác định nồng độ KIN, BAP tổ hợp BAP kết hợp NAA bổ sung loại vào mơi trường ni cấy MS có ảnh hưởng tốt đến khả nhân chồi in vitro lan Long tu 54 trồng giá thể xơ dừa miếng cắt nhỏ 1:1:1:1 Theo dõi sinh trưởng phát triển lan Long tu tuần sau in vitro Kết sau tuần bắt đầu hình thành rễ mới, tạo thêm chồi mới, tỉ lệ sống cao, đạt xấp xỉ 85% (Hình 3.12) Hình 3.12 D transparens in vitro rèn luyện tự nhiên (a,b) D transparens tuần tuổi, (c,d) D transparens tuần tuổi 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sử dụng kỹ thuật DNA Barcode với thị ITS, matK trnL xác định mẫu lan thu Trạm Đa dạng Sinh học Mê Linh loài Dendrobium transparens Wall ex Lindl Hồn thiện quy trình nhân giống in vitro lan Dendrobium transparens Wall ex Lindl.: - Môi trường MS, 30g sacharose 8g/l agar có bổ sung 0,3-0,5 mg/l Kinetin thích hợp cho q trình nhân nhanh protocorm - Mơi trường MS, 30g saccharose 8g/l agar có bổ sung 10% nước dừa (ND) thích hợp để tạo chồi in vitro từ protocorm - Môi trường MS, 30g saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro với hệ số nhân cao 6,33 sau tuần nuôi cấy - Môi trường MS, 30g saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,3 mg/l IAA môi trường tạo rễ tốt (số rễ/chồi 4,80; chiều dài rễ: 2,07cm) sau tuần - Cây rèn luyện trồng giá thể xơ dừa cho tỷ lệ sống sót cao (85%) Kiến nghị Tiếp tục chăm sóc lan Long tu vườn ươm đến giai đoạn hoa tiến hành nghiên cứu nhận dạng loài lan thơng qua đặc điểm hình thái Tiếp tục nghiên cứu rèn luyện lan Long tu sau giai đoạn in vitro loại giá thể khác để tìm loại giá thể tối ưu, cho tỷ lệ sống sót cao Dựa kết nhận dạng loài sử dụng kỹ thuật DNA Barcode kết hợp với hình thái gọi tên xác lồi lan nghiên cứu Trạm Đa dạng sinh học Mê Linh, để tránh nhầm lẫn nghiên cứu nhân giống sau CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Tên báo gửi Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Nghiên cứu quy trình nhân nhanh Dendrobium sp kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật 1,* 1,2 La Việt Hồng , Nguyễn Nguyệt Quỳnh , Đào Văn Kiên , Phạm Bích Ngọc , Chu Hồng Hà Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Thiên Ân (2002), Những Phương pháp trồng lan, Nhà xuất Mỹ Thuật Tp HCM Hoàng Thị Bé (2004), Atlas khuẩn lam, nấm-thực vật, Nhà xuất Đại học Sư phạm, Hà nội Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung Bùi Xuân Chương (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, tr 357-387 Lê Thị Kim Đào (2001), “Nghiên cứu thử nghiệm nhân số giống trồng rừng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn, Thông, Giổi xanh, Trầm hương)”, Tạp chí sinh học , 23, (3), tr.46-50 Nguyễn Văn Đính, La Việt Hồng (2015), Sinh trưởng phát triển thực vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam NXB Trẻ,Tp HCM Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Dương Đức Huyến (2007), Thực vật chí Việt Nam-Flora of VietNam, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, Hà Nội Dương Công Kiên (2006), Nuôi cấy mô tập 3, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TPHCM 10 Đỗ Tất Lợi (2015), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y dược, Hà Nội 11 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội 12 Nguyễn Công Nghiệp (2004), Trồng hoa lan, Nhà xuất Trẻ TPHCM 13 Ngô Thị Nguyệt, Tô Phương Thảo cs, (2013) Thu thập lưu trữ nguồn gen ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển số loài lan quý Quảng Ninh Trung tâm khoa học sản xuất Lâm Nông nghiệp Quảng Ninh 14 Trần Duy Quý (2005), Sổ tay người Hà Nội chơi lan, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 15 Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên tăng trưởng số thân gỗ nhiệt đới cận nhiệt đới điều kiện nuôi cấy in vitro ”, Hội nghị tổng kết NCCB KHTN , tr 42-44 16 Nguyễn Văn Song, Phan Hùng Vĩnh, Trương Thị Bích Phượng 2011 Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)- lồi lan rừng có nguy tuyệt chủng Tạp chí khoa học, Đại học Huế Số 64: 127-136 17 Nguyễn Bảo Tồn 2004 Ni cấy mơ tế bào thực vật Nhà xuất Đại học Cần Thơ Trang 28-32 18 Vũ Huyền Trang, Chu Hoàng Hà, Hoàng Đăng Hiếu, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân 2013 Nghiên cứu sử dụng thị DNA mã vạch nhận dạng loài lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11 Trang: 121-128 Tài liệu tiếng Anh 19 Adams P 2011 Systematics of Dendrobiinae (Orchidaceae), with special reference to Australian taxa Botanical Journal of the Linnean Society 166: 105-126 20 Averyanow L.V (2004), “Dendrobium tuanahii Aver Orchid” American Orchid Scoiety, pp 134-136 21 Babu K.N, Sajina A, Minoo D, John C.Z, Mini P.M, Tushar K.V, Rema J, Ravindran P.N 2003 Micropropagation of camphor tree (Cinnamomum camphora) Plant Cell Tiss Org Cult 74: 179-183 22 Bhojwani S.S and M.K Razdan (1996), Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition, Elsevier Science B.V The Netherlands tr.113 23 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 24 Cai X.Y., Feng Z.Y., Hou B.W., Xing WR (2012), “Development of microsatellite markers for genetic diversity analysis of Dendrobium loddigesii Rolfe, an endangered orchid in China”, Biochem Syst Ecol 142 (43), pp 42-47 25 CBOL Plant WorkingGroup 2009 A DNA barcode for land plants Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106: 12794–12797 doi:10.1073/pnas.0905845106 PMID:19666622 26 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 27 Chase M.W, Cowan R.S, Hollingsworth P.M, et al 2007 A proposal for a standard protocol to barcode all land plants Taxon 56 tr 295-299 28 Dearnaley JDW 2007 Further advances in orchid mycorrhizal research Mycorrhiza 17:475-486 29 Domyati, F.M., Tounis, R.A.A., Edris S., Mansour A., Sabir J., and Bahieldin A (2011), “ Molecular markers associated with genetic 60 diversity of some medicinal plant in Sinai”, Journal of Medicinal Plants Research, (5), pp 1918-1929 30 Dressler R.L (1993), “Phylogeny and classification of the orchid family, Dioscorides”, Press, p 314 31 Dressler, R L (1981), The orchids: natural history and classification, Harvard University Press, Cambridge 32 Fangmuang W, Kongbangkerd A 2012 Effect of plant growth regulators on development of in vitro shoot culture of Dendrobium lamellatum Lindl Phayao research conference 96 - 102 33 Fazekas AJ, Kuzmina ML, Newmaster SG, Hollingsworth PM 2012 DNA barcoding methods for land plants In: Kress JW, EricksonDL(eds) DNA barcodes: methods and protocols Methods Mol Biol 858:223-252 doi:10.1007/978-1-61779-591-6_11 34 Feng S., Zhao H., Lu J., Liu J., Shen B., and Wang H (2013), “Preliminary genetic linkage maps of Chinese herb Dendrobium nobile and D moniliforme”, J Genet, 92(2), pp.205-212 35 Gaspar T, Kevers C, Penel C, Greppin H, Reid D.M, Thrope T.A 1996 Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture In vitro Cell Dev Biol Plant 32:272-289 36 George E.F and P.D Sherrington (1993), Plant Propagation by Tissue Culture, Exegetics Ltd., Eversley, England, pp 324-366 37 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 38 Kress W.J, Erickson DL (2007) A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnH-psbA Spacer Region, Plos One 2(6) 39 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH 2005b Use of DNA barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci 61 USA 102(23):8369–8374 40 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH 2005a Use of DNA barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci USA 102:8369-8374 41 Lau D.T.W., Shaw, P.C., Wang J., and But P.P.H (2001), “Authentication of Medicinal Dendrobium Species by the Internal Transcribed Spacer of Ribosomal DNA”, Planta Medica (67), pp.456460 42 Leitch I J., Kahandawala I., Suda J., Hanson L., Ingrouille M.J., Chase, M.W., and Fay M.F (2009), “Genome size diversity in orchids: consequences and evolution”, Annals of Botany, (104), pp 469-481 43 McKendrick S 2000 In vitro germination of orchids: amanual Ceiba Foundation for Tropical Conservation.1-17 44 Molnar Z., Virag E and Ordog V 2011 Natural substances in tissue culture media of higher plants Acta Biologica Szegediensis 55 (1): 123127 45 Molvray M P., J Kores M., and Chase W (2000), “Polyphyly of mycoheterotrophic orchids and functional influences on floral and molecular characters”, Monocots: systematics and evolution, pp 441448 46 Murashige T (1974), Plant propagation through tissue cultures, Annu Rev Plant Physiol, (25) pp.135-166 47 Pan M.J and J.V Staden (1999), Effect of activated charcoal, autoclaving and culture media on sucrose hydrolysis, Plant growth regulation, (9), pp.135-141 48 Parthibhan S, Rao MV, Kumar TS 2015 In vitro regeneration from protocorms in Dendrobium aqueum Lindley-An imperiled orchid 62 Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 13, 227–233 49 Qian L., Ding G., Zhou Q., Feng Z., Din X., Gu S., WangY., Li X., and Chu B (2008), “Molecular authentication of Dendrobium loddigesii Rolfe by Amplification Refractory Mutation System (ARMS)”, Planta Med 74(4), pp 470-473 50 Rayle D.L, Ross C.W, Robinson N 1982 Estimation of osmotic parameters accompanying zeatin-induced growth of detached cucumber cotyledons Plant Physiol 70: 1634-1636 51 Singh H.K., Parveen L., Raghuvanshi S., and Babbar S B (2012), “The loci recommended as universal barcodes for plants on the basis of floristic studies may not work with congenric species as exemplified by DNA barcoding of Dendrobium species”, BMC Res Notes (5), pp 42-48 52 Trigiano G.N and D.J Gray (2000), Plant tissue culture concepst and laboatry exercise, CRC Press Florida, America 53 Van Winkle S.C and G.S Pullman (1995), The role of activated carbon in tissue culture medium, Institute for Paper Science and Technology , (6), pp.68-72 54 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 55 Wang H Z., Feng S.G., Lu J.J., Shi N.N., and Liu J.J (2009), “Phylogentic study and molecular identification of 31 Dendrobium species using inter-simple sequence repeat (ISSR) markers”, Scientia Horticulturae, 122(3), pp 440-447 56 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics 63 (174), pp 1407-1420 57 Xin Z, Chen J 2012 A high throughput DNA extraction method with high yield and quality Plant Methods 826 58 Xu S, Li D, Li J, Xiang X, Jin W, Huang W, Jin X, Huang L 2015 Evaluation of the DNA Barcodes in Dendrobium (Orchidaceae) from Mainland Asia PloS ONE 10(1): e0115168 Doi :10.1371/journal pone.0115168 59 Yao H., Song J.Y., Ma X.Y., Liu C., Li Y., Xu H.X., Han J.P., Duan L.S., Chen S.L (2009), “Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA-trnH intergenic region”, Planta Med., 75(6), pp 667-669 60 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 PHỤ LỤC Phụ lục 1: KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ DNA THƠNG QUA CÁC MỒI CỦA SẢN PHẨM PCR Trình tự nucleotide thị matK Trình tự nucleotide thị thị trnL Trình tự nucleotide thị ITS Phụ lục 2: CÁC TRÌNH THỰ NUCLEOTIDE KHAI THÁC TRÊN GENBANK AB847880, KF143695, AB847875, AB847837, AB847818, AB847807, AB847801, AB847776, AB847772, AB847731, EF397931, KF143603, KF143607, KC568307, KF143623, EF397914, KF143626, AB593679, AB593602, AB593686, AB593497, AB847672, AB593651, AB593571, AB593607, AB593538, AB593633 ... CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài Nghiên cứu nhân giống lan Long tu kỹ thuật nuôi cấy in vitro cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Những số liệu kết nghiên cứu luận văn trung... khả tạo rễ in vitro lan Long tu - Đánh giá sinh trưởng lan Long tu sau giai đoạn in vitro giá thể xơ dừa khơ ngồi điều kiện tự nhiên Nhiệm vụ nghiên cứu - Sử dụng kỹ thuật DNA Barcording nhận dạng... Phong lan nghiên cứu - Khảo sát sinh trưởng mẫu Phong lan nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro có bổ sung liều lượng loại chất điều hòa sinh trưởng khác - Khảo sát sinh trưởng mẫu Phong lan nghiên