BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYLGLUCOSAMINE (NAG) BẰNG CHITINASE TỪ PENICILLIUM OXALICUM 20B ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHÂM Hà Nội - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố Hà Nội, ngày … tháng … năm 2017 Đặng Thị Hường i LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Lê Thanh Hà PGS TS Phạm Thu Thủy - Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy, cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình giảng dạy, hƣớng dẫn tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cám ơn PGS TS Nguyễn Tiến Thành - Trƣờng phòng Thu Hồi Sản phẩm, va cán nghiên cứu Trung tâm Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học tận tình giúp đỡ, dạy bảo động viên tơi trình học tập nghiên cứu khoa học Cuối cùng, xin cám ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Cộng đồng Hà tây gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng … năm 2017 Nghiên cứu sinh Đặng Thị Hường ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 N- ACETYLGLUCOSAMINE 1.1.1 Các đặc tính N- acetylglucosamine 1.1.2 Thực phẩm chức 1.1.3 Vai trò N- acetylglucosamine sản xuất thực phẩm chức 1.1.4 Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine 1.1.4.1 Phƣơng pháp hóa học 1.1.4.2 Phƣơng pháp chuyển hóa sinh học 1.1.4.3 Phƣơng pháp enzym 1.2 CHITIN 1.2.1 Cấu tạo hóa học tính chất lý hóa chitin 1.2.2 Nguồn thu nhận chitin 10 1.3 CHITINASE 11 1.3.1 Hệ chitinase 11 1.3.2 Đặc tính sinh hóa 11 1.3.3 Cơ chế thủy phân chitin chitinase thành NAG 13 1.3.4 Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG 15 1.3.4.1 Các giải pháp tiền xử lý chitin 15 1.3.4.2 Điều kiện thủy phân chitin NAG chế phẩm chitinase 17 1.4 SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 20 1.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase 20 1.4.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase 21 1.4.3 Ảnh hƣởng nguồn nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase 22 1.4.4 Ảnh hƣởng nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase 23 1.4.5 Ảnh hƣởng pH tới sinh tổng hợp chitinase 24 1.4.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase 25 1.4.7 Ảnh hƣởng thời gian tới sinh tổng hợp chitinase 25 1.4.8 Ảnh hƣởng tốc độ lắc cƣờng độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase 26 1.5 PHƢƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 27 iii 1.5.1 Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym 27 1.5.2 Cô đặc dịch chiết enzym 28 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP TINH SẠCH NAG TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN 28 1.6.1 Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất 28 1.6.2 Cô đặc………………………………………………………………………………… 28 1.6.3 Kết tinh 29 1.6.4 Tinh NAG dung môi 30 1.6.5 Qui trình tinh để thu nhận NAG 30 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 32 2.1.1 Nguyên vật liệu 32 2.1.2 Chủng vi sinh vật 32 2.1.3 Hóa chất 33 2.1.4 Thiết bị… 33 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 33 2.2.1 Phƣơng pháp xác định sinh khối nấm mốc 33 2.2.2 Phƣơng pháp phân tích hóa lý 33 2.2.2.1 Phƣơng pháp xác định độ ẩm 33 2.2.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng (NAG)i 34 2.2.2.3 Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng số mẫu chitin 35 2.2.2.4 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein mẫu chitin 35 2.2.2.5 Cách tính hàm lƣợng chitin 35 2.2.3 Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzym 36 2.2.3.1 Hoạt độ chitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Binod cải tiến 36 2.2.3.2 Hoạt độ endochitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Yabuki cải tiến 36 2.2.3.3 Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase 36 2.2.3.4 Hoạt độ chitobiosidase 37 2.2.4 Phƣơng pháp xác định cấu trúc bề mặt chitin, NAG 37 2.2.5 Phƣơng pháp xác định đặc tính vật lý chitin, NAG 37 2.2.6 Phƣơng pháp xác định cấu trúc chitin, NAG 38 2.2.7 Phƣơng pháp xác định sai số trung bình 38 2.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.3.1 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng sinh tổng hợp chitinase 38 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật 38 2.3.3 Khảo sát đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật 39 2.3.4 Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật 40 2.3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu thủy phân chitin 40 iv 2.3.5.1 Phƣơng pháp tiền xử lý chitin 40 2.3.5.2 Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân chitin 43 2.3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh 43 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P OXALICUM 20B 47 3.1.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng lên men 47 3.1.1.1 Ảnh hƣởng dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase 47 3.1.1.2 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase 47 3.1.1.3 Ảnh hƣờng nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase 49 3.1.1.4 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase 50 3.1.2 Ảnh hƣởng điều kiện lên men 50 3.1.2.1 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng lên men tới sinh tổng hợp chitinase 50 3.1.2.2 Ảnh hƣởng tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase 51 3.1.3 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển sinh tổng hợp chitinase 52 3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT……………… 55 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi 55 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ NAHase/Endochitinase tới khả tạo NAG 56 3.2.3 Lựa chọn điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật 58 3.2.4 Xác định đặc tính sinh học chế phẩm chitinase kỹ thuật 59 3.2.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính enzym 59 3.2.4.2 Ảnh hƣởng pH tới hoạt tính enzym 61 3.3 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT THỦY PHÂN CHITIN 63 3.3.1 Khảo sát lựa chọn chitin phế liệu thủy sản 63 3.3.2 Lựa chọn phƣơng pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni 64 3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ nghiền đến khả thủy phân chitin 64 3.3.2.2 Ảnh hƣởng xử lý phối hợp nghiền bi siêu âm tới khả thủy phân chitin 65 2.3.2.3 Ảnh hƣởng giải pháp xử lý chitin tới cấu sản phẩm nhận đƣợc sau thủy phân 67 3.3.2.4 Ảnh hƣởng tác động nhiệt độ cao áp suất 70 3.3.2.5 Ảnh hƣởng tác động xử lý hóa học vật lý 71 3.3.2.6 Ảnh hƣởng trạng thái chitin tới trình thủy phân NAG 75 3.3.3 Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin 77 3.3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 77 3.3.3.2 Ảnh hƣởng pH 78 3.3.3.3 Ảnh hƣởng nồng độ gel chitin 78 3.3.3.4 Ảnh hƣởng nồng độ enzym 79 3.4 NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM NAG 82 3.4.1 Ảnh hƣởng mức độ cô đặc dịch sau thủy phân tới trình kết tinh lần 82 3.4.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới trình kết tủa cồn 83 3.4.3 Ảnh hƣởng mức độ cô đặc tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới hiệu suất thu hồi v độ tinh chế phẩm NAG 84 3.4.4 Đề xuất ứng dụng qui trình thu nhận NAG 87 3.4.4.1 Đề xuất qui trình thu nhận NAG 87 3.4.4.2 Ứng dụng qui trình thu nhận NAG với qui mô lit dịch thủy phân 87 3.5 XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM NAG 91 3.5.1 Xác định vi sinh vật 91 3.5.2 Xác định kim loại nặng 91 3.5.3 Xác định liều độc LD50 91 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC 107 Phụ lục Mẫu nguyên liệu chitin 107 Phụ lục Thành phần môi trƣờng tuyển chọn nuôi cấy P oxalicum 20B 107 Phụ lục Đồ thị đƣờng chuẩn NAG phƣơng pháp DNS 108 Phụ lục Đồ thị đƣờng chuẩn BSA để xác định hàm lƣợng protein phƣơng pháp Lowry………… 108 Phụ lục Đồ thị đƣờng chuẩn p-nitrophenyl N-axetyl-β-D glucosaminidase (pNP-NAG) 108 Phụ lục Đặc tính phân đoạn enzym sau cô đặc 2, 3, lần 109 Phụ lục Ảnh hƣởng mức độ cô đặc dịch thủy phân đến HSTH NAG 109 Phụ lục Thủy phân gel chitin 40% dịch NAG với Bx = 2,2% 110 Phụ lục Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới NAG thất thoát vào kết tủa EtOH 111 Phụ lục 10 Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới HSTH NAG Độ tinh NAG 112 Phụ lục 11 Ảnh hƣởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới NAG thất thoát vào dịch không kết tich 112 Phụ lục 12 Kết phân tích tiêu E coli, Salmonella Pb, Hg, Cd 112 Phụ lục 13 Kết xác định LD50 112 Phụ lục 14 Kết phân tích hàm lƣợng NAG HPLC 112 vi DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TT Các từ thuật ngữ viết tắt Giải thích từ thuật ngữ viết tắt CK CNM Cao nấm men CFU Số đơn vị hình thành khuẩn lạc CPE Chế phẩm enzyme DSC Phân tích nhiệt vi sai DNS Acid dinitro salicylic Endo Éndochitinase E/ S Tỷ lệ Enzyme / chất (v/v) FTIR Phân tích quang phổ hồng ngoại (Fourier Transform Infared) 10 h 11 H/ E 12 HSTH Hiệu suất thu hồi 13 HSTP Hiệu suất thủy phân 14 HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chất khô Giờ Tỷ lệ NAHase / Endochitinase Chromatography) Không phát 15 KPH 16 KT Kích thƣớc 17 M Mực 18 MN Mũ ni 19 NAG (hay GlcNAc) 20 (NAG)2 Diacetyl-chitobiose 21 (NAG)3 Triacetyl-chitotriose 22 NAHase (hay Hexo) 23 S 24 SA 25 SEM Vi điển tử quét (Scanning Electron Microscopy) 26 pNP p-nitrophenol 27 TLC Sắc ký mỏng (Thin Layer Chromatography) 28 v/p N-acetylglucosamine hay N-acetyl-D-glucosamine N-acetylglucosaminidase acetylhexosaminidase hay Sú Siêu âm Vòng/phút vii β-N- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ứng dụng lợi ích NAG Bảng 2.1 Thành phần hóa học nguyên liệu chitin (% chất khô) 32 Bảng 2.2 Sử dụng chất phụ gia bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật 4oC 40 Bảng 2.3 Xử lý nhiệt, áp suất lên nguyên liệu chitin 40 Bảng 2.4 Các phân đoạn kích thƣớc nguyên liệu chitin 41 Bảng 3.1 Động thái sinh tổng hợp chitinase, endochitinase, NAHase Penicillium oxalicum 20B 53 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hoạt độ chitinase tỷ lệ chitinase, tỷ lệ NAHase endochitinase phân đoạn 56 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu nhận chitinase, NAHase endochitinase phân đoạn 56 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới cấu enzym chitinase khả thủy phân chitin……… 58 Bảng 3.5 Hàm lƣợng chitin loại nguyên liệu 63 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng mức độ nghiền bi tới tính chất phân đoạn bột nghiền 64 Bảng 3.7 Hàm lƣợng (NAG)i (với i từ – 3) dịch thủy phân chitin tôm mũ ni (đƣợc tiền xử lý phƣơng pháp khác nhau) chế phẩm enzym kỹ thuật thời gian 120 h…………… 67 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ, áp suất xử lý chitin tơm mũ ni kích thƣớc 600 µm < MN < mm tới hiệu suất thủy phân (%) 70 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng vi sóng xử lý chitin tơm mũ ni kích thƣớc 600 µm < MN < mm tới hiệu suất thủy phân (%) 70 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ 1500 C kết hợp với áp suất psi; SA gián đoạn lần (mỗi lần 20 phút) có mặt enzym lên chitin tơm mũ ni kích thƣớc 425 µm