HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ TÂM NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG GEN CR11 MÃ HÓA YẾU TỐ PHIÊN MÃ THUỘC HỌ HDZIP LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN RỄ LÚA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 06.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học:1.TS Hoàng Thị Giang 2.GS.TS NGND Nguyễn Quang Thạch NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn thực say mê nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn trực tiếp TS Hồng Thị Giang, Phòng thí nghiệm LMI RICE-2, thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp GS.TS.NGND Nguyễn Quang Thạch, môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu, hình ảnh kết trình bày luận văn trung thực, khơng chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng nhà trường Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tâm i LỜI CẢM ƠN Sau khoảng thời gian thực tập Phòng thí nghiệm LMI RICE 2, Viện Di truyền Nông nghiệp, quan tâm, giúp đỡ tần tình thầy giáo, cán phòng thí nghiệm Viện, với cố gắng nỗ lực thân, tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin bảy tỏ lòng kính trọng biết ơn chân thành tới TS Hồng Thị Giang trực tiếp hướng dẫn tơi, ln theo dõi tận tình, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS.NGND Nguyễn Quang Thạch, truyền đạt cho kiến thức quý báu ngành Công nghệ sinh học, nhiệt tình bảo người đồng hướng dẫn cho tơi q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, Ban quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viên Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Ths Nguyễn Thị Thơm, Ths Nguyễn Diệu Thu KS Đinh Văn Lâm trực tiếp hướng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn Viện Di truyền Nông nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bác, Cô, Chú nghiên cứu viên phòng thí nghiệm LMI-RICE 2, Viện Di truyền Nơng nghiệp nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Và cuối tơi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè tập thể lớp CH23CNSHC bên cạnh, động viên giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tâm ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu lúa 2.1.1 Đặc điểm sinh học phân bố lúa 2.1.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh tính chống chịu stress trồng 2.2 Đặc điểm cấu trúc rễ lúa 2.3 Gen liên quan đến phát triển rễ lúa 11 2.3.1 Một số nghiên cứu gen liên quan đến phát triển rễ 11 2.3.2 Nghiên cứu phân hóa phát triển rễ phụ lúa 13 2.3.3 Nghiên cứu gen điều hòa CRL1 liên quan đến hình thành rễ phụ 16 2.4 Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn a tumefaciens 18 2.5 Phân tích chuyển gen sinh học phân tử 19 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cúu 21 3.1 Địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Thời gian nghiên cứu 21 3.3 Vật liệu nghiên cứu 21 iii 3.3.1 Vật liệu thực vật 22 3.3.2 Mồi khuếch đại gen vật tư khác 22 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Đánh giá biểu gen CR11 RT-PCR 25 3.5.2 Đánh giá di truyền cấu trúc gen chuyển hệ T1 26 3.5.3 Đánh giá phát triển rễ dòng lúa Taichung 65 dạng dại dạng đột biến hệ T1 mang cấu trúc gen pUbi::cdsCR11 29 3.5.4 Đánh giá hoạt động promoter proCR11 thông qua biểu gen GUS 30 Phần Kết thảo luận 32 4.1 Kết 32 4.1.1 Kết nghiên cứu hoạt động promoter proCR11 liên quan đến phát triển rễ lúa 32 4.1.2 Kết nghiên cứu vai trò gen CR11 liên quan đến hình thành rễ phụ lúa 39 4.2 Thảo luận 48 4.2.1 Nghiên cứu hoạt động promoter proCR11 thông qua biểu gen GUS 48 4.2.2 Nghiên cứu vai trò gen CR11 đến hình thành rễ phụ lúa Taichung 65 dạng dại dạng đột biến 50 Phần Kết luận kiến nghị 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 54 Tài liệu tham khảo 56 Phụ lục 59 iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt bp Base pair (cặp base) cdsCR11 Vùng mã hóa gen CR11 (coding sequence) CNSH Công nghệ sinh học crl1 Cây lúa Taichung 65 bị đột biến gen CRL1 DNA Axit deoxyribonucleic GUS Gen mã hóa enzyme β-glucoronidase MS Mơi trường ni cấy theo Murashige Skoog (1962) NXB Nhà xuất proCR11 Vùng promoter gen CR11 pUbi Vùng promoter gen Ubiquitine qRT-PCR Phương pháp real time PCR định lượng RNA Axit ribonucleic TC65 Cây lúa TaiChung 65 X-Gluc 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc trưng hình thái sinh lý tổng quát nhóm giống lúa Bảng 3.1 Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra chuyển gen 24 Bảng 4.1 Đánh giá phân ly di truyền cấu trúc gen proCR11::GUS hệ T1 34 Bảng 4.2 Biểu gen GUS dòng chuyển gen proCR11::GUS hệ T1 36 Bảng 4.3 Đánh giá phân ly di truyền cấu trúc gen pUbi::cdsCR11 hệ T1 44 Bảng 4.4 Số rễ phụ/gốc thân lúa TC65 đột biến chuyển gen pUbi::cdsCR11 giai đoạn 7-10-14 ngày tuổi 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc rễ lúa Hình 2.2 Cấu tạo lớp mô tạo thành rễ phụ lúa (Rebouillat et al., 2009) 10 Hình 2.3 Đường truyền tín hiệu auxin dẫn đến biểu CRL1 trình hình thành rễ (Inukai et al., 2005) 14 Hình 2.4 Mạng lưới điều hòa gen kiểm sốt hình thành phát triển rễ phụ lúa (Coudert et al., 2010) 16 Hình 3.1 Hình ảnh giống lúa đối chứng 22 Hình 3.2 Cấu trúc gen pUbi::CR11 cách thiết kế cặp mồi cho PCR 23 Hình 3.3 Cấu trúc gen proCR11::GUS cách thiết kế cặp mồi cho PCR 23 Hình 4.1 DNA tổng số tách chiết từ chuyển gen 1proCR11::GUS 32 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR chuyển gen mang cấu trúc proCR11::GUS 33 Hình 4.3 Cấu tạo stem base lúa 35 Hình 4.4 Mức độ biểu gen GUS điều khiển proCR11 chuyển gen 36 Hình 4.5 Sự biểu gen GUS hai dòng 1proCR11::GUS 17.2 1proCR11::GUS 29.1 giai đoạn phát triển khác 37 Hình 4.6 Sự biểu gen GUS hai dòng 1proCR11::GUS 23.1 1proCR11::GUS 61.9 giai đoạn phát triển khác 38 Hình 4.7 Sự biểu GUS điều khiển promoter CR11 (A-D) 39 Hình 4.8 Kết kiểm tra RNA tổng số sau tách chiết xử lý DNaseI 40 Hình 4.9 Đánh giá sản phẩm phiên mã ngược PCR với mồi actin 41 Hình 4.10 Mức độ biểu gen CR11 dòng chuyển gen T0 TC65 đột biến 42 Hình 4.11 Mức độ biểu gen CR11 dòng chuyển gen T0 TC65 dạng dại 43 Hình 4.12 Phân tích PCR gen pUbi::cdsCR11 lúa chuyển gen pUbi::cdsCR11 44 Hình 4.13 Sự hình thành rễ phụ lúa TC65 đột biến chuyển gen pUbi::cdsCR11 45 Hình 4.14 Định lượng hình thành rễ phụ số dòng lúa chuyển gen TC65 đột biến (* p