ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHƢƠNG NAM Tên đề tài: XÁC ĐỊNH SỰ SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA VỚI MỘT SỐ GIỐNG DÊ KHÁC BẰNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính Quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2013 - 2017 Thái Nguyên, năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHƢƠNG NAM Tên đề tài: XÁC ĐỊNH SỰ SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA VỚI MỘT SỐ GIỐNG DÊ KHÁC BẰNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính Quy Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Lớp : 45-CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2013 - 2017 Ngƣời hƣớng dẫn : TS Dƣơng Văn Cƣờng ThS Ma Thị Trang Thái Nguyên, năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành đƣợc tốt khóa luận tốt nghiệp ngồi nỗ lực cá nhân, tơi nhận đƣợc hƣớng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cơ, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo: TS Dƣơng Văn Cƣờng, Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, ThS Ma Thị Trang cán Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên tận tình bảo, trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ suất thời gian thực đề tài nhƣ q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên, thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ, anh chị làm việc Bộ môn Sinh học Phân Tử công nghệ Gene - Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln ủng hộ, động viên, chia sẻ giúp đỡ để tơi vƣợt qua khó khan q trình học tập hồn thành luộn văn Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Phƣơng Nam ii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các mẫu dê Nản nghiên cứu .18 Bảng 3.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR .19 Bảng 3.3 Danh mục thiết bị đƣợc sử dụng 19 Bảng 3.4 Danh mục loại hóa chất đƣợc sử dụng .20 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR .22 Bảng 4.1: Kết đo độ tinh DNA 25 Bảng 4.2 Vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI 10 mẫu dê Nản mẫu NCBI 31 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Dê Nản xã Kim Phƣợng huyện Định Hóa .5 Hình 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số dê Nản 24 Hình 4.2 Kết PCR thị COI mẫu dê Nản 25 Hình 4.3: Kết giải trình tự thị COI mẫu Dê Nản theo giá trị QV 27 Hình 4.4 Kết kiểm tra sai khác lần lặp lại thí nghiệm .28 Hình 4.5: Kết BLAST thị COI mẫu D42 với thị COI Capra aegagrus hircus công bố NCBI .29 Hình 4.6: So sánh vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI 10 mẫu nghiên cứu với thị COI NCBI 30 Bảng 4.3 Hệ số tƣơng đồng phân tích trình tự gene COI mẫu dê Nản với trình tự ngân hàng mã vạch DNA (BOLD) 32 Hình 4.7: Cây phân loại dựa trình tự thị COI dê Nản mẫu dê giới .33 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt BLAST Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair – cặp bazơ nitơ COI Cytochrome C oxidase Subutnit I DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate dATP DeoxyAdenine Triphosphate dCTP DeoxyCytosine Triphosphate dGTP DeoxyGuanine Triphosphate dTTP DeoxyThymine Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate ddATP DideoxyAdenine Triphosphate ddCTP DideoxyCytosine Triphosphate ddGTP DideoxyGuanine Triphosphate ddTTP DideoxyThymine Triphosphate EDTA Etilendiamin tetraaxetic acit Kb Kilo base – Kilo bazo nito NCBI Nation Cetrer for Biotechnology Information (trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học) PCR Polymerase Chain Recation QV Quality value v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv PHẦN : 1MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài .3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU .4 2.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Nguồn gốc Dê .4 2.1.2 Vị trí phân loại Dê 2.2 Cơ sở khoa học đề tài 2.2.1 Giới thiệu công nghệ mã vạch DNA 2.2.2 Mã vạch DNA sử dụng xác định loài động vật thực vật 2.2.2.1 Mã vạch DNA thực vật .7 2.2.2.2 Mã vạch DNA động vật 2.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 10 2.4 Phƣơng pháp điện di DNA gel agarose 11 2.5 Kỹ thuật PCR .12 2.6 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 12 2.7 Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch gene nƣớc .13 2.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 16 vi PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 19 3.2.1 Thiết bị .19 3.2.2 Hóa chất 20 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.4 Nội dung nghiên cứu 20 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.5.1 Lấy mẫu mô tai 21 3.5.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số .21 3.5.3 Phƣơng pháp PCR 22 3.5.4 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 23 3.5.5 Phân tích liệu 23 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết tách DNA tổng số 24 4.2 Kết PCR khuếch đại thị COI mẫu .25 4.3 Kết phân tích thị DNA bacoding 26 4.3.1 Kết phân tích chất lƣợng giải trình tự 26 4.3.2 Kết phân tích thị COI 28 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị .34 I.Tài liệu tham khảo tiếng việt 35 II Tài liệu tham khảo tiếng anh 35 III Tài liệu từ internet .37 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ở Việt Nam chăn nuôi ngành quan trọng, chiếm tỷ trọng cao kinh tế Trong năm qua, bên cạnh việc phát triển chăn ni trâu, bò Nhà nƣớc quan tâm đến phát triển chăn ni dê Vì ngành chăn nuôi dê nƣớc ta ngày phát triển, cần vốn, quay vòng nhanh, tận dụng đƣợc lao động thích hợp với vùng miền núi nơi điều kiện kinh tế ngƣời dân khó khăn Chăn nuôi dê cung cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống ngƣời nhƣ: thịt, sữa, lông, da, sừng, móng cung cấp nguồn phân bón lớn phục vụ cho sản xuất nông nghiệp Sữa dê cung cấp nguồn protein quan trọng cho ngƣời, đặc biệt sữa dê nhiễm khuẩn lao nhƣ sữa bò [6] Theo Tổng cục Thống kê, số đầu dê năm 2015 toàn vùng trung du miền núi phía Bắc đạt 898.295 con, chiếm 51,6% tổng đàn dê nƣớc Trong chiếm phần lớn loại dê có nguồn gốc từ Ấn Độ (Barbari, Jamunapari, Beetal), từ Pháp, Mỹ, Úc (Saanen, Alpine, Boer) [24] Các loại dê có khối lƣợng sữa trọng lƣợng thể lớn số giống dê địa nên đƣợc nuôi dƣỡng cho lai với giống dê địa nƣớc ta Điều dẫn đến số lƣợng dê địa dần bị giảm đi, bị lai tạp với giống dê khác làm số nguồn gene quý, dê Nản Định Hóa ví dụ Định Hóa huyện miền núi phía Tây Bắc tỉnh Thái Nguyên với địa hình chiếm phần lớn đồi núi dãy núi đá vôi hiểm trở, phù hợp với việc chăn thả dê, đặc biệt với dê cỏ Chính huyện Định Hóa hay nói xác khu vực quanh dãy núi Nản ngƣời dân có truyền thống lâu đời chăn nuôi dê, nên hình thành giống dê Nản mang thƣơng hiệu riêng khu vực Dê Nản chất lƣợng thịt tốt thơm ngon, tỷ lệ nạc cao, chịu đựng mức dinh dƣỡng thấp loại dê khác có khả sinh trƣởng phát triển nhanh, đặc biệt dê Nản có khả sinh trƣởng tốt điều kiện thời tiết bất lợi, thích nghi với điều kiện tự nhiên sẵn có huyện Định Hóa Giá thành thịt dê Nản cao, nhƣng số lƣợng dê Nản lại khơng đủ đáp ứng nhu cầu thị trƣờng Theo số lƣợng thống kê sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Thái Nguyên, thời điểm tháng 10 năm 2015 đàn dê ni huyện Định Hóa có 18.404 con, chủ yếu dê lai, đàn dê Nản (Ƣớc khoảng 2.000 con) Vì số lƣợng Dê nản nên dễ bị lai tạp với loại dê khác, gây nguồn gene quý nên cần có biện pháp phân biệt để bảo tồn Các phƣơng pháp phân loại học tuyền thống hình thái, sinh lý, hóa sinh có ƣu điểm nhanh chóng đơn giản song lại phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm điều tra viên nên thiếu tính xác dẫn đến có nhiều nhầm lẫn Với tiến kĩ thuật di truyền, phƣơng pháp mã vạch DNA trở thành cụ hỗ trợ cho phƣơng pháp truyền thống để đƣa kết cuối cách xác Hiện nay, vùng gene COI nằm ti thể đƣợc coi vùng gene chuẩn xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng loài động vật đƣợc công nhận tổ chức mã vạch quốc tế [25] Xuất phát từ lý lựa chọn đề tài “Xác định sai khác di truyền dê Nản Đinh Hóa với số giống dê khác phương pháp mã vạch DNA” 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định sai khác di truyền dê Nản Đinh Hóa với số giống dê khác mã vạch DNA 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Khuếch đại giải trình tự thị COI (Cytochrome C oxidase Subutnit I) - Xác định sai khác di truyền dê Nản Định Hóa số giống dê khác 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Kết đề tài bổ sung liệu cho nguồn gene dê mở triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học phân loại định danh loài 33 Hình 4.7: Cây phân loại dựa trình tự thị COI dê Nản mẫu dê giới Cây phân loại thể mối quan hệ di truyền 10 mẫu nghiên cứu mẫu giới Các mẫu phân tích đƣợc chia làm nhóm lớn nhóm I gồm có mẫu giới mẫu nghiên cứu, nhóm II có mẫu D3 (Hình 4.7) Các mẫu nhóm I đƣợc chia làm nhóm nhỏ Ia Ib, Ib có mẫu D9 Ia mẫu giới mẫu nghiên cứu lại Sự phân chia nhóm vị trí nucleotide khác biệt mẫu khơng cố định nhóm lồi Nhìn vào di truyền ta thấy khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu nhỏ, có quan hệ gần với mẫu dê giới 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Tách chiết đƣợc DNA tổng số từ 10 mẫu mơ tai dê Nản Định Hóa - Đã khếch đại đƣợc thị COI 10 mẫu dê phƣơng pháp PCR - Chỉ thị COI 10 mẫu dê nghiên cứu có kích thƣớc khoảng 750bp - Chỉ thị COI 10 mẫu nghiên cứu mẫu dê giới có 10 vị trí sai khác (nucleotide số:15; 20; 27; 228; 336; 390; 615; 643; 669; 671) - Dựa phân tích thị COI, hệ số tƣơng đồng mẫu nghiên cứu mẫu giới dao động khoảng từ 99,4 -100% Hệ số sai khác mẫu nghiên cứu từ 0-0.6% Do dê Nản Định Hóa khơng có sai khác di truyền đáng kể so với giới 5.2 Kiến nghị - So sánh thêm với giống dê khác Việt Nam - Tiếp tục nghiên cứu thêm thị hình thái mẫu dê Nản để bổ sung sở cho việc phân loại - Kết hợp với thị mã vạch DNA khác, tăng số lƣợng mẫu nghiên cứu để tăng sở cho phân loại dê Nản 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tham khảo tiếng việt Dƣơng Văn Tăng, Vũ Đình Duy, Trần Thị Việt Thanh (2014) “Đánh giá khả sử dụng mã vạch COI việc định loại động vật bảo tang thiên nhiên Việt Nam”: Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở kỹ thuật di truyền kỹ thuật gen, Nxb Khoa học kĩ thuật Hà Nội, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2012), Cơ sở Di Truyền Phân Tử Kỹ Thuật Gene, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Phƣơng Thảo Dƣơng Thúy Yên (2015), “So sánh đặc điểm hình thái DNA mã vạch hai loài cá bống trân Butis butis Butis humeralis”, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ Phạm Thị Trang Nhung Dƣơng Thúy Yên (2014), “Đánh giá đa dạng di truyền dòng cá rơ đồng thị phân tử RAPD ISSR”, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ Trần Trang Nhung (2005), Giáo trình ni dê, Nxb Nơng Nghiệp, Hà Nội Trần Thị Việt Thanh, Vũ Đình Duy, Nguyễn Minh Tâm (2015), “Sử dụng mã vạch DNA (DNA barcodes) việc xác định mẫu chim bảo tàng thiên nhiên Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 37(4): 429-436 II Tài liệu tham khảo tiếng anh Aron J Fazekas Maria L Kuzmina, Steven G Newmaster, Peter M Hollingsworth (2012),"DNA barcoding Methods for Land Plant" G Heubl (2013) "DNA-Based Authentication of TCM-Plants: Current Progress and Future Perspectives", Department Biologie I – Systematische Botanik, LMU Muănchen, Menzingerstr 67, 80638 Muănchen, Germany 10 H.Janzen, Daniel (2009), "A DNA barcode for land plants", University of Pennsylvania, Philadenlphia 11 Hebert (2008) "DNA barcoding: CO1 DNA barcoding amphibians: take the chance, meet the challenge", Mol Ecol Resour 8(2) 235-246 36 12 Hebert Paul (2003), "Biological identifications through DNA barcodes", Proc Biol Sci, 313-321 13 Hebert, Ratnasingham, de Waard (2003), "Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species", Proc Biol Sci 270 Suppl 1: S96-99 14 Joana Costa et al Bruna Campos, Joana S Amaral, M Eugénia Nunes, M Beatriz P.P Oliveira, Isabel Mafra (2015), "HRM analysis targeting ITS1 and matK loci as potential DNA mini-barcodes for the authentication of Hypericum perforatum and Hypericum androsae" 15 Luo, Zhang et al (Ho, Xu, Shi, Cameron, Zhu) (2011), "Potential efficacy of mitochondrial genes for animal DNA barcoding: a case study using eutherian mammals" BMC Genomics 12: 84 16 R N Mishra and D Joshi "Jiao Gu Lan (2011), "Gynostemma pentaphyllum: The Chinese Rasayan- Current Research Scenario", International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences: 470228 17 Techen, Parveen, Pan, Khan (2014), "DNA barcoding of medicinal plant material for identification", Curr Opin Biotechnol 25: 103-110 18 Sujeevan Ratnasingham and P D N Hebert (2007) "BARCODING BOLD : The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org) " Molecular Ecology Notes: 1-10 19 Locke SA, Al-Nasiri AR, McLaughlin JD, Nie FS, Caffara M, Drago P, Overstreet F, Kalbe RM, Souza M, Lapierre GT, Takemoto RM, Marcogliese DJ (2015), “Diversity, specificity and speciation in larval Diplostomidae (Platyhelminthes: Digenea) in the eyes of freshwater fish, as revealed by DNA barcodes”, Int J Parasitol, 45(13):841-55 20 Mariana L Lyra, Célio F B Haddad, Ana Maria L de Azeredo-Espin (2016), “Meeting the challenge of DNA barcoding Neotropical amphibians: polymerase chain reaction optimization and new COI primers”, Molecular Ecology Resources 37 21 Emre Keskin, Sevan Ağdamar, Ali˙ Serhan Tarkan (2012), “DNA barcoding common non-native freshwater fish species in Turkey: Low genetic diversity but high population structuring”, Mitochondrial DNA 22 Locke SA, McLaughlin JD, Dayanandan S, Marcogliese DJ (2010), Diversity and specificity in Diplostomum spp metacercariae in freshwater fishes revealed by cytochrome c oxidase I and internal transcribed spacer sequences”, Int J Parasitol, 40(3):333-43 23.Shilin Chen, et al (2010) "Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species." PLoS One 5(1): e8613 III Tài liệu từ internet 24 Giải pháp phát triển chăn nuôi gia súc tỉnh miền núi phía Bắc – Mở rộng diện tích trồng cỏ (08/10/2015) http://www.khuyennongvn.gov.vn/vi-VN/hoatdong-khuyen-nong/chuyen-giao-tbkt/giai-phap-phat-trien-chan-nuoi-gia-suc-ocac-tinh-mien-nui-phia-bac-mo-rong-dien-tich-trong-co_t114c30n12928 25 http://www.barcodeoflife.org 26 “Automated DNA Sequencing Chemistry Guide.” http://www.bioscienceresearch.co.nz/downloads/files/DNA_sequencing /ABI_Seq_ Ref_Guide.pdf 38 Phụ Lục Hình 1: Kết giải trình tự thị COI mẫu D2 39 Hình 2: Kết giải trình tự thị COI mẫu D3 40 Hình 3: Kết giải trình tự thị COI mẫu D9 41 Hình 4: Kết giải trình tự thị COI mẫu D42 42 Hình 5: Kết giải trình tự thị COI mẫu D44 43 Hình 6: Kết giải trình tự thị COI mẫu D46 44 Hình 7: Kết giải trình tự thị COI mẫu D63 45 Hình 8: Kết giải trình tự thị COI mẫu D68 46 Hình 9: Kết giải trình tự thị COI mẫu D78 47 Hình 10: Kết giải trình tự thị COI mẫu D81 ... tài Xác định sai khác di truyền dê Nản Đinh Hóa với số giống dê khác phương pháp mã vạch DNA 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định sai khác di truyền dê Nản Đinh Hóa với số giống. .. HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN PHƢƠNG NAM Tên đề tài: XÁC ĐỊNH SỰ SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA VỚI MỘT SỐ GIỐNG DÊ KHÁC BẰNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính... với số giống dê khác mã vạch DNA 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Khuếch đại giải trình tự thị COI (Cytochrome C oxidase Subutnit I) - Xác định sai khác di truyền dê Nản Định Hóa số giống dê khác 1.3 Ý