BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN TRÊN ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV) Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực NGUYỄN XUÂN THẮNG Niên khóa 2009 – 2013 Tháng 06/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN TRÊN ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN XUÂN THẮNG Tháng 06/2013 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến mẹ anh chị, người yêu thương, quan tâm, động viên tạo điều kiện cho học tập Gia đình bên chỗ dựa vững “Công cha nghĩa mẹ ơn thầy” Thầy ln người lái đị tận tụy giúp tơi dịng sơng kiến thức dìu dắt qua năm đại học Tôi xin cảm ơn Thầy Cô trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Cơng nghệ sinh học tận tình giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm quý báu năm học trường tạo cho nguồn động lực nghiên cứu khoa học Thầy cô cho kiến thức chun mơn mà cịn truyền đạt cho cách đối nhân xử thế, kinh nghiệm sống quý báu Tôi xin chân thành biết ơn dạy dỗ tận tình tập thể thầy trường thầy cô qua đời Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:  PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình dạy bảo, hướng dẫn thực hiên đề tài  Chị Vương Thị Thúy Vi, anh Võ Tấn Hùng, anh Võ Khánh Hưng, anh Nguyễn Phan Thành …đã giúp đỡ truyền đạt cho kinh nghiệm quý báu suốt q trình tơi thực đề tài Bốn năm đại học cho tơi có người bạn tốt Các bạn bên cạnh, chia sẻ giúp đỡ nhiều Đời sinh viên tơi thật có ý nghĩa tuyệt vời có bạn: tập thể lớp DH09SH, anh chị cựu sinh viên BM CNSH, tập thể KTX phòng 16C/C, anh chị em BM CNSH động viên, giúp đỡ tơi nhiều q trình học tập thực đề tài … Xin chân thành cảm ơn nhớ bạn thân yêu Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013 Nguyễn Xuân Thắng i TĨM TẮT Việc phân tích di truyền PRRS có ý nghĩa quan trọng dịch tễ học Từ thơng tin di truyền PRRS xác định nguồn gốc phát sinh dịch bệnh, biến đổi di truyền xảy dịch bệnh Đề tài “Phân tích biến đổi di truyền đoạn gen mã hóa protein NSP2 vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRSV)” tiến hành, mục đích khảo sát biến chủng biến đổi thông tin di truyền chủng PRRS Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu kiểm sốt phịng chống dịch bệnh PRRS Hai mươi mẫu bệnh phẩm sử dụng xét nghiệm cho kết mẫu dương tính kĩ thuật RT-PCR Cả chủng phân tích xây dựng di truyền để so sánh biến đổi di truyền Cả mẫu khảo sát dương tính có đột biến đoạn gene NSP2 rõ rệt Nhóm chủng HP-PRRS 2007: SDH1 SH1H1 có tỉ lệ tương đồng với chủng JXA1 cao (98,7-99,2 %) Đây chủng có trình tự aa tương ứng đột biến so với chủng lại (lần lượt aa aa) Chủng 3DN3 có đột biến trình tự aa tương ứng lớn (25 đột biến thay thê) đặc biệt có đột biến Cystein (C) Arginine (R) ảnh hưởng cấu trúc protein Chủng H2 chủng thuộc nhóm HP-PRRS 2010 (độ tương đồng 97 – 97,6 %), có đột biến 12 nu (tương đương aa Proline, Leucine, Asparagine Phenylalanine) 16 đột biến thay aa khác, Hai chủng DN1 DN2 nằm nhóm chủng HP-PRRS, có tỉ lệ tương đồng cao với chủng tham khảo JXA1 (92,3 – 92,6 %) Hai chủng DN1 DN2 có đột biến lớn trình tự aa với 29 30 đột biến điểm thay đổi so với trình tự aa tương ứng gene NSP2 Cả chủng có đột biến rõ rệt trình tự nucleotide trình tự acid amin tương ứng đoạn gene NSP2 ii SUMMARY PRRS genetic analysis is very important in epidemiology Source and genetic variation of disease can be identified from PRRS genetic information Thesis "Analysis genetic variation on NSP2 protein encoding gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV)" was conducted to examine strains and genetic variation of Viet Nam PRRS strains for PRRS prevention and control studies positives in 20 disease samples detected by using RT-PCR technique were analyzed and built phylogenetic tree to compare genetic variation NSP2 genes mutations were clear on positive samples and divided into groups Strains HP-PRRS 2007 group: SDH1, SH1H1 and JXA1 strains had high degree of similarity (98.7-99.2 %) Amino acid sequence mutations of SDH1 SH1H1 were less than others (4 amino acid and amino acid respectively) 3DN3 strain was also in HPPRRS 2007 branch Amino acid sequence mutations of this strain was high (25 replacement mutations), specialy amino acid sequence mutations of this strain was high (25 replacement mutations), specialy cysteine mutant (C) with arginine (R) may affect protein structure H2 strain is strains of HP-PRRS 2010 group (degree of similarity 97 – 97.6 %), it has 12 nucleotide loss mutation (equivalent to amino acid: Proline, Leucine, Asparagine and Phenylalanine) and 16 other amino acid replacement mutations, DN1 and DN2 strains were in HP-PRRS strain branch, these were similar to JXA1 reference strain (similarity degree: 92.3 - 92.6%) Compared with the corresponding amino acid sequence of the gene NSP2, DN1 and DN2 strains had 29 and 30 point mutations All of strains had clear nucleotide and acid amin sequences mutations on NSP2 gene iii MỤC LỤC Lời cảm ơn .i  Tóm tắt ii  Summary iii  Mục lục iv  Danh sách chữ viết tắt vi  Danh sách bảng vii  Danh sách hình viii  Chương MỞ ĐẦU 1  1.1.  Đặt vấn đề 1  1.2.  Mục tiêu đề tài 2  1.3.  Nội dung thực 2  Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  2.1.  Một số thông tin Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) 3  2.2  Tác nhân gây bệnh 7  2.3  Triệu chứng bệnh 8  2.4  Cấu trúc gen PRRSV 9  2.4.1  Tổ chức gen PRRSV 9  2.4.2  Protein không cấu trúc NSP2 11  2.5  Các phương pháp phát PRRSV 14  2.6  Phương pháp RT-PCR 17  2.7  Phương pháp Giải trình tự gene xây dựng di truyền 18  2.8  Các nghiên cứu gene mã hóa Protein NSP2 nước giới 20  Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22  3.1.  Thời gian địa điểm 22  3.2.  Vật liệu hóa chất 22  3.2.1.  Vật liệu sinh học 22  3.2.2.  Dụng cụ thiết bị 22  3.2.3.  Hóa chất 22  3.3.  Phương pháp nghiên cứu 24  iv 3.3.1.  Ly trích RNA virus PRRS 24  3.3.2.  Khuếch đại vùng chứa đoạn NSP2 RT-PCR 25  3.3.3.  Giải trình tự đoạn gen mã hóa protein NSP2 PRRSV 27  3.3.4.  Phân tích trình tự di truyền chủng PRRSV 27  Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31  4.1.  Kiểm tra primer 31  4.2.  Kết chạy RT-PCR mẫu thực địa PRRS 34  4.3.  Phân tích trình tự di truyền mẫu nghiên cứu 35  4.4.  Phân tích trình tự acid amin từ trình tự di truyền mẫu nghiên cứu 39  Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42  5.1.  Kết luận 42  5.2.  Đề nghị 43  TÀI LIỆU THAM KHẢO  PHỤ LỤC  v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus ORF Open Reading Frame NSP None Structure RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction IOE Institute Of Export FAO Food and Agriculture Organization MDS Mistery Disease of Swine PEARS Porcine Endemic Abortion And Respiratory Syndrome BED Blue Ear Disease HP-PRRS Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EU Europe NA North America PCV Porcine Circovirus type GP Glycoprotein EAV Office International des Epizooties EDTA Ethidium Tetra Acetat IPMA Immuno Peroxidase Monolayer Assay cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid aa Amino acid nu Nucleotide vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Chức ORF PRRSV 10 Bảng 3.1 Trình tự cặp primer khuếch đại vùng chứa đoạn NSP2 PRRSV 26 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 28 Bảng 3.4 Các chủng virus mẫu bệnh phẩm giải trình tự 29 Bảng 3.5 Các chủng virus tham chiếu Việt Nam 30 Bảng 3.6 Các chủng virus tham chiếu giới 30 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Dịch PRRS Mỹ tính tới tháng 10 năm 2012 Hình 2.2 Sự lây lan dịch PRRS Đông Nam Á từ năm 2007 tới năm 2010 Hình 2.3 Đại thực bào trước sau nhiễm PRRSV Hình 2.4 Triệu chứng bệnh heo nhiềm PRRS Hình 2.5 Cấu trúc gen virus PRRS 10 Hình 2.6 Biểu đồ giả định protein NSP2 PRRSV 12 Hình 2.7 Xây dựng chủng VR-2332 có NSP2 đột biến 13 Hình 2.8 Sảy thai, thai chết lưu giai đoạn thai kì khác bệnh PRRS 15 Hình 2.9 Sơ đồ khối giải trình tự mao quản 19 Hình 2.10 Sơ đồ khối máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA 19 Hình 4.1 Kết Align primer NSP2 với chủng PRRS tham khảo genbank 32 Hình 4.2 Kết kiểm tra primer với mẫu PRRS phản ửng RT-PCR 33 Hình 4.3 Trình tự gen vùng NSP2 PRRSV Việt Nam 34 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm RT-PCR 35 Hình 4.5 Kết Align mẫu giải trình tự với mẫu genbank 36 Hình 4.6 Cây di truyền PRRSV dựa trình tự ORF1a mã hóa protein NSP2 38 Hình 4.7 Align trình tự protein chủng khảo sát BioEdit 40 viii aa leucine (vị trí aa 482) đột biến quan trọng biến chủng HPPRRS so với PRRS Bắc Mỹ cổ điển bên cạnh đột biến liên tiếp 29 aa (Titan ctv, 2007) Vì đột biến aa chủng H2 liên quan trực tiếp tới độc lực NSP2 quy định, proline leucine 10 loại acid amin sinh protein thường nằm cấu trúc trung tâm vòng xoắn (Nguyễn Tiến Thắng, 2005) Ngoài chủng thể nhiều đột biến điểm So sánh với protein NSP2 chủng JXA1 – chủng vaccine dịng Trung Quốc năm 2009 protein chủng 3DN3 có 25 đột biến điểm thay đổi aa, protein chủng DN1 có 29 đột biến điểm thay đổi aa, protein chủng DN2 có tới 30 đột biến điểm thay đổi aa, protein chủng SH1H1 có đột biến điểm thay đổi aa, protein chủng H2 có 16 đột biến điểm thay đổi aa cịn protein chủng SDH2.1 có số lượng đột biến thay đổi aa thấp với đột biến điểm vùng khảo sát NSP2 Tất đột biến không liên tục mà có dàn khắp vùng NSP2 Các đột biến cho thấy thay đổi cấu trúc di truyền PRRS tồn Việt Nam rõ rệt Hai chủng DN1 DN2 chủng có nhiều thay đổi trình tự aa Đặc biệt chủng DN1 DN2 có đột biến gần tương tự mà đột biến thay đổi kép aa liên tiếp đột biến thay đổi aa liên tiếp Sự thay đổi thành phần DNA DN1 DN2 không nhiều ảnh hưởng lớn đến ba khung đọc dịch mã, dẫn đến thay đổi nhiều trình tự aa, điều quan trọng với virus thơng qua biểu tính trạng protein ảnh hưởng tới độc tính virus nhiều Cùng mẫu thực địa Đồng Nai, chủng 3DN3 có thay đổi lớn trình tự aa, khơng lớn chủng DN1 DN2 lại có nguy cao thay đổi di truyền Đầu tiên đột biến thay Cystein (C) Arginine (R) Đây đột biến quan trọng ảnh hưởng tới liên kết S-S cấu trúc bậc bậc protein Chắc chắn sau thay đổi này, protein NSP2 chủng 3DN3 thay đổi cấu trúc tạo cầu nối S-S vị trí aa thứ 74 Với 25 đột biến điểm đột biến hoàn toàn khác so với chủng DN1 DN2 nên chủng có biến đổi lớn khác biệt 40 Chủng H2 chủng có nhiều thay đổi trình tự acid amin với 16 đột biến thay đổi aa đột biến aa Đây nguy lớn thay đổi di truyền độc lực PRRSV thời gian tới chủng SH1H1 SDH2.1 có thay đổi protein (lần lượt đột biến thay aa aa) Điều chứng tỏ biến đổi di truyền nucleotide có nhiều đột biến vơ nghĩa chưa ảnh hưởng lớn đến thay đổi trình tự amino acid tương ứng virus khảo sát Long An Và đợt dịch 03/2013 vừa qua bùng phát virus đợt dịch HP-PRRS cũ năm 2006, HPPRRS năm 2010 hay 2012 Dựa kết khảo sát trình tự nucleotide aa tương ứng cho thấy PRRS có thay đổi thơng tin di truyền, ẩn chứa nhiều nguy xuất chủng virus mới, gia tăng độc lực có khả kháng lại miễn dịch tiêm vaccine 41 Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua xét nghiệm 20 mẫu bệnh phẩm tỉnh Đồng Nai, Long An TPHCM khẳng định mẫu dương tính qua RT-PCR, chúng tơi có số kết luận sau: Cả mẫu khảo sát dương tính có độ tương đồng cao so với chủng tham khảo JXA1 (93 – 99,2 %) chia thành nhóm chủng nhóm (1) gồm chủng 3DN3, SDH2.1, SH1H1 tương đồng cao với chủng HP-PRRS dòng Trung Quốc 2007 (92 - 98%); nhóm (2) gồm chủng DN1, DN2 Hai chủng nằm so với HP-PRRS 2007 PRRS dịng Bắc Mỹ di truyền Nhóm (3) chủng H2 có độ tương đồng cao với chủng HP-PRRS năm 2010 (97 – 97,6 %) Trình tự amino acid tương ứng với trình tự nucleotide đoạn gene NSP2 chủng khảo sát có biến đổi khác so với chủng tham khảo JXA1 Các chủng nhóm (1) có khác biệt: chủng SDH1 SH1H1 khơng có thay đổi nhiều so với chủng tham khảo JAX1 3DN3 có khác biệt lớn trình tự aa, với 25 đột biến điểm đặc biệt có đột biến Cystein (C) Arginine (R) ảnh hưởng tới cấu trúc protein Nhóm (2) gồm chủng DN1 DN2 có đột biến lớn trình tự aa với 29 30 đột biến thay amino acid Nhóm (3) gồm chủng H2 có đột biến 12 nu (tương ứng aa Proline, Leucine, Asparagine Phenylalamin) đột biến thay 16 aa Phân tích trình tự gene chủng PRRS khảo sát cho thấy chủng có đột biến rõ rệt trình tự nucleotide trình tự acid amin tương ứng Các đột biến mang theo nguy lớn xuất nhiều chủng PRRS tương lại gần 42 5.2 Đề nghị Trong đề tài thực khảo sát PRRS số địa phương, mức độ khảo sát chưa nhiều, chưa cao nhiều vấn đề cần phải tiếp tục nghiên cứu thêm như:  Khảo sát đồng nhiễm PRRS dòng Trung Quốc, Bắc Mỹ cổ điển, PRRS chủng EU ảnh hưởng đến biến đổi di truyền đoạn NSP2 chủng HP-PRRS Việt Nam  Mở rộng vùng khảo sát nghiên cứu rộng hơn, nhằm so sánh xác phát triển chủng PRRS có mặt Việt Nam, đặc biệt vùng vừa có dịch, vùng cận dịch vùng chưa có dịch  Tiếp tục phân tích so sánh khác biệt chủng Việt Nam với chủng vaccine để có biện pháp đối phó với dịch xảy 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 10 11 12 13 14 15 Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học Thú Y Nhà xuất Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh Cục Chăn Ni 2008 Báo cáo sản xuất chăn nuôi vùng Đông Nam Bộ Cục Thú Y 2011 Thơng tin tình hình dịch bệnh gia súc gia cầm Phòng Dịch Tễ - Cục Thú Y 2007 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Trần Thị Bích Liên 2008 Bệnh tai xanh heo NXB Nơng nghiệp, Tp.HCM Quyền Đình Thi Nơng Văn Hải 2008 Công nghệ Sinh học – Tập Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ Phạm Hùng Vân 2009 PCR Real time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y Dược chi nhánh TPHCM Trần Thị Dân, Nguyễn Ngọc Tuân 2012 Hiểu biết đối phó với Bệnh tai xanh (PRRS) http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1780 Nguyễn Tiến Thắng 2005, Hóa protein, NXB Đại học Quốc gia TP HCM Trần Thị Dân, 2012 Đặc điểm đợt dịch PRRS kết giải pháp kiểm soát bệnh Việt Nam http://www.ildex.com.vn/doc_viewer.aspx? fileName =/upload/document/10PRRSTranThiDan-VN.pdf Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, Nguyễn Ngô Minh Triết 2000, “Bước đầu khảo sát hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) số trại heo giống thuốc vùng TP Hồ Chí Minh”, Báo cáo khoa học chăn nuôi - thú y 1999 - 2000, Phần Thú Y Trần Thị Bích Liên Trần Thị Dân 2007 Xác định tỷ lệ nhiễm chủng virút PRRS số sở chăn nuôi heo miền Đơng Nam Bộ Tạp chí KHKT Thú y tập XIV - số 6: 5-9 Phan Trung Nghĩa 2010 Bệnh heo tai xanh biện pháp phòng chống http://sonongnghiep.bentre.gov.vn/chn-nuoi/phong-tr-dch-bnh/326-bnh-heo-taixanh-va-cac-bin-phap-phong-chng.html Võ Khánh Hưng 2009 Phân tích trình tự gen ORF5 ORF7 virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) số tỉnh miền Nam Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Phan Thị Anh Văn 2010 Phân tích trình tự vùng mã hóa protein NSP2 vi rút PRRS genotype Bắc Mỹ xác định Tp Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 16 Nguyễn Ngọc Hải Võ Khánh Hưng 2010a Phân tích di truyền số chủng vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRSV) Tp.Hồ Chí Minh Đồng Nai Kỷ yếu hội nghị khoa học trẻ lần 7/2010, 75 – 80 17 Nguyễn Ngọc Hải Võ Khánh Hưng 2010b Phân tích di truyền số chủng virut gây hội chứng PRRS heo số tỉnh miền Nam dựa ORF7 Tạp chí KHKT Thú y tập 17 – số 1, 25 – 33 18 Nguyễn Văn Chí 2011 Ứng dụng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen nhằm định lượng định chủng vi rút gây bệnh rối loạn sinh sản hơ hấp heo (PRRSV) Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 19 Phan Châu Huy 2012 Xây dựng quy trình real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman phát định lượng vi rút gây rối loạn sinh sản hô hấp chủng Trung Quốc heo Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 20 Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Tùng, Nguyễn Đăng Thọ, Tống Hữu Hiến cs, 2008 Điều tra lưu hành hội chứng sinh sản hô hâp (PRRS) đàn lợn số tỉnh Việt Nam Trung tâm Chẩn đoán thú y trung ương Tài liệu nước 21 OIE Terrestrial Manual 2010 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome 22 FAO Transboundary Animal Diseases Bulletin Empres No 37-2011 23 Egli C., Thür B., Liu L., Hofmann M.A 2001 Quantitative TaqMan® RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 98:63–75 24 FAO 2007 Transboundary Animal Diseases Bulletin Empres No 25 National Pork Board PRRS Inactive Reseach 2004 – 2011 26 Wang X., Eaton M., Mayer M., Li H., He D., Nelson E.and J Christopher Hennings 2007 Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virusproductively infects monocyte-derived dendritic cells and compromises their antigene-presenting ability Arch Virol 152: 289–303 27 Li Y., Xue C., Wang L., Chen X., Chen F., Cao Y 2010 Genome analysis of two Chinese strains of porcine reproductive and respiratory syndrom viruses with different virulence Virus Genees, Springer 28 Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., Pirzadeh B., Rogan D 2000 Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145: 659–688 Zhang H and H Kono 2012 Economic Impacts of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS) Outbreak in Vietnam Pig Production Tropical Agricultural Research Vol 23: 152– 159 FAO 2011 Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virulence jumps and persistent circulation in Southeast Asia Empres No OIE 2008 PRRS: the disease, its diagnosis, prevention and control Paris, 9-11 OIE Terrestrial Manual 2010 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Oleksiewicz M.B., Bøtner A., Madsen K.G., Storgaard T 1998 Sensitive detection and typing of Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virusby RT-PCR amplification of whole viral genes Veterinary Microbiology 64: 7-22 Tian K., Yu X., Zhao T., Feng Y., Cao Z., 2007 Emergenece of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS ONE 2:526 Snijder, E J., Wassenaar A L M and W J M Spaan 1994 Proteolytic arterivirus NSP2 protease An unusual cysteine protease with primary structure similarities to both papain-like and chymotrypsin-like proteases J Bol Chem 270:16671-16676 Klaas Dietze, Julio Pinto, Sherrilyn Wainwright, Christopher Hamilton, Sergei Khomenk 2011 Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virulence jumps and persistent circulation in Southeast Asia Empress FAO Snijder E J., van Tol H., Roos N and K W Pedersen 2001 Non-structure protein and interact to modify host cell membranes during the formation of the artervirus replication complex J Gen Virol 82:985-994 Lurchachaiwong W., Payungporn S., Srisatidnarakul U., Mungkundar C., Theamboonlers A., Poovorawan Y 2008 Rapid detection and strain identification of Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus(PRRSV) by real-time RT-PCR Journal compilation, The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology 46:55-60 Meulenberg J.J., A Petersen den Besten, E de Kluyver, A van Nieuwstadt, G Wensvoort and R.J Moormann 1997 Molecular characterization of Lelystad virus Vet Microbiol., 55:197-202 Review Meulenberg J.J., Hulst M.M., de Meijer E.J., Moonen P.L., den Besten A., Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV Virology 192:62–72 [PubMed] Rossow K.D 1998 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vet Pathol 35: 1-20 42 Tian H., Wu J., Shang Y , Cheng Y , Liu X 2010 The develop ment of a rapid SYBR one step real-time RT- PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virology Journal, 7:90 43 Egli C , Thür B., Liu L., Hofmann M A 2001 Quantitative TaqMan® RTPCR for the detection and differentiation of European and North American strains of Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus Journal of Virological Methods 98:63 –75 44 Balka G., Hornyák A., Bálint A., Benyeda Z., Rusvai M 2009 Development of a one-step real -time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 158:41 –45 45 OIE 2008 PRRS: the disease, its diagnosis, prevention and control Paris, 11 June 2008 46 Thiel HJ, Majer G., Stark R., Tautz N., Rumenapft, et al 1993, Molecular characterzation of positivestrand RNA viruses: pestiviruses and the porcine and reproductive and respiratory syndrome (PRRS) Arch Virol Suppl 7:41-52 47 Nelson EA, Christopher-Hennings J, Benfield DA 1995 Structural proteins of Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus(PRRSV) Adv Exp Med Biol 380: 321–323 48 Allende R., Lewis T.L., Lu Z., Rock D.L., Kutish G.F., Ali A., Doster A.R., Osorio F.A 1999 North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions J Gene J Virol 80:307-315 49 Bosch B J., de Haan C A M., and P J M Rottier 2004 Coconavirus spike glycoprotein, extended at the carboxy terminus with green flourecent protein, is assembly competent J Virol 78:7369-7378 50 Van der Meer Y., van Tol H., J Krijnse Locker and E J Snijder 1998 ORF1aencoded replicase subunits are involved in the membrane association of the artervirus replication complex J Virol 72:6689-6698 51 Pedersen K W., van der Meer Y., Roos N and E J Snijder 1999 Open reading frame la-encodeed subunits of the arterivirus replicase induce endoplasmic reticulum-derived double-membrane vesicles which carry the viral replication complex J Virol 73:2016-2026 52 Oleksiewics M B., A Botner, P Toft, P Normann and T Storgaard 2001 Epitope mapping Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virusby phage display: the NSP2 fragment of the replycase poly protein contents a cluster of B-cell epitopes J Virol 75:3277-3290 53 Fang Y., Kim D Y., Ropp S., Steen P., Christopher-Hennings J., Nelson E A R R R Rowland 2004 Heterogeneity in Nsp2 of European-like porcine 54 55 56 57 58 59 60 61 62 reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in the United States Virus Res 100:229–235 Nelsen C.J., Mutaugh M P., and K S Faaberg 1999 Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Viruscomparison: divergent evolution on two continents J Virol 73:270-280 Nelsen C J., Murtaugh M P K S Faaberg 1999 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents J Virol 73, 270–280 Grebennikova T V., Zaberezhny A D., Vlasova A N at al 2004 Genetic variability of the nucleocapsid protein of the virus of the porcine reproductive and respiratory syndrome Mol Gen Mikrobiol Virusol 2, 37–40 den Boon J.A., Faaberg K.S., Meulenberg J.J.M., Wassenaar A.L.M., Plagemann P.G.W., Gorbalenya A.E., Snijder E.J., 1995 Processing and evolution of the N-terminal region of the arterivirus replicase ORF1a protein: identification of two papainlike cysteine proteases, J Virol 69:4500-4505 Snijder E.J., Wassenaar A.L.M., Spaan W.J.M., Gorbalenya A.E 1995 The arterivirus Nsp2 protease An unusual cysteine protease with primary structure similarities to both papain-like and chymotrypsin-like proteases J Biol Chem 270:16671-16676 Jun Han, Gongping Liu, Yue Wang and Kay S Faaberg 2007 Indentification of Nonessential Region of the NSP2 Replicase of Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus Strain VR-2332 for Replication in Cell Culture J Virol doi: 10.1128/JV.00562-07 Shen S., Kwang J., Liu W D.X Liu 2000 Determination of the complete nucleotide sequence of a vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and identification of the Nsp2 gene with a unique insertion Arch Virol 145, 871–883 Tian K., Yu X., Zhao T., Feng Y., Cao Z., et al 2007 Emergenece of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS ONE 2:526 Feng Y., Zhao T., Tung Nguyen, Innui K., Ma Y., Hoa Nguyen, Cam Nguyen, Liu D., Anh Bui, Thanh To, Wang C., Tian K, Gao G F 2008 Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus variants, Vietnam and China, 2007 Emer Infect Diseases 14:1774-1776 63 Brown E., Lawson S., Welbon C., Gnanandarajah J., J Li, Murtaugh M P., Nelson E A., Molina R M., Jeffery Zimmerman J., Rowland R R R., and Y Fang 2009 Antibody Response to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Nonstructural Proteins and Implications for Diagnostic Detection and Differentiation of PRRSV Types I and II Clinical and Vaccine Immunology, 2009 May, 16: 628-635 64 Lei zhous, Jialong Zhang, Jingwen Zeng, Shuoyan Yin, Yanhua Li, Linnying Zheng, Xin Guo, Xinna Ge and Hanchun Yang 2009 The-30-amino-acid Deletion in the NSP2 of Highly Pathogenic Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus Emerging in china is not Related to its virulence J Virol 2678-08 65 Chengmin Wang, Bin Wu, Siad Amer, Jing Luo, Hongmei Zhang, Yunhai Guo, Guoying Dong, Baohua Zhao and Hongxuan He 2010 Phylogenetic analysis and molecular characteristics of seven variant Chinese field isolates of PRRSV BMC Microbiology 10-146 66 Xiaofang Hao, Zengjun Lu, Wendong Kuang, Pu Sun, Yu Fu, Lei Wu, Qing Zhao, Huifang Bao, Yuanfang Fu, Yimei Cao, Pinghua Li, Xingwen Bai, Dong Li and Zaixin Liu 2011 Polymorphic genetic characterization of the ORF7 gene of Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus(PRRSV) in China Virology Journal, 8:73 67 Gao Z.Q., Guo X., Yang H.C 2004 Geneomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Arch J Virol 149: 1341–1351 68 Shimizu M., Yamada S., Murakami Y., Morozumi T., Kobayashi H., Mitani K., Ito N., Kubo M., Kimura K., Kobayashi M., Yamamota K Miura Y., Yamamoto T and K Watanabe 1994 “Isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus from Heko - Heko disease of pigs”, J Vet Med Sci 56: 389 – 391 69 Murtaugh MP, Elam MR, Kakach LT 1995 Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus Arch Virol 140:1451-1460 70 Andreyev V G., Wesley R D., Mengeling, W L., Vorwald and Lager 1997 Genetic variation ang phylogenetic relationships of 22 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) field strains based on sequence analysis of open reading frame Arch Virol 142:993-1001 Tài liệu internet 71 http://vetmed.iastate.edu/vdpam/new-vdpam-employees/food-supplyveterinary-medicine/swine/swine-diseases/porcine-reproductive72 http://www.mnpork.com 73 http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp 74 http://sonongnghiep.bentre.gov.vn/chn-nuoi/phong-tr-dch-bnh/326-bnhheo-taixanh-va-cac-bin-phap-phong-chng.html 75 http://www.pigprogress.net 76 http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp 77 78 79 80 81 82 http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://vietsciences.free.fr/timhieu/khoahoc/ykhoa/prrs.htm http://www.porcilis-prrs.com http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?opt &Itemid=91 http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/PRRS http://www.pathmicro.med.sc.edu/mayer/vir-host2000.htm PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết Align trình tự khảo sát Hình 1: Kết Align trình tự khảo sát Ơ màu đỏ: Đột biến đoạn; Ô màu xanh: đột biến điểm Phụ lục 2: Trình tự aa chủng khảo sát A B C D E F Hình 2: Trình tự acid amin chủng tham khảo A: Chủng 3DN3, B: Chủng DN1, C: Chủng DN2, D: Chủng H2 E:Chủng SDH2.1, F: chủng SH1H1 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN TRÊN ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN NSP2 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG... tễ học Từ thông tin di truyền PRRS xác định nguồn gốc phát sinh dịch bệnh, biến đổi di truyền xảy dịch bệnh Đề tài ? ?Phân tích biến đổi di truyền đoạn gen mã hóa protein NSP2 vi-rút gây hội chứng. .. tự mã hóa NSP2 vùng có liên quan đến độc lực virus PRRS ORF5 ORF7 Nhằm xác định khả biến đổi di truyền PRRSV, đề tài ? ?Phân tích biến đổi di truyền đoạn gen mã hóa protein NSP2 virus gây hội chứng