BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Võ Thành Trung NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CÔNG NGHỆ XỬ LÝ RONG LỤC VIỆT NAM VÀ LÊN MEN ETHANOL GÓP PHẦN PHÁT TRIỂN CỒN NHIÊN LIỆU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2017 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: HD1: PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng HD2: TS Lê Như Hậu Phản biện 1: GS.TS Phạm Văn Ty Phản biện 2: PGS.TS Lê Gia Hy Phản biện 3: PGS.TS Vũ Nguyên Thành Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 30, ngày 01 tháng 08 năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2014) Tuyển chọn loài rong Lục Việt Nam ứng dụng sản xuất cồn Tạp chí Khoa học Cơng Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 52 (5A) 7-13 Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2014) Nghiên cứu biến động thành phần hóa học theo chu kỳ sống số loài rong Lục Việt Nam ứng dụng sản xuất cồn Tạp chí Khoa học Cơng Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 52 (5B) 597-604 Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2015) Selection of some yeast strains for ethanol fermentation from hydrolysate solution of green seaweed Chaetomorpha linum Journal of Science and Technology - Viet Nam Academy of Science and Technology 53 (4C) 472-480 Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2016) Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong Lục Chaetomorpha linum enzyme ứng dụng sản xuất bioethanol Tạp chí sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Vol 38 (2): 201-206 LỜI CAM ĐOAN   Tôi xin cam đoan, luận án này là kết quả nghiên cứu của tôi trong thời gian  qua. Những kết quả và số liệu trình bày trong luận án là kết quả nghiên cứu của tơi,  khơng sao chép bất kỳ nguồn nào khác, hồn tồn trung thực và chưa được tác giả  khác cơng bố.  Tơi hồn tồn chịu trách  nhiệm  về  kết quả  trình  bày trong  luận  án  này.    Hà Nội, ngày     tháng     năm 2017    Thay mặt tập thể hướng dẫn    Nghiên cứu sinh                i  LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện cơng trình nghiên cứu tơi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ,  đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cơ, bạn đồng nghiệp và các cơ quan.   Trước  hết  cho  tơi  gửi  lời  cảm  ơn  chân  thành  và  sâu  sắc  nhất  tới  PGS.  Nguyễn  Thanh  Hằng –  Bộ mơn Cơng nghệ Thực  phẩm, Viện  Cơng nghệ sinh  học  và Cơng nghệ  Thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Lê Như Hậu phòng Vật liệu hữu cơ  từ  Tài  ngun  Biển,  Viện  Nghiên  cứu  và  Ứng  dụng  Công  nghệ  Nha  Trang    đã  tận  tình  hướng dẫn và định hướng cho tơi trong suốt q trình nghiên cứu để hồn thành bản luận  án này.   Tơi xin cảm ơn tới các thầy cơ giáo thuộc Viện Cơng nghệ sinh học và Cơng nghệ  thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý cho tơi rất nhiều trong  q trình học tập và nghiên cứu.   Nhân  dịp  này  cho  tôi  gửi  lời  cảm  ơn  tới  PGS.  Bùi  Minh  Lý,  Viện  trưởng  -Viện  Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang  đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho  tôi học tập và nghiên cứu.   Tôi xin cảm ơn GS. Hee Chul Woo, Viện Công nghệ Sản xuất Sạch, Đại học Quốc  gia Pukyong Hàn Quốc  đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi được nghiên cứu tại phòng thí  nghiệm của giáo sư.  Tơi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thư  ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian q báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án  với  những  góp  ý  cụ  thể,  những  gợi  ý  bổ  ích,  giúp  tơi  hồn  thiện  tốt  hơn  các  nội  dung  nghiên cứu của luận án.  Tơi cũng vơ cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của  gia đình, bè bạn và đồng nghiệp đã dành cho tơi để tơi hồn thành bản luận án nghiên cứu  này.   Hà Nội,ngày     tháng     năm 2017  Võ Thành Trung           ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I  LỜI CẢM ƠN II  MỞ ĐẦU 1  CHƯƠNG TỔNG QUAN .3  1.1 RONG BIỂN 3  1.1.1 Phân loại rong biển 3  1.1.2 Thành phần hóa học loại rong biển .4  1.1.3 Rong lục 6  1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN 7  1.2.1 Tiềm rong biển để sản xuất ethanol 7  1.2.2 Quá trình xử lý sơ nguyên liệu rong biển 9  1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển 9  1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển 17  1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 23  1.3.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển giới 23  1.3.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển Việt Nam 26  CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29  2.1 VẬT LIỆU .29  2.1.1 Rong lục 29  2.1.2 Chế phẩm Enzyme 29  2.1.3 Chế phẩm nấm men 29  2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30  2.2.1 Các phương pháp phân tích .30  2.2.2 Phương pháp toán học 40  2.2.3 Thiết kế nghiên cứu 42  CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50  3.1 LỰA CHỌN RONG LỤC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG LỤC VIỆT NAM 50  3.1.1 Lựa chọn loài rong lục Việt Nam 50    iii 3.1.2 Thành phần hóa học lồi rong chọn 52  3.1.3 Nghiên cứu biến động thành phần hóa học rong Ch linum, Cl socialis theo chu kỳ sống 54  3.1.4 Thành phần loại đường rong Ch linum Cl socialis 60  3.2 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG CH LINUM 63  3.2.1 Nghiên cứu xử lý nguyên liệu rong Ch linum trước thủy phân 63  3.2.2 Nghiên cứu trình thủy phân rong Ch.linum axit 64  3.2.3 Nghiên cứu trình thủy phân rong Ch linum chế phẩm enzyme thương mại 73  3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH THỦY PHÂN RONG CH LINUM 86  3.3.1 Tuyển chọn chủng nấm men dịch thủy phân rong Ch.linum axit .86  3.3.2 Tuyển chọn chủng nấm men dịch thủy phân rong Ch.linum chế phẩm enzyme .87  3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men dịch thủy phân axit enzyme chế phẩm nấm men Red Ethanol 89  3.3.4 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum axit chế phẩm nấm men Red Ethanol .94  3.4 KHẢO SÁT Q TRÌNH ĐƯỜNG HĨA VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI (SSF) CỦA DỊCH RONG CH LINUM SAU TIỀN XỬ LÝ 100  KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 103  4.1 KẾT LUẬN 103  4.2 KIẾN NGHỊ 104  TÀI LIỆU THAM KHẢO 106  PHỤ LỤC 115        iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong biển  Bảng 1. 2 So sánh năng suất ni trồng của các nguồn sinh khối  Bảng 1. 3 Thành phần hóa học rong biển và đường tạo thành bởi thủy phân của các lồi  rong biển   10 Bảng 1. 4 Nấm men lên men ethanol từ sinh khối rong biển   20 Bảng 1. 5 Diện tích và sản lượng tại thời điểm khảo sát (2010) và dự kiến đến năm 2015   27  Bảng 3. 1 Lựa chọn các lồi rong lục ở Việt Nam   50 Bảng 3. 2 Thành phần hóa học của các lồi rong lục được chọn  . 52 Bảng 3. 3 Biến động sinh lượng rong lục trong một vụ trồng vào mùa thuận lợi  . 55 Bảng 3. 4 Năng suất thu hoạch của các đối tượng rong lục được nuôi trồng luân canh trong  ao đầm tại miền Trung   55 Bảng 3. 5 Thành phần carbonhydrate của sinh khối rong Ch.linum  61 Bảng 3. 6 Thành phần các loại đường của rong Cl socialis   62 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của muối NaCl trong nguyên liệu đến quá trình thủy phân rong Ch linum  . 63 Bảng 3. 8 Ảnh hưởng của kích thước rong đến q trình thủy phân rong Ch linum   64 Bảng 3. 9 Ảnh hưởng của tỷ lệ rong trong dung dịch đến thủy phân rong Ch linum  . 65 Bảng 3. 10 Khoảng xác định của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng axit   68 Bảng 3. 11 Mức thí nghiệm của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng axit   68 Bảng 3. 12 Ma trận thực nghiệm và kết quả   69 Bảng 3. 13 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng  axit   69 Bảng 3. 14 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong theo Box-wilson   70 Bảng 3. 15 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit   71 Bảng 3. 16 Thành phần dịch thủy phân rong  lục bằng axit  . 72 Bảng 3. 17 Ảnh hưởng của nồng độ axit đến quá trình tiền xử lý rong Ch.linum   73 Bảng 3. 18 Hoạt độ các loại enzyme trong chế phẩm  enzyme ViscozymeL và Cellulase . 74 Bảng 3. 19 Khả năng thủy phân rong Ch.limum thành đường bởi các chế phẩm enzyme  thương mại  . 75 Bảng 3. 20 Khoảng xác định của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng enzyme   79 Bảng 3. 21 Mức thí nghiệm của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng enzyme   79   v Bảng 3. 22 Ma trận thực nghiệm và kết quả   80 Bảng 3. 23 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng  enzyme   80 Bảng 3. 24 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong Ch linum bằng enzyme  . 81 Bảng 3. 25 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L   82 Bảng 3. 26 Thành phần dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme   84 Bảng 3. 27 Hiệu suất thủy phân rong Ch linum bằng axit và bằng chế phẩm enzyme  Viscozyme L   85 Bảng 3. 28 Lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi các chủng nấm  men khác nhau  . 86 Bảng 3. 29 Hàm lượng ethanol và hiệu suất lên men của các chủng nấm men lên men từ  dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit được xác định bằng HPLC   87 Bảng 3. 30 Lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme bởi  các chủng nấm men khác nhau  . 88 Bảng 3. 31 Hàm lượng ethanol và hiệu suất của các chủng nấm men lên men từ dịch thủy  phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme được xác định bằng HPLC  . 88 Bảng 3. 32 Ảnh hưởng của nguồn nito đến quá trình lên men dịch thủy phân Ch linum   89 Bảng 3. 33 Khoảng xác định của các yếu tố trong lên men dich thủy phân bằng axit   94 Bảng 3. 34 Mức thí nghiệm của các yếu tố trong lên men dịch thủy phân bằng axit   94 Bảng 3. 35 Ma trận thực nghiệm và kết quả   95 Bảng 3. 36 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong lên men dich thủy  phân bằng axit   96 Bảng 3. 37 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit theo  Box-wilson   96 Bảng 3. 38 Chuyển hóa đường và ethanol trong q trình lên men từ dịch thủy phân rong  Ch.linum bằng axit   97 Bảng 3. 39 Chuyển hóa đường và ethanol trong q trình lên men từ dịch thủy phân rong  Ch.linum bằng enzyme   98 Bảng 3. 40 Hiệu suất lên men ethanol của quá trình lên men từ dịch thủy phân rong  Ch.linum bằng axit và bằng chế phẩm enzyme  . 99 Bảng 3. 41  Kết quả của q trình đường hóa và lên men đồng thời tại các thời điểm đường  hóa ban đầu khác nhau   100     vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Thành phần carbohydrate của rong đỏ, rong nâu, rong lục  5  Hình 3. 1 Biến động hàm lượng protein theo chu kỳ sống của hai lồi rong lục   57 Hình 3. 2 Biến động hàm lượng tro theo chu kỳ sống của hai lồi rong lục  . 58 Hình 3. 3 Biến động hàm lượng lipid theo chu kỳ sống của hai lồi rong  58 Hình 3. 4 Biến động hàm lượng carbohydrate và tốc độ sinh trưởng theo chu kỳ sống của  hai loại rong lục  . 59 Hình 3. 5 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Ch linum.  . 61 Hình 3. 6 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Cl socialis  . 61 Hình 3. 7 Ảnh hưởng nồng độ axit sunfuric đến quá trình thủy phân rong Ch.linum axit   65 Hình 3. 8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit sunfuric 66 Hình 3. 9 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit   67 Hình 3. 10 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit (A)   71 Hình 3. 11 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng  enzyme   76 Hình 3. 12 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme  . 77 Hình 3. 13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme 78 Hình 3. 14 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme   78 Hình 3. 15 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L (A)   82 Hình 3. 16 Sự biến đổi nito tổng số trong quá trình lên men   90 Hình 3. 17 Ảnh hưởng pH đến quá trình lên mendịch thủy phân rong Ch.linum  . 91 Hình 3. 18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum   92 Hình 3. 19 Động thái quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum   93   vii Valonia aegagropila  Boodlea composita Codium repens  Cladophoropsis membranacea Halimeda opuntia  Bryopsis indica Hình 2 Hình thái ngồi tự nhiên và dưới kính hiển vi phóng đại 400 lần của các lồi rong  lục thường xuất hiện ở Việt Nam         122 Hình Đường chuẩn trong phân tích đường bằng phương pháp Dubois, 1951  Hình Đường chuẩn trong phân tích đường khử bằng phương pháp Sommogyi-Nelson,  1954           Hình 5 Đường chuẩn trong phân tích Ethanol bằng phương pháp Bennet, 1971   123   Hình Thành phần monosacharid của rong Cladophora socialis   124   Hình Thành phần monosacharid của rong Chaetomorpha linum.    125 Hình sắc ký đồ dịch thủy phân bằng axit    126   Hình Sắc ký đồ dịch lên men bằng axit tại 24 giờ    127   Hình 10 sắc ký đồ dịch lên men bằng axit tại 48 giờ        128   Hình 11 Sắc ký đồ dịch lên men bằng axit tại 72 giờ    129     Hình 12 sắc ký đồ chuẩn các loại đường và ethanol cho dịch thủy phân bằng axit      130   Hình 13 sắc ký đồ dịch thủy phân bằng chế phẩm enzyme    131   Hình 14  Sắc ký đồ dịch lên men bằng chế phẩm enzyme tại 48 giờ    132   Hình 15 sắc ký đồ dịch lên men bằng chế phẩm enzyme tại 96 giờ        133     Hình 16 sắc ký đồ chuẩn các loại đường và ethanol cho dịch thủy phân bằng enzyme      134     Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit của nấm  Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit của nấm  men Thermosacch  men Sac-BKHCM      Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit của nấm  Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit của nấm  men Sac-CCC  men Sac-SHND  Hình 17 Sắc ký đồ dịch lên men của chủng nấm men từ dịch thủy phân bằng axit    135       Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm  Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm enzyme của nấm men Sac-BKHCM  enzyme của nấm men Thermosacch      Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm enzyme của nấm men Sac-CCC  enzyme của nấm men Sac-SHND  Hình 18 Sắc ký đồ dịch lên men của chủng chủng nấm men từ dịch thủy phân bằng chế  phẩm enzyme      136 ... Việt Nam hiện nay mới được đề cập tuy vậy vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể. Do đó, chúng tơi  tiến hành đề tài  Nghiên cứu xác định thơng số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu để đưa ra được một cách hồn chỉnh ... 1. Nghiên cứulựa chọn nguồn rong lục Việt Nam làm nguyên liệu cho lên men ethanol 2. Nghiên cứu chọn giải pháp xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol 3. Nghiên cứu chọn giải pháp lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục Những đóng góp luận... Chọn được giải pháp công nghệ xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol Chọn được giải pháp công nghệ lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục Các nội dung nghiên cứu đề tài 1. Nghiên cứulựa chọn nguồn rong lục Việt Nam làm nguyên liệu cho lên men ethanol