HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN GUMBORO NHƯỢC ĐỘC TRÊN TẾ BÀO XƠ PHƠI GÀ Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Đồng Huy Giới PGS.TS Nguyễn Hữu Nam NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS.TS Nguyễn Hữu Nam TS Đồng Huy Giới tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn , Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo: GĐ.Trần Thị Thu Hiền, PGĐ.Trần Văn Khánh , chị Nguyễn Thị Bích trưởng phòng QC, chị Nguyễn Thị Hồng Nhung cung cán viên chức phòng QC- Trung Tâm Nghiên Cứu nhà máy sản xuất Sinh phẩm công ty cổ phần dược phẩm vật tư thú y Hanvet giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Hiền i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Thị Hiền ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục biểu đồ vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa thực tiễn đề tài: Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung bệnh gumboro 2.1.1 Lịch sử tình hình bệnh Gumboro giới Việt Nam 2.1.2 Virut Gumboro 2.1.3 Bệnh Gumboro 2.2 Miễn dịch chống bệnh gumboro 13 2.2.1 Khái niệm chung 13 2.2.2 Cơ chế miễn dịch chống bệnh Gumboro 14 2.3 Vacxin vacxin phòng bệnh gumboro 17 2.3.1 Vacxin 17 2.3.2 Vacxin phòng bệnh Gumboro 18 2.3.3 Quy trình sử dụng loại vacxin Gumboro 19 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 20 3.1 Địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Thời gian nghiên cứu 20 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 20 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 20 iii 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.3.3 Thiết bị dụng cụ 20 3.4 Nội dung nghiên cứu 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 20 3.5.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho q trình ni cấy tế bào xơ phôi gà 20 3.5.2 Xác định điều kiện thích hợp cho q trình nhân nhiễm virus môi trường tế bào sơ phôi gà 22 3.5.3 Xác định liều gây nhiễm thích hợp 23 3.3.4 Xác định phần trăm sữa gầy bổ trợ vacxin đông khô 23 3.3.5 Kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô 23 3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 26 Phần Kết thảo luận 27 4.1 Kết 27 4.1.1 Kết nghiên cứu điều kiện thích hợp cho ni cấy tế bào 27 4.1.2 Xác định điều kiện thích hợp cho q trình nhân nhiễm virus mơi trường tế bào xơ phôi gà 31 4.1.3 Kết xác định liều gây nhiễm thích hợp 35 4.1.4 Kết xác định phần trăn sữa thích hợp cho q trình đơng khơ vacxin Gumboro nhược độc đông khô 36 4.1.5 Kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô 37 4.2 Thảo luận 40 4.2.1 Điều kiện thích hợp để ni cấy tế bào xơ phơi gà 40 4.2.2 Điều kiện tối ưu để nhân nhiễm virut Gumboro tế bào xơ phôi gà 42 4.2.3 Xác định phần trăm sữa thích hợp cho q trình đơng khơ vacxin 42 4.2.4 Xác định hiệu giá kháng thể phương pháp trung hòa virut 43 4.2.5 Loại bỏ yếu tố huyết môi trường nhân nhiễm virut 44 Phần Kết luận kiến nghị 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 Tài liệu tham khảo 46 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ARN CPE EID50 HA HI HGKT IBDV NXB OIE TCID50 Nghĩa đầy đủ : Axit Ribonucleic :Cytopathic Pathogene Effect :50 percent Embryo Infective Dose :Hemagglutination test :Hemagglutination Inhibition :Hiệu giá kháng thể :Infectious Bursal Disease Virus :Nhà xuất :World Qrganisation for Animal Health : Tissue Culture Infectious Dose 50 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết quan sát hình thái tế bào loại mơi trường 27 Bảng 4.2 Kết đếm số lượng tế bào loại môi trường 28 Bảng 4.3 Số lượng tế bào thu qua nuôi cấy phương pháp đếm số tế bào 30 Bảng 4.4 Kết hiệu giá virut sau gây nhiễm loại môi trường 31 Bảng 4.5 Kết xác định H môi trường nhân nhiễm tế bào 33 Bảng 4.6 Kết so sánh hiệu giá mơi trường có 1% huyết môi trường không bổ sung huyết môi trường nhân nhiễm 35 Bảng 4.7 Kết xác định liều gây nhiễm thích hợp 35 Bảng 4.8 Xác định phần trăm sữa thích hợp cho đơng khơ vacxin 36 Bảng 4.9 Kết kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc 37 Bảng 4.10 Kết kiểm tra tạp nhiễm virut Newcastle 38 Bảng 4.11 Kết kiểm tra an toàn gà ngày tuổi 38 Bảng 4.12 Kết hiệu giá virut có vacxin Gumboro nhược độc đông khô 39 Bảng 4.13 Kết hiệu giá kháng thể trung hòa virut (…log 2) 39 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc virus Gumboro (expasy.org) Hình 2.2 Genome virus Gumboro Hình 2.3 Bệnh tích bệnh Gumboro đùi 10 Hình 2.4 Xuất huyết đùi 10 Hình 2.5 Bệnh tích túi Fabricius 11 Hình 3.1 buồng đếm Neubauer 22 Hình 4.1 Hình ảnh biểu thị khả bám đáy tế bào qua nuôi cấy môi trường MEM 29 Hình 4.3 CPE liều nhiễm MOI 0.01 sau 72 36 Hình 4.4 Đối chứng tế bào sau 72 36 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biều đồ 4.1 Kết đếm số lượng tế bào loại môi trường 28 Biểu đồ 4.2 Xác định môi trường nhân nhiễm thời gian thu hoạch virut 33 Biểu đồ 4.3 Kết xác định pH môi trường nhân nhiễm tế bào 34 Biểu đồ 4.4 Kết xác định hiệu giá kháng thể sau miễn dịch 40 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thị Hiền Tên luận văn: “Nghiên cứu sản xuất vacxin Gumboro nhược độc đông khô tế bào xơ phôi gà” Ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60.42.02.01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Bệnh Gumboro (Hay gọi bệnh viêm túi huyệt truyền nhiễm – Infectious Bursal Disease-IBD) bệnh truyền nhiễm cấp tính gà, chủ yếu gà 3-6 tuần tuổi Bệnh Gumboro Birnavirus thuộc họ Birnaviridae gây Virut cường độc Gumboro công vào túi Fabricius quan có thẩm quyền miễn dịch, gây huỷ hoại tế bào lympho B, làm suy giảm miễn dịch gà Bệnh có tỷ lệ nhiễm cao từ 80% đến 100% cá thể đàn.Tỷ lệ chết bệnh Gumboro thường từ – 30%, nhiễm chủng virus có độc lực cao tỷ lệ chết tới 90% Bệnh Gumboro gây thiệt hại kinh tế nặng nề, chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Biện pháp phòng bệnh có hiệu sử dụng vacxin cách hợp lý để tạo cho đàn gà có lượng kháng thể chống lại công virus Gumboro Trong nghiên cứu này, nghiên cứu điều kiện môi trường, thời gian ni cấy số lượng tế bào thích hợp để xác định quy trình ni cấy tế bào xơ phơi thích hợp cho gây nhiễm virut Gumboro Sau xác định điều kiện thích hợp ni cấy tế bào xơ phôi gà nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến nhân lên virut tế bào môi trường gây nhiễm, thời gian gây nhiễm ,nồng độ huyết liều gây nhiễm thích hợp Sử dụng giống Gumboro chủng 2512 khảo sát thích nghi tế bào xơ phơi gà làm chủng virut gây nhiễm xuyên suốt đề tài Kết xây dựng quy trình thích hợp cho nhân nhiễm virut tế bào mang lại hiệu giá cao Xác đinh tỷ lệ sữa thích hợp phối trộn với huyễn dịch virut tạo vacxin Gumboro nhược độc đông khô đạt tiêu kiểm nghiệm vacxin đông khô:cảm quan, vật lý, độ ẩm, chân khơng, an tồn hiệu lực Từ bước đầu xây dựng quy trình sản xuất kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô môi trường tế bào xơ phơi gà Mục đích nghiên cứu Xác định quy trình sản xuất vacxin Gumboro mơi trường tế bào xơ phôi gà viii Đánh giá tiêu kiểm nghiệm phù hợp: khiết, an toàn, hiệu lực khả sinh miễn dịch đàn gà với vacxin Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, tế bào ni điều kiện thích hợp môi trường, thời gian nuôi cấy số lượng tế bào Để đánh giá điều kiện thích hợp sử dụng phương pháp đếm số buồng đếm Neubauer quan sát hình thái, phát triển tế bào kính hiển vi soi ngược Sau thời gian ni cấy thích hợp tiến hành gây nhiễm virut tế bào Bằng phương pháp xác định hiệu giá virut TCID50 quan sát bệnh tích tế bào (CPE) kính hiển vi soi ngược, xác định điều kiện thích hợp để gây nhiễm virut tế bào mang lại hiệu giá virut cao Sử dụng phương pháp xác định hiệu giá virut TCID50 tham khảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô theo TCVN 8669-6:2011 xác định tỷ lệ sữa thích hợp bổ trợ đơng khơ vacxin có hiệu giá cao đáp ứng tiêu chuẩn kiểm nghiệm vacxin Kết kết luận Nghiên cứu hồn thiện điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào xơ phôi gà Đã đưa quy trình thích hợp cho việc nhân nhiễm virut Gumboro tế bào xơ phôi gà Đã thử nghiệm đưa công thức bổ trợ phù hợp cho sản xuất thử nghiệm vacxin Gumboro tế bào xơ phôi gà Sản xuất thử nghiệm thành công lô vacxin Gumboro đạt tiêu kiểm nghiệm: cảm quan vật lý, an toàn, khiết hiệu lục với hiệu giá virut cao ix Biểu đồ 4.2 Xác định môi trường nhân nhiễm thời gian thu hoạch virut 4.1.2.2 Kết xác định pH môi trường nhân nhiễm tế bào Bảng 4.5 Kết xác định H môi trường nhân nhiễm tế bào pH môi trường 6.8-7.2 7.2-7.5 7.5-7.8 7.8-8.1 Số chai thí nghiệm 3 3 Liều nhiễm MOI Hình thái tế bào, đặc điểm CPE, mầu sắc mơi trường Hiệu giá TCID50/ml 0.01 CPE kín chai Tế bào bong mảng Môi trường màu vàng nhạt 106.9 CPE kín chai Tế bào bong mảng Mơi trường màu vàng cánh gián 107.1 CPE kín chai Tế bào bong mảng Môi trường màu hồng 107.5 CPE kín chai Tế bào bong mảng Mơi trường màu đỏ đậm 106.3 0.01 0.01 0.01 Với khoảng pH 7,5-7.8 sau 72 gây nhiễm cho môi trường màu hồng thu hiệu giá nguyên dịch cao loại môi trường 107.5 TCID50/ml, với pH 7.2-7.5 sau 72 gây nhiễm cho môi trường màu vàng cánh gián thu hiệu giá nguyên dịch 107.1 TCID50/ml, với pH 6.8-7.2 sau 72 33 gây nhiễm cho môi trường màu vàng nhạt thu hiệu giá nguyên dịch 106.9 TCID50/ml với pH 7.8-8.1 sau 72 gây nhiễm cho môi trường màu đỏ thu hiệu giá nguyên dịch 106.3 TCID50/ml Biểu đồ 4.3 Kết xác định pH môi trường nhân nhiễm tế bào Bước đầu kết luận mơi trường MEM với pH 7.5-7.8 thích hợp nhân nhiễm virut Gumboro tế bào xơ phôi gà Thí nghiệm lặp lại lơ (P< 0.05) lơ khơng có sai khác 4.1.2.3 So sánh mơi trường trì có bổ sung huyết không bổ sung huyết gây nhiễm virut Huyết dùng môi trường nuôi cấy không đắt tiền mà nguồn tạp nhiễm virus ngoại lai mycoplasma số trường hợp ứng chế nhân lên virus Do chất hóa học huyết chưa xác định đầy đủ nên số trường hợp ảnh hưởng xấu đến kết ni cấy Trong huyết có chứa sẵn lượng nội tiết tố (lipopolysaccharide: LPS) ảnh hưởng đến trình ni cấy tế bào Thí nghiệm bố trí với mơi trường có bổ sung 1% huyết bò mơi trường khơng bổ sung huyết Với mơi trường thí nghiệm chai chai đối chứng kèm 34 Kết đánh giá dựa hiệu giá virut loại môi trường Thí nghiệm lặp lại lơ Bảng 4.6 Kết so sánh hiệu giá mơi trường có 1% huyết môi trường không bổ sung huyết môi trường nhân nhiễm 1% huyết Không huyết Chai đối chứng 1% huyết Lô (TCID50/ml) 7.5 7.3 Tế bào bình thường Lơ (TCID50/ml) 7.7 7.7 Tế bào bình thường Lơ (TCID50/ml) 7.7 7.5 Tế bào bình thường Chai đối chứng khơng huyết Tế bào bình thường Tế bào bình thường Tế bào bình thường Mơi trường bổ sung Khảo sát qua lơ thí nghiệm cho thấy mơi trường khơng bổ sung huyết tế bào sau nhiễm phát triển bình thường Hiệu giá virut môi trường không bổ sung huyết tương đương với môi trường 1% huyết Tế bào đối chứng hai loại môi trường phát triển bình thường Vì việc bổ sung 1% huyết vào môi trường nhân nhiễm không cần thiết 4.1.3 Kết xác định liều gây nhiễm thích hợp Tiến hành thí nghiệm với liều nhiễm (MOI) là: 0.01; 0.001 0.0001 chai T-flask 225cm2 Với liều nhiễm thực chai Tflask 225cm2, gây nhiễm môi trường MEM thu virut sau 72 nhân nhiễm, chuyển chai vào tủ lạnh -40˚C Đông tan lần chai thu được, chuẩn độ hiệu giá virut nguyên dịch lô Đánh giá kết dựa kết hiệu giá virut phương pháp xác định hiệu giá virut TCID50 Spearman- Karper Bảng 4.7 Kết xác định liều gây nhiễm thích hợp 0.01 10 10 107.1 Hiệu giá virut trung bình (TCID50/ml) 107.3 0.001 106.3 106.7 106.1 106.36 0.0001 106.1 105.9 105.7 105.9 Liều nhiễm MOI Hiệu giá virut (TCID50/ml) Lô Lô Lô 7.3 7.5 35 Với liều MOI 0.01 sau 72 gây nhiễm thu ngun dịch virut có hiệu giá trung bình 107.3TCID50/ml, với liều MOI 0.001 01 sau 72 gây nhiễm thu nguyên dịch virut có hiệu giá trung bình 106.36TCID50/ml với liều MOI 0.00101 sau 72 gây nhiễm thu nguyên dịch virut có hiệu giá trung bình 105.9TCID50/ml Có thể kết luận với liều nhiễm MOI 0.01 sau 72 gây nhiễm cho hiệu giá nguyên dịch cao Hình 4.3 CPE liều nhiễm MOI 0.01 sau 72 Hình 4.4 Đối chứng tế bào sau 72 Vì vậy, chúng tối chọn liều nhiễm MOI 0.01 liều gây nhiễm thích hợp 4.1.4 Kết xác định phần trăn sữa thích hợp cho q trình đơng khơ vacxin Gumboro nhược độc đông khô Bảng 4.8 Xác định phần trăm sữa thích hợp cho đơng khơ vacxin Thí nghiệm Phần trăm sữa vacxin(%) Số lượng mẫu (lọ) 300 300 300 Mẫu đạt vật lý (%) 55±2 95±1 80±4 3,16±0,2 3,12±0,15 4,23±0,3 104.1 104.3 103.1 độ ẩm (%) Trung bình hiệu giá vacxin (TCID50/ liều) Bổ sung sữa 4% vacxin viên đơng khơ khơng tròn, nhiều viên bị rỗ tổ ong tổ Bổ sung 5% sữa gầy vacxin đông khô, sau đông khô viên ổn định 36 nhất: viên tạo thành hình trụ tròn, trắng ngà, xốp đồng nhất, ẩm độ, cảm quan đạt tiêu chuẩn, đặc biệt tiêu hiệu giá virus cao Khi bổ sung sữa 6% viên đông chứa độ ẩm cao >4%, hình thái khơng đạt vật lý 20±4% - viên kết tinh thể đá, không xốp, không đồng Thí nghiệm lặp lại lơ, ba lô cho kết tương tự Chúng chọn bổ sung 5% sựa gầy vào công thức đông khô vacxin 4.1.5 Kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc đông khô Chúng tiến hành đông khô lô vacxin liên tiếp với chất bổ trợ sữa gầy 5%, sau chúng tơi kiểm định chất lượng chúng theo tiêu chuẩn VN 2011 tham khảo tiêu chuẩn ngành 1994 4.1.5.1 Kết kiểm tra cảm quan vật lý Chỉ tiêu Cảm quan Chân không đạt ẩm độ Viên tròn, xốp, trắng ngà, dễ long khỏi thành lọ Khi chiếu đèn Testla có ánh xanh tím ≤ 4% 01 Đạt 99% số lọ 2.55% 02 Đạt 95% số lọ 3.12% 03 Đạt 97% số lọ 2.95% Lô Quan sát mắt thường thu kết lơ thí nghiệm cho viên đơng khơ màu trắng ngà, tròn, xốp, dễ bong khỏi thành lọ Với lơ thí nghiệm đạt chân khơng đến 90% ẩm độ đạt tiêu chuẩn ≤ 4% 4.1.5.2 Kết kiểm khiết + Kết kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc Bảng 4.9 Kết kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc Lô vacxin Số mẫu kiểm tra 3 Kết luận Loại môi trường kiểm tra Theo dõi (theo dõi ngày) 14 ngày TSB BA Thio TSB Không tạp Không tạp Không tạp nhiễm vi nhiễm vi khuẩn nhiễm khuẩn hiếu khí yếm khí nấm Kết Đạt Đạt Đạt Như vậy, lô vacxin nhược độc Gumboro qua kiểm tra đạt tiêu không bị tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc 37 + Kết kiểm tra tạp nhiễm virut Newcastle dựa TCVN 8669-6:2011 Bảng 4.10 Kết kiểm tra tạp nhiễm virut Newcastle Pha lỗng mẫu Lơ vacxin Số mẫu kiểm tra 3 lọ - - - - - - - 3 lọ - - - - - - - 3 lọ - - - - - - - Chứng dương Virus Newcastle + + + + + + - - Có giá trị (+) Chứng âm Nước sinh lý - - - - - - - - Có giá trị (-) Hồn nguyên -1 -2 -3 -4 -5 -6 Kết luận -7 Không tạp Newcastle Không tạp Newcastle Không tạp Newcastle Lô vacxin nhược độc Gumboro với mẫu kiểm tra mẫu không gây ngưng kết hồng cầu Như vậy, lô vacxin nhược độc Gumboro không bị nhiễm virus Newcastle đạt tiêu quy định Lô vacxin nhược độc Gumboro cho kết tương tự Như vậy, lô vacxin không tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc virus Newcastle 4.1.5.3 Kiểm tra an toàn theo TCVN 8669-6:2011 Phương pháp thay thế: Bảng 4.11 Kết kiểm tra an toàn gà ngày tuổi Lô vacxin kiểm tra Đối tượng kiểm tra Tuổi dùng vacxin (ngày tuổi) Liều dùng vacxin Thời gian theo dõi (ngày) Tỷ lệ gà khỏe mạnh (%) Gà (n=15) 10 1-21 100 Gà (n=15) 10 1-21 100 Gà (n=15) 10 1-21 100 Kết bảng cho thấy với lơ thí nghiệm kiểm tra an toàn gà ngày tuổi với 10 liều ghi nhãn, đến 21 ngày sau dùng vacxin đàn gà khỏe mạnh, hoạt động bình thường Như vậy, đáp ứng yêu cầu theo TCVN 8669-6:2011, 100% đàn gà khỏe mạnh dùng vacxin, đạt tiêu an toàn 38 4.1.5.4 Kiểm tra hiệu giá vacxin Gumboro nhược độc đông khô phương pháp chuẩn độ virut TCID50 Bảng 4.12 Kết hiệu giá virut có vacxin Gumboro nhược độc đơng khô Mẫu vacxin kiểm tra Lô vacxin 3 3 Độ pha loãng virus Số giếng gây nhiễm /nồng độ 10-1 – 10-7 Hiệu giá virus TCID50/ liều 104.1 5 5 5 5 103.9 103.9 104.3 103.9 104.3 104.1 103.9 103.7 -1 -7 10 – 10 10-1 – 10-7 10-1 – 10-7 10-1 – 10-7 10-1 – 10-7 10-1 – 10-7 10-1 – 10-7 10-1 – 10-7 Tiêu chuẩn vacxin ≥103TCID50/ liều vacxin Kết bảng cho thấy: Lô vacxin 1: chuẩn độ hiệu giá virus mẫu vacxin cho thấy sau gây nhiễm virus nhược độc Gumboro 72 giờ, virus gây hủy hoại tế bào, hiệu giá virus liều lớn 103TCID50/ liều vacxin Lô vacxin cho kết tương tự lô vacxin Như vậy, lô vacxin 1,2 cho kết hiệu giá lớn 103TCID50/ liều vacxin 4.1.5.5 Kiểm tra tiêu hiệu lực vacxin Gumboro nhược độc đơng khơ phương pháp trung hòa virut Bảng 4.13 Kết hiệu giá kháng thể trung hòa virut (…log 2) Hiệu giá N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N09 N10 trung bình 8 8 8 8.3 10 9 9 8 10 8.9 10 12 10 11 10 11 10 10 11 10.4 1 2 Thứ tự gà có hiệu giá kháng thể trung hòa ( log2) Nhóm DA nhóm MD 28 Gum mũi 31 42 Nhóm đối 28 chứng 42 Ghi chú: DMD D21 D28 D35 D21 D35 MD: miễn dịch DA: ngày tuổi D-MD: ngày miễn dịch 39 Biểu đồ 4.4 Kết xác định hiệu giá kháng thể sau miễn dịch Nhóm đối chứng kháng thể âm tính D21 D35 Nhóm thí nghiệm sau miễn dịch mũi hiệu giá kháng thể tăng dần D21