BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - NGUYỄN BẢO CHÂU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ MÙN CƯA LÀM CƠ CHẤT NUÔI TRỒNG MỘC NHĨ VÀ TÁI SỬ DỤNG BÃ THẢI ĐỂ TRỒNG NẤM SỊ Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 9420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Hà Nội, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Văn Toản TS Phạm Bích Hiên Phản biện 1: Phản biện Phản biện Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam vào hồi ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - Thư viện Trường THPT chuyên Lương Văn Tuỵ, tỉnh Ninh Bình MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nấm ăn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao, chứa nhiều loại vitamin axit amin thiết yếu Với đặc điểm hoại sinh, số loài nấm có hệ enzyme phân giải ligno- xenluloza mạnh, phân hủy chất phức tạp tạo nguồn dinh dưỡng nuôi sợi nấm Tuy nhiên, đa phần lồi nấm trồng khơng thể sử dụng nguồn nguyên liệu khó phân hủy mà phải sử dụng chất hoai mục có hỗ trợ phân giải chất vi sinh vật trước trồng nấm Các nghiên cứu nấm chủ yếu tập trung vào giống nấm, biện pháp kỹ thuật trồng, thu hoạch, chế biến bảo quản sau thu hoạch, mà chưa quan tâm nhiều tới công đoạn xử lý nguyên liệu đặc biệt xử lý công nghệ vi sinh vật dụng vi inhvật t ng hợp n ym chuyển hóa hợp chất ligno – nlulo a làm tác nhân l m n cưa trồng mộc nhĩ có tác dụng tăng tốc độ chuyển hóa, r t ngắn thời gian ủ nguyên liệu, tạo nguồn dinh dưỡng th ch hợp cho nấm inh trưởng phát triển, giảm tỉ lệ nhiễm bệnh qua giảm chi ph nhân công, chi ph đầu tư ây dựng nhà ưởng gia tăng lợi nhuận cho người trồng nấm Bã mùn cưa au trồng mộc nhĩ thường bị đ bỏ rác thải, bã m n cưa lượng xenluloza hemi nlulo a tương đương với rơm rạ dụng để trồng nấm ò, nhiên bã m n cưa có phần ợi gốc nấm mộc nhĩ lại au thu hoạch nhân tố gây ức chế ự inh trưởng nấm khác, việc b ung V V phân giải lingo – xenluloza vào bã m n cưa au trồng mộc nhĩ, gi p khắc phục nhược điểm đồng thời tận dụng nguyên liệu cách tối đa, giảm chi ph đ bỏ phế thải, tăng hiệu kinh tế góp phần bảo vệ mơi trường Nhằm nâng cao hiệu dụng m n cưa ản uất nấm ăn, đáp ứng nhu cầu thực tế người trồng nấm, đề tài luận án “Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm chất nuôi trồng mộc nhĩ tái sử dụng bã thải để trồng nấm sò” thực Bộ mơn inh học Môi trường - Viện Môi trường Nông nghiệp Mục tiêu luận án Phân lập, tuyển chọn ác định khả ứng dụng vi inh vật chuyển hóa hợp chất ligno – xenluloza l m n cưa làm chất trồng mộc nhĩ, tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò ây dựng qui trình sản xuất, sử dụng chế phẩm sinh học từ vi sinh vật tuyển chọn để l có hiệu m n cưa làm chất trồng mộc nhĩ tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Đề tài luận án cung cấp luận cứ, khoa học thực tiễn cho việc dụng vi inh vật chuyển hóa hợp chất ligno – nlulo a l m n cưa làm chất trồng mộc nhĩ tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò Kết phân lập, tuyển chọn vi inh vật phân giải ligno – nlulo a đồng thời góp phần làm giàu nguồn g n vi inh vật nông nghiệp ản phẩm đề tài luận án chủng khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 có khả t ng hợp n ym nlula a, lignin p ro ida a mangan p ro ida a th c đẩy nhanh trình l m n cưa làm chất trồng mộc nhĩ tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò Đề tài luận án cơng trình nghiên cứu t ng hợp Việt Nam phân lập, tuyển chọn, ác định chủng vi inh vật chuyển hóa hợp chất ligno – xenluloza sản uất chế phẩm vi inh vật dụng l m n cưa làm chất trồng mộc nhĩ tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò Những đóng góp luận án cụ thể au:  Phân lập, tuyển chọn ác định chủng khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 thuộc nhóm an tồn sinh học cấp độ có khả t ng hợp enzyme xenlulaza, lignin peroxidaza mangan p ro idaza thúc đẩy nhanh trình xử l m n cưa làm chất trồng mộc nhĩ tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò  Xác định điều kiện tối ưu nhân inh khối chủng khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05  Xây dựng qui trình sản xuất sử dụng chế phẩm vi sinh vật l mùn cưa làm chất trồng mộc nhĩ tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò  Kết dụng chế phẩm vi inh vật l m n cưa làm chất trồng mộc nhĩ tái dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm ò mở giải pháp cho việc dụng hiệu m n cưa ản uất nấm ăn, góp phần bảo vệ mơi trường nâng cao hiệu ản uất nấm ăn từ mùn cưa CHƯƠNG I T NG UAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung mộc nhĩ nấm sò 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Mộc nhĩ có tên khoa học Aricularia spp, thể hình đĩa tròn (hình tai) đường k nh từ 2,0-15,0cm, có nhiều màu ắc hình thái khác Theo Lowy (1951) (tr ch th o Vương Bá Triệt,(1994) Trịnh Tam Kiệt (2001), mộc nhĩ thuộc: ngành – Mycota, lớp – Basidiomycetes, lớp phụ Phragmobasidiomicetidae, - Auriculariales, họ - Auriculariaceac, loài Auricularia spp Owr Việt Nam tìm thấy lồi mộc nhĩ, có lồi trồng ph biến Auricularia polytricha (Mont) Sacc Và Auricularia auricula (L Hook.) Und rw (Trịnh Tam Kiệt, 2001) Nấm ò có 30 lồi, c ng có tên khoa học chung Pleurotus sp., thuộc chi Pleurotus, họ Pleurotaceae, Agaricales, lớp Agaricomycetes, ngành phụ Agaricomycotina, ngành Nấm đảm – Basidiomycota, giới Nấm – Fungi Ở Việt Nam, nấm ò có tên gọi khác nấm bào ngư (Đinh Xuân Linh cộng ự, 2012) 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng Nấm ăn loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Th o Nuhu Alam t al., (2008) hàm lượng prot in nấm ò tươi đạt trung bình 2,6 – 3,4% chứa nhiều a it amin qu Th o FAO (1972) mộc nhĩ loại nấm ăn có vai trò quan trọng phần ăn châu Á Thành phần dinh dưỡng mộc nhĩ khô gồm prot in thô (7,9%), chất béo (1,2%), cacbonhydtrat (84,2%) 1.1.3 Điều kiện sinh trưởng phát triển mộc nhĩ nấm sò Nguồn dinh dưỡng để nấm inh trưởng phát triển gồm: Cacbon (C), Nitơ (N), chất khoáng vitamin Ở mộc nhĩ, ự inh trưởng diễn điều kiện chất có tỷ lệ C/N nhỏ 60/1, tốt 35/1; với nấm sò tỷ lệ thích hợp từ 20/1 đến 25/1 Tỉ lệ C/N tốt cho nấm sò vào khoảng 20 – 30/1 không tỷ lệ 50/1 (Lê Lý Thùy Trâm, 2007) Mộc nhĩ inh trưởng nhiệt độ từ 15 0C đến 350C, nhiệt độ th ch hợp để mộc nhĩ phát triển từ 250C đến 320C Nhiệt độ tối th ch cho ự inh trưởng hệ ợi nấm ò khoảng 250C – 300C Nhiệt độ không ảnh hưởng đến uất mà ảnh hưởng đến hình thái thể, nhiệt độ cao cuống nấm dài, mũ nấm mỏng Ngược lại, nhiệt độ thấp, nấm phát triển chậm, cuống nấm ngắn, mũ nấm dày, màu ắc thể đậm (Trịnh Tam Kiệt, 2013) Với mộc nhĩ, độ ẩm chất th ch hợp khoảng 60-65% Nếu khô ẩm không tốt Trong đó, độ ẩm khơng kh nơi ni trồng nên giữ mức 80%-90% (Nguyễn Lân H ng, 2000) Độ ẩm chất th ch hợp để trồng nấm ò từ 60 – 65%, độ ẩm không kh 80% th ch hợp cho ự phát triển hệ ợi thể nấm (Đinh Xuân Linh cộng ự, 2012) Thời kỳ ủ sợi, cần giữ mộc nhĩ chỗ tối Trong giai đoạn hình thành thể, nâng dần độ chiếu để kích thích phát triển thể mộc nhĩ Khi mộc nhĩ phủ gần kín bề mặt, tiếp tục nâng mức lên ngưỡng phòng có mở cửa (Nguyễn Lân Hùng, 2000) Đối với nấm ò, ánh ảnh hưởng không tốt đến inh trưởng hệ sợi nấm, hình thành thể cần ánh sáng khuếch tán khoảng 100 – 200 lu (Đinh Xuân Linh cộng sự, 2012) 1.1.4 Nghiên cứu sản xuất nấm ăn giới Việt Nam 1.1.4.1 Nghiên cứu sản xuất nấm ăn giới Trong nửa kỷ vừa qua chứng kiến ự tăng trưởng nhanh chóng ngành ản uất nấm Từ năm 1969 đến năm 2009, ản uất nấm giới tăng khoảng mười lần T ng ản lượng nấm tăng từ 60.000 với giá trị 100 triệu nhân dân tệ (15 triệu U D) vào năm 1978 lên tới 25,7 triệu với giá trị 87 tỷ nhân dân tệ (13 tỷ U D) năm 2008 đạt 149 tỷ nhân dân tệ (24 tỷ U D) năm 2011 Tỷ lệ ản uất nấm cung cấp cho toàn giới Trung Quốc tăng từ 5,7% năm 1978 lên 80% năm 2008 (Wu et al, 2013) 1.1.4.2 Nghiên cứu sản xuất nấm ăn Việt Nam Với kh hậu nhiệt đới, Việt Nam ph hợp cho ự phát triển đa dạng loại nấm trồng Tuy vậy, nước ta đưa vào ản uất khoảng 16 loại nấm chính, tỉnh ph a Nam chủ yếu trồng nấm rơm, mộc nhĩ; tỉnh ph a Bắc trồng nấm hương, mộc nhĩ, nấm ò, nấm linh chi Với ản lượng nấm hàng năm đạt khoảng 250.000 tấn, kim ngạch uất 25 - 30 triệu U D, đó: mộc nhĩ đạt 120.000 tấn, nấm rơm 64.500 tấn, nấm ò khoảng 60.000 tấn, nấm mỡ 5.000 tấn, nấm linh chi 300 tấn, loại nấm khác nấm vân chi, nấm đầu khỉ, nấm kim châm, nấm ngọc châm với ố lương khoảng 700 (Nguyễn Như Hiến & Phạm Văn Dư, 2013) 1.2 Hợp chất ligno - xenluloza 1.2.1 Xenluloza X nlulo a thành phần chủ yếu thành tế bào thực vật với tỷ lệ khoảng 30- 80% t nh th o khối lượng khô X nlulo a hợp chất phức tạp bền vững không tan nước nhiều dung môi hữu cơ, không bị dung dịch a it kiềm loãng tác dụng, bị thuỷ phân đun nóng với a it kiềm X nlulo a tự nhiên bị thuỷ phân hoàn toàn ẽ cho ản phẩm cuối D-gluco a Trong điều kiện bình thường ố vi inh vật thuỷ phân xenluloza thành xenlobio a, au tác động nlobio a thành glucoza (Beguin et al., 1992; Bruno et al., 1998) 1.2.2 Lignin Lignin ố polym hữu ph biến thực vật, sau xenluloza Hàm lượng lignin gỗ khoảng 20-40% Lignin tạo nên đơn phân tử p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol sinapylalcohol Lignin hợp chất tự nhiên có cấu trúc phức tạp, đa dạng khó bị phân hủy Lignin bị thủy phân tác nhân hóa học n ym manganese peroxidaza, lignin peroxidaza cellobiosedehydrogenase (Lenihan et al., 2010) Khi nhiệt phân, lignin cho sản phẩm làm ethoxy phenol 1.2.3 Hemi – xenluloza Hemi – xenluloza polyme mạch thẳng, có nhánh với thành phần đơn phân đa dạng bao gồm năm loại phân tử đường ch nh bị ac tyl hóa (Kuhad et al., 1997) Phụ thuộc vào thành phần đơn phân chủ yếu cấu tạo nên khung đường, hemi – nlulo a chia thành nhiều loại Thực vật khác nhau, có thành phần hemi – xenluloza khác Các loại gỗ mềm gỗ cứng có thành phần hemixenluloza ac tylated (galacto) glucomannan (haycòngọi arabinoglucuronoxylan) glucuronoxylan (Scheller et al, 2010) 1.3 Vi sinh vật phân giải ligno - xenluloza 1.3.1 Vi sinh vật phân giải xenluloza Phân giải nlulo a trình inh học tạo kiểm ốt n ym nlula a có vai trò thủy phân cầu nối β-1,4 hai phân tử gluco a (Wil on, 2011) Hệ thống n ym phân giải nlulo a bao gồm ba enzyme ngoại bào 1,4-β-endoglucanaza, 1,4-β- oglucana a βgluco ida a (β-D-gluco id , glucohydrola c llobia ) Vi inh vật phân giải nlulo a gồm vi khuẩn, khuẩn nấm mốc, vi khuẩn hiếu kh có khả t ng hợp n ym nhiều vi khuẩn kị kh (Bay r et al., 2004) Vi nấm inh vật có chế inh hóa độc đáo phân giải chất tạo ản phẩm bậc hai đặc biệt, nghiên cứu nhiều lĩnh vực phân hủy nlulo a ( hahriarinour et al., 2011) Xạ khuẩn (Actinomycetes) ứng dụng nhiều nông nghiệp l mơi trường, Streptomyces ản inh nlula a quan tâm nghiên cứu nhiều với ố loài đáng ch Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans (Kluepfel et al., 1986; Schrempf, 1995) 1.3.2 Vi sinh vật phân giải lignin Trong tự nhiên lignin bị phân hủy chậm hủy chủ yếu ố vi nấm, đặc biệt nấm mục trắng mơi trường hiếu kh Vi khuẩn có khả phân hủy lignin Các n ym phân hủy lignin bao gồm chủ yếu lignin peroxidaza, manganese peroxidaza laccaza (JinShui Yang et al., 2005) 1.3.3 Yếu tố ảnh hưởng đến trình phân giải ligno - xenluloza vi sinh vật * Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng đến ự tăng trưởng tốc độ phân hủy vi inh vật trình ủ nguyên liệu (Chen et al, 2011) Tuy nhiên, nhiệt độ tăng q cao làm vơ hiệu q trình hoạt động phân huỷ ố n ym vi inh vật tiết để úc tác phản ứng phân huỷ chất hữu cơ(Atlas et al., 1981) Các đống ủ cần phải đảo trộn sau thiết lập nhiệt độ xác (Jenkins et al, 2003) Bach et al., (1984) cho tốc độ phân huỷ chất hữu tối ưu khoảng 60–650C Ở nhiệt độ cao trên700C có ố vi sinh vật ưa nhiệt hiếu khí hoạt động mật độ ch ng thường thấp lượng oxy đống ủ giảm nhiệt độ cao (BlainMetting,1995) * Độ ẩm: Độ ẩm có liên quan trực tiếp đến ự trao đ i kh trình ủ (Blain M tting, 1995) Độ ẩm cao làm giảm ự trao đ i kh , dẫn đến thiếu o y, thoát nhiệt Độ ẩm thấp dẫn đến hạn chế ự phát triển vi inh vật Th o Lê Hoàng Việt (2004), độ ẩm nguyên liệu từ 50 – 70% (trung bình 60%) th ch hợp cho ủ compo t nên giữ ẩm độ cuối giai đoạn nhiệt độ cao Jenkins et al, (2003) cho rằng, độ ẩm tối ưu trình ủ nên 50 60% * Oxy: Vi inh vật hiếu kh cần o y cho trình inh trưởng, phát triển Khi hoạt động vi inh vật trỉnh ủ tăng lên, lượng o y tiêu thụ ẽ tăng lên phải cung cấp việc đảo trộn thường uyên (Ch n et al., 2011) Các đống ủ cần phải thơng thống để cung cấp khơng kh từ bên (Cogger et al, 2009) Để đảm bảo không kh lưu thông khối ủ cần thiết phải đảo trộn nguyên liệu đồng thời lựa chọn k ch cỡ khối ủ ph hợp (Jenkins et al, 2003) Willson et al., (1980) cho hàm lượng o y khơng kh đống ủ đạt 5% thống kh Th o Lê Hoàng Việt (2004), hoạt động vi inh vật tối ưu đống ủ nồng độ o y đạt 15% - 20% * Tỷ lệ C/N: Tỷ lệ C/N nguyên liệu tối ưu cho ự phát triển vi inh vật phân huỷ trình ủ 35-40, tỉ lệ nhỏ 35 trình phân hủy diễn nhanh, nitơ thông qua ự bay NH 3, C/N 40 trình phân hủy ẽ chậm lại, nguyên liệu hữu ẽ chậm hoai mục ( tratton, 1995) Mối tương quan tỉ ố C/N thời gian ủ au: Tỷ lệ C/N = 20, thời gian ủ 12 ngày; tỷ lệ C/N = 20 – 50, thời gian ủ 14 ngày tỷ lệ C/N = 78, thời gian ủ 21 ngày Khi tỷ lệ C/N nhỏ 20, đạm ẽ bị trình chuyển đ i thành NH3 đặc biệt điều kiện nhiệt độ, pH cao * pH: Giá trị pH mơi trường có liên quan trực tiếp đến kết ủ Môi trường chua hạn chế ự phát triển vi khuẩn khuẩn Th o Ch n et al, (2011) pH tối ưu cho hoạt động vi khuẩn dao động từ 6,0 - 7,5, nấm 5,5 - 8,0 1.4 Nguyên liệu sử dụng sản xuất nấm ăn tái sử dụng bã thải trồng nấm 1.4.1 Nguyên liệu sử dụng sản xuất nấm ăn Các lồi nấm nấm mỡ, nấm ò, mộc nhĩ, nấm hương nấm rơm có khả inh trưởng, phát triển nguyên liệu giàu ligno – xenluloza (Rajarathnamet al., 1998; Philippousis, 2009), thông qua trình t ng hợp loại n ym cần thiết để chuyển hóa ligno – nlulo a chất có khả phát triển khác loại chất có chứa ligno – xenluloza (Chen et al., 2003; Baldrianet al, 2008) 1.4.2 Xử lý sử dụng mùn cưa làm chất trồng nấm Chất lượng uất nấm ự phát triển nấm bị ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng t nh chất vật l chất dụng (Kueset al., 2000, Baldrianet al., 2008) ản uất chất trồng nấm công đoạn quan trọng việc trồng nấm (Di go et al., 2011, Cormicanet al., 1991; Dhar, 1994) Mục đ ch ch nh việc ủ chất tạo nguồn dinh dưỡng ban đầu cho nấm phát triển,(Obodai et al, 2010) Do loại nấm không phát triển chất tươi, đặc biệt loại nấm trồng, chất phải ủ trước cấy giống Tại Việt Nam th o kinh nghiệm truyền thống, để trồng mộc nhĩ, m n cưa phun nước tạo độ ẩm au chất đống, ủ tự nhiên từ tháng năm, thời gian ủ đảo trộn chất 1-2 lần Ở ố địa phương người dân b ung vôi bột vào mùn cưa trước ủ th o tỷ lệ từ 3kg – 5kg /tấn nguyên liệu Thời gian cần thiết cho trình ủ chất phụ thuộc vào nhiều yếu tố tỷ lệ C/N, độ ẩm, thời tiết, loại hình ủ, quản l nguyên liệu cho trình ủ ( a katch wan Agricultur , 2008) Tỷ lệ C/N thấp, tối ưu độ ẩm ự đảo trộn thường uyên chất làm tăng hoạt động vi inh vật (Nutongkaewet al, 2014) 1.4.3 Tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm chất trồng nấm sò Bã thải au trồng nấm chứa nhiều yếu tố dinh dưỡng có tiềm dụng cho mục đ ch khác, kể cho việc tái dụng để trồng nấm (Rinkeret al, 2004, Jonathanet al, 2011) Royse, (1992), Chen (1998) Zhang et al (2013) khuyến cáo bã thải au trồng nấm hương Lentinula edodes dụng trồng nấm Pleurotus sajor-caju, bã thải au trồng nấm linh chi Ganoderma lucidum dụng trồng nấm đậu Coprinus conatus, nấm mỡ Agaricus bisporus nấm kim châm Flamulina velutipes Theo Sripheuk,(2007), Ashrafi et al., (2014) bã thải au trồng nấm sò Pleurotus abalonus trồng mộc nhĩ Auricularia polytricha, nấm ò Pleurotus ostreatus Pleurotusflorida Ở Việt Nam có t cơng trình nghiên cứu công bố nghiên cứu tái dụng bã thải trồng nấm nói chung bã thải trồng mộc nhĩ nói riêng Đến có ố t cơng trình nghiên cứu dụng bã thải au trồng nấm làm phân bón giá thể trồng (Lương Bảo Uyên, 2008; Đào văn Thông cộng ự, 2014; Nguyễn Thị Minh, 2016, Nguyễn Thị Liên, 2017) Tái dụng bã thải trồng nấm để trồng loại nấm ăn khác thăm dò thử nghiệm ố địa phương, ong thời điểm chưa cơng trình nghiên cứu cơng bố CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu Mẫu phân lập vi inh vật lấy địa bàn Hà Nội, Ninh Bình gồm 10 mẫu đất trồng, 10 mẫu m n cưa 10 mẫu rơm rạ phân hủy Giống Mộc nhĩ (Auricularia polytricha), nấm ò trắng (Pleurotus florida) Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật Mật độ vi sinh vật đươc ác định th o phương pháp ni cấy pha lỗng mơi trường thạch (Nguyễn Lân Dũng c , 2011) Vi sinh vật phân giải nlulo a phân lập, tuyển chọn định t nh định lượng hoạt tính phân giải xenluloza Xạ khuẩn phân lập phân loại màu sắc khuẩn ty chất, khuẩn ty khí sinh, sắc tố tan tiết mơi trường theo Shirling Gottlieb (1966) hình dạng cuống sinh bào tử, bào theo khóa phân loại Bergey Chủng khuẩn phân lập giải trình tự g n 16 ARN ribo om, so sánh mức độ tương đồng gen 16S rDNA với trình tự gen 16S rDNA Genbank theo phần mềm ClustalX 2.0.11 ây dựng phả hệ để ác định vị tr phân loại 2.2.2 Phương pháp h a sinh Hoạt độ nlula a ác định định tính thơng qua vòng phân giải CMC môi trường đặc định lượng thông qua hàm lượng gluco a tạo thành dịch nuôi cấy th o phương pháp đo độ hấp thụ bước óng 540 nm (Mill r, 1959) Hoạt độ lignin pero ida a mangan p ro ida a ác định theo Mercer et al., (1996 ) dựa mức độ oxy hóa O-Diani idin đo bước sóng 460 nm mức độ o y hoá ph nol đỏ n ym MnP đo bước sóng 610 nm 2.2.3 Các phương pháp phân tích Hàm lượng cacbon t ng ố, nitơ t ng ố đường khử phân t ch th o tay phân t ch đất, nước, phân bón trồng (Viện Th nhưỡng nơng hóa, 1999) 2.2.4 Tối ưu h a điều kiện nuôi cấy Các điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, lượng kh cấp tỷ lệ tiếp giống ban đầu thực th o phương pháp bề mặt đáp ứng (Montgom ry, Dougla C, 2005), kỹ thuật mơ hình thống kê thực nghiệm dụng để phân t ch hồi quy đa điểm phần mềm D ign Expert Version 9.0.6.2 khử t ng ố t ng ố M n cưa 44,3 24,5 0,13 48,0 0,50 96,0 M n cưa ủ tự nhiên 38,5 21,7 0,20 42,2 0,55 76,7 M n cưa ủ b khuẩn 35,5 18,0 0,52 33,0 0,58 56,9 ung Chủng MC05 có khả t ng hợp enzyme xenlulaza, lignin p ro ida mangan p ro ida , có tác dụng t ch cực chuyển hóa ligno nlulo a m n cưa, làm giảm tỷ lệ C/N m n cưa từ 96/1 uống 56,9/1 làm tăng hàm lượng đường khử từ 0,13% lên 0,52% Th o Lê Duy Thắng Trần Văn Minh (2001) mộc nhĩ phát triển tốt chất có tỷ lệ C/N 35/1 phát triển bình thường chất có tỷ lệ C/N từ 40/1 đến 60/1 Kết nghiên cứu đề tài cho thấy m n cưa ủ b ung inh khối chủng khuẩn MC05 có tỷ lệ C/N ph hợp cho inh trưởng, phát triển mộc nhĩ Đánh giá khả inh trưởng, phát triển mộc nhĩ m n cưa không ủ ủ tự nhiên m n cưa ủ sử dụng sinh khối xạ khuẩn xác định m n cưa không ủ, mộc nhĩ khơng hình thành hệ ợi Trên mùn cưa ủ tự nhiên, hệ sợi hình thànhvà phát triển 02 tuần đầu sau cấy giống với tốc độ chậm, sợi mảnh, au hệ sợi nấm bị chết tuần thứ Trên m n cưa ủ sử dụng inh khối chủng MC05, hệ sợi mộc nhĩ hình thành phát triển với tốc độ lan tơ đạt trung bình 4,9mm/ngày Hệ sợi mộc nhĩ lan k n bịch nấm sau cấy giống tuần (bảng 3.2) Bảng 3.2 inh trưởng, phát triển hệ sợi mộc nhĩ m n cưa dụng phương pháp ủ khác Tốc độ phát triển trung bình hệ ợi mộc nhĩ(mm)/chiều dài bịch nấm Công thức tuần tuần M n cưa không ủ tuần tuần tuần tuần - - - - - - M n cưa ủ tự nhiên 32,5 52,0 - - - M n cưa ủ b chủng MC05 38,5 74,8 135,8 175,5 196,5 ung 207,5 hi ch : -) hệ sợi không ngừng sinh trưởng Từ kết nghiên cứu trên, đề tài ác định chủng MC05 có khả t ng hợp enzyme xenlulaza, lignin p ro ida a mangan p ro ida a Trong q trình ủ m n cưa, chủng MC05 có tác dụng gia tăng nhanh nhiệt độ khối ủ, chuyển hóa tốt hợp chất ligno - xenluloza, qua giảm tỷ lệ C/N phù hợp inh trưởng, phát triển mộc nhĩ Mộc nhĩ trồng m n cưa ủ 11 b sung sinh khối chủng MC05 inh trưởng phát triển tốt tạo hệ sợi lan kín bịch nấm au cấy giống tuần 3.1.3 Định danh chủng MC05 3.1.3.1 Đặc điểm hình thái, sinh h a chủng MC05 Nuôi cấy chủng MC05 môi trường I P khác nhau, ác định khuẩn ty kh inh chủng MC05 có màu vàng mơi trường I P5, màu xám môi trường I P1, I P2, I P3, màu trắng môi trường I P6 I P7 Khuẩn ty chất chủng MC05 có màu ám mơi trường I P2 màu vàng môi trường nuôi cấy khác Chủng MC05 không tạo ắc tố tan melanin, không thay đ i màu ắc môi trường nuôi cấy Đánh giá ố đặc điểm inh hóa chủng MC05 ác định chủng MC05 có khả đồng hóa ca in, g latin, hypo anthin , anthin, L-tyro in ylan có khả dụng xanthine, xylan, L-Arabinose, meso-Inositol mannitol làm nguồn hydratcacbon Quan át cuống inh bào tử chủng MC05 k nh hiển vi điện tử ác định mặt bào tử nh n, ố lượng bào tử khoảng 30 - 50 bào tử/chuỗi o ánh đặc điểm chi Streptomyces (Nomomura, 1974) với kết nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm bảo tử phản ứng inh hoá nêu trên, ác định chủng vi khuẩn phân lập MC05 thuộc chi Streptomyces 3.1.3.2 iải trình tự gen chủng MC05 Kết giải trình tự gen 16S ARN rebosom cho thấy, chủng MC05 có độ tương đồng 98 % với g n tương ứng số xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, mức tương đồng cao đạt 99% Streptomyces thermocoprophilus Từ kết đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa giải trình tự gen, chủng xạ khuẩn MC05 định danh Streptomyces thermocoprophilus MC05 Theo hướng dẫn TRBA ố 466 ngày 28.5.2015 của Cộng đồng Châu Âu, Streptomyces thermocoprophilus thuộc nhóm an tồn inh học cấp độ1, tác nhân inh học không gây bệnh cho người, động vật thực vật, phóng th ch không hạn chế vào môi trường tự nhiên điều kiện bình thường 3.2 Nghiên cứu sản xuất chế ph m xạ khu n ủ m n cưa trồng mộc nhĩ 3.2.1 Điều kiện nhân sinh khối Streptomyces thermocoprophilus MC05 kỹ thuật lên men chìm 3.2.1.1 Nhiệt độ Nuôi cấy chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 điều kiện pH môi trường thời gian th ch hợp nhiệt độ 25 đến 650C ác định inh khối chủng MC05 n định với mật độ 109 CFU/ml nhiệt độ từ 350C đến 550C ự chênh lệch mật độ MC05 nuôi cấy nhiệt độ 350C, 400C, 450C, 12 500C 550C không đáng kể Nhiệt độ th ch hợp cho inh trưởng phát triển Streptomyces thermocoprophilus MC05 350C - 550C Kết nghiên cứu đề tài tương đồng với kết công bố Tăng Thị Ch nh, (2001), Trần Đình Toại, (2008) Nguyễn Thế Trang, (2015) nhiệt độ th ch hợp cho ố chủng khuẩn phân giải nlulo a 3.2.1.2 pH Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến inh trưởng, phát triển chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 cho thấy mật độ au 72 nuôi cấy pH 7,0 đạt cao 109 CFU/ml, pH 4,0 9,0 mật độ đạt 107 CFU/ml Chủng khuẩn MC05 đạt mật độ tế bào > 109 CFU/ml nuôi cấy trong mơi trường có pH từ 6,0 đến 8,0 Kết nghiên cứu đề tài tương đồng với công bố Tăng Thị Ch nh (2001), Trần Đình Toại (2008) Nguyễn Thế Trang (2015) pH th ch hợp cho inh trưởng hoạt t nh x lula a khuẩn 3.2.1.3 Thời gian nhân sinh khối Nuôi cấy chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 môi trường có pH nhiệt độ th ch hợp thời gian từ đến 96 ác định mật độ khuẩn tăng dần từ 104 CFU/ml đến 109 CFU/ml thời gian từ đến 72 giờ, mật độ đạt 109 CFU/ml au thời gian ni cấy 60 đạt cao thời điểm 72 giờ, au giảm dần, đến thời điểm 96 108 CFU/ml Kết nghiên cứu ác định thời gian nhân inh khối th ch hợp Streptomyces thermocoprophilus MC05 72 - 84 tương đồng với công bố Đào Văn Thông cộng ự, (2013), Nguyễn Thế Trang, (2015) thời gian th ch hợp cho trình nhân inh khối chủng khuẩn 3.2.1.4 Lưu lượng khí cấp Nghiên cứu ảnh hưởng lưu lượng kh cấp đến inh trưởng, phát triển khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 trình nhân inh khối cho thấy mật độ khuẩn đạt 107 CFU/mltrong điều kiện lượng kh cấp 0,4 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t, đạt 108 CFU/ml lượng kh cấp 0,5 0,6 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t đạt 109 CFU/ml với lượng cấp kh 0,7- 0,9 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t Khi tiếp tục tăng lượng kh cấp lên mức 1,0 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t, mật độ Streptomyces thermocoprophilus MC05 không tăng lên mà giảm uống 108 CFU/ml Như lượng kh cấp th ch hợp cho nhân inh khối chủng khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 0,7 – 0,9 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t Kết nghiên cứu đề tài tương đồng với kết nghiên cứu Phạm B ch Hiên cộng ự (2011), Đào Văn Thông cộng ự (2013) lượng kh cấp ph hợp nhân inh khối khuẩn 3.2.1.5 Tỷ lệ tiếp giống ban đầu 13 Kết nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống ban đầu đến mật độ Streptomyces thermocoprophilus MC05 ác định mật độ khuẩn au 72 nhân inh khối đạt 107 CFU/ml với tỷ lệ tiếp giống ban đầu 1,0% v/V tăng lên 10 CFU/ml với tỷ lệ tiếp giống 2,0% 3,0% v/V Mật độ chủng khuẩn đạt 109 CFU/ml với tỷ lệ tiếp giống ban đầu 4,0%v/V Tỷ lệ tiếp giống ban đầu lớn 6,0%v/V, khơng gia tăng mật độ khuẩn mức có nghĩa o ánh với công bố Phạm B ch Hiên cộng ự (2011), Nguyễn Văn Hiếu cộng ự (2012), Đào Văn Thông cộng ự (2013) tỷ lệ tiếp giống ban đầu nhân inh khối khuẩn cho ản uất chế phẩm vi inh vật, kết nghiên cứu thu hoàn toàn tương đồng ác định tỷ lệ tiếp giống ban đầu th ch hợp cho nhân inh khối khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 4,0 – 6,0 % v/V 3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện nhân sinh khối Streptomyces thermocoprophilus MC05 Kết nghiên cứu điều kiện tối ưu cho nhân inh khối chủng khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 kỹ thuật lên m n chìm ác định nhiệt độ lên men 42,00C; pH môi trường 7,0; thời gian lên m n 72 giờ; tỷ lệ giống cấy 6,0% lưu lượng cấp kh 0,8 dm3 không kh /dm3 môi trường Các giá trị nhận thông ố kỹ thuật áp dụng trình nhân inh khối chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 hoàn toàn ph hợp với nghiên cứu khuẩn ứng dụng ản uất chế phẩm vi inh vật l chất thải hữu Tăng Thị Ch nh (2001), Trần Đình Toại (2008), Phạm Thị B ch Hiên (2011), Nguyễn Văn Hiếu (2012), Đào Văn Thông (2013) Nguyễn Thế Trang (2015) Thử nghiệm nhân sinh khối Streptomyces thermocoprophilus MC05 nồi lên men, dung tích 50 lít trình cho thấy sinh khối xạ khuẩn điều kiện lên men chìm tối ưu nêu đạt mật độ 9,7 x 109CFU/ml mơi trường Kiểm tra hoạt tính sinh học Streptomyces thermocoprophilus MC05 sau nhân sinh khối ác định xạ khuẩn nghiên cứu có đường kính vòng phân giải CMC đạt 31,5 mm đường kính vòng phân giải lignin đạt 11,0 mm Hoạt tính sinh học Streptomyces thermocoprophilus MC05 sau lên men chìm điều kiện tối ưu hóa khơng khác có nghĩa o với chủng gốc 3.2.3 Qui trình sản xuất chế phẩm Streptomyces thermocoprophilus MC05 Kế thừa kết nghiên cứu ản uất chế phẩm vi inh vật từ khuẩn Viện Môi trường nông nghiệp (Đào Văn Thông cộng ự, 2013) đề tài thử nghiệm dụng nguyên liệu tinh bột ắn cám gạo th o tỷ lệ khối lượng 25:75 để nhân inh khối khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 kỹ thuật lên m n ốp với thông ố kỹ thuật: độ ẩm nguyên liệu ban đầu 5055%, pH chất 6,5-7,0, tỷ lệ tiếp giống ban đầu 5,0% thời gian lên m n 72 Kết kiểm tra chất lượng chế phẩm khuẩn cho thấy mật độ au ản uất đạt 5,5 109 CFU/g sau 03 tháng bảo quản điều kiện nhiệt độ phòng 14 đạt 6,7 108 CFU/g đảm bảo qui định hành chế phẩm vi inh vật Qui trình ản uất chế phẩm Streptomyces thermocoprophilus MC05 thể hình 3.1 Chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 Nhân sinh khối cấp Môi trường ause, thời gian nuôi 72 h, nhiệt độ 42oC, nhân nuôi máy lắc) Tinh bột ắn; cám gạo tỷ lệ 25:75, trộn Nhân sinh khối cấp (Môi trường ause, nhiệt độ: 420C, lưu lượng khí cấp: 0,8 lít KK/lít MT, tỷ lệ tiếp giống: 6%; thời gian nuôi Chất mang Kích thước hạt: 0,1mm, pH=7,0; độ ẩm: 10 %) 72h)Lên men xốp Cơ chất: Tinh bột sắn/cám gạo; độ ẩm ban đầu 50 -55%; tỷ lệ tiếp giống: 5,0%; thời gian nuôi 72 h) Khử tr ng 1210C 30 phút Sấy khơ Nhiệt độ 400C 24 giờ) Đóng gói Chế ph m xạ khu n Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 3.3 Sử dụng chế ph m xạ khu n ủ m n cưa làm c chất trồng mộc nhĩ 3.3.1 Điều kiện sử dụng chế phẩm xạ khuẩn ủ mùn cưa 3.3.1.1.Độ ẩm ban đầu mùn cưa Kết ác định mật độ khuẩn mật độ vi inh vật t ng ố m n cưa au ngày ủ với độ ẩm khối ủ ban đầu 35- 60% cho thấy m n cưa với độ ẩm 50% 55% có mật độ vi inh vật t ng ố >107CFU/g mật độ khuẩn >106CFU/g, khối ủ có độ ẩm m n cưa ban đầu 60% có mật độ vi inh vật t ng ố