BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y *************** NGUYỄN BÁ KHÁNH TƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ THẢO DƯỢC VIỆT NAM Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ thú y Giáo viên hướng dẫn PGS.TS PHAN PHƯỚC HIỀN KS TRỊNH THỊ PHI LY THÁNG 8/2011 i PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Phan Phước Hiền Họ tên sinh viên thực hiện: Nguyễn Bá Khánh Tường Tên đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn số thảo dược Việt Nam” Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến đóng góp hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa Chăn nuôi – Thú y vào ngày 29/7/2011 Giáo viên hướng dẫn ii LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ người thân yêu thương, động viên năm tháng qua Tôi xin nhớ ơn: - Giáo viên hướng dẫn tôi, PGS.TS Phan Phước Hiền hết lòng hỗ trợ, dẫn dắt hướng dẫn tơi hồn thành tốt đề tài - Kĩ sư Trịnh Thị Phi Ly ThS Trương Đình Bảo hướng dẫn thao tác phòng thí nghiệm cho tơi suốt thời gian thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban chủ nhiệm khoa Chăn ni – Thú y tồn thể quý thầy cô trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh - Tất bạn tơi động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Sinh viên NGUYỄN BÁ KHÁNH TƯỜNG iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nhằm góp phần nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn số dược thảo Việt Nam, thực đề tài: “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ THẢO DƯỢC VIỆT NAM” từ tháng – 6/2011 Bộ mơn Hóa Sinh Hóa Dược, Viện Cơng nghệ sinh học mơi trường phòng thí nghiệm Vi sinh, Bộ mơn Vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y, ĐH Nông Lâm Tp HCM Chúng tiến hành điều chế dịch chiết phương pháp Soxhlet chiết cao phương pháp ngâm dầm Sau chế phẩm thử nghiệm hiệu lực kháng khuẩn vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus phương pháp khuếch tán thạch xác định nồng độ ức chế tối thiểu phương pháp pha loãng liên tiếp Kết ghi nhận: Tỉ lệ chủng vi khuẩn kiểm tra có phản ứng nhạy đến nhạy cao Xuân Hoa xanh 83,33 % cao Xuân Hoa tía 80,56% Trong đó, tỉ lệ thấp 60% chế phẩm dạng dịch chiết, cụ thể là: 47,22 % dịch chiết Xuân Hoa xanh, 33,33 % dịch chiết Xuân Hoa tía, 55,56 % dịch chiết thuốc bắc 0% dịch chiết từ rau má Như vậy, dạng cao chiết, Xuân Hoa xanh Xuân Hoa tía có tác dụng tốt dạng dịch chiết Kết nồng độ ức chế tối thiểu chế phẩm cao Xuân Hoa xanh Xuân Hoa tía ba chủng vi khuẩn thử nghiệm 1500 µg /ml 450 µg/ml Như liều sử dụng Xuân Hoa tía thấp khoảng lần so với liều sử dụng cao Xuân Hoa xanh Từ khóa: dược thảo, hoạt tính kháng khuẩn, Xn Hoa, thuốc bắc, rau má iv MỤC LỤC TRANG Trang tựa i Phiếu xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt .iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Danh sách biểu đồ xi Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Khái quát dược thảo nghiên cứu 2.1.1 Xuân Hoa xanh - Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk 2.1.1.1 Phân loại thực vật 2.1.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.1.3 Thành phần dưỡng chất thành phần hóa học 2.1.1.4 Công dụng chữa bệnh động vật 2.1.1.5 Tác dụng sinh học dược lí 2.1.2 Xuân Hoa tía - Pseuderanthemum bracteatum Imlay 2.1.2.1 Phân loại thực vật 2.1.2.2 Giới thiệu cung đặc điểm hình thái 2.1.2.3 Công dụng 10 2.1.3 Rau má 10 2.1.3.1 Phân loại thực vật 10 2.1.3.2 Giới thiệu chung đặc điểm hình thái 10 v 2.1.4 Hỗn hợp vị thuốc bắc 11 2.1.4.1 Bạch linh 11 2.1.4.2 Bạch truật 11 2.1.4.3 Bán hạ 11 2.1.4.4 Cam thảo 11 2.1.4.5 Cát cánh 12 2.1.4.6 Chỉ xác 12 2.1.4.7 Đương quy 12 2.1.4.8 Gừng 12 2.1.4.9 Sa sâm 12 2.1.4.10 Tiền hồ 12 2.1.4.11 Tô mộc 12 2.1.4.12 Trần bì 13 2.2 Đại cương vi sinh vật thí nghiệm 13 2.2.1 Escherichia coli 13 2.2.2 Salmonella spp 14 2.2.3 Satphylococcus aureus 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 3.1 Thời gian địa điểm 17 3.2 Đối tượng nghiên cứu 17 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Vật liệu 17 3.4.1 Chuẩn bị dược liệu 18 3.4.2 Chuẩn bị chủng vi khuẩn 18 3.4.3 Hóa chất môi trường nuôi cấy 18 3.4.4 Vật liệu 18 3.5 Phương pháp 18 3.5.1 Chuẩn bị dịch chiết 18 3.5.2 Qui trình chiết cao 19 vi 3.5.3 Xác định ẩm độ 21 3.5.4 Xác định hiệu suất cao 22 3.5.5 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 22 3.5.5.1 Phương pháp khuếch tán thạch 22 3.5.5.2 Phương pháp pa loãng liên tiếp môi trường lỏng 24 3.5.6 Phương pháp xử lí số liệu 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Ẩm độ 26 4.2 Hiệu suất chiết cao 27 4.3 Đường kính vòng vơ khuẩn 27 4.3.1 Đối với Staphyloccocus aureus 27 4.3.2 Đối với Salmonella spp 28 4.3.3 Đối với Escherichia coli 28 4.3.4 Hiệu lực kháng khuẩn norfloxacin chủng vi khuẩn 29 4.4 Giá trị MIC theo phương pháp pha lỗng liên tiếp mơi trường lỏng 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 40 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CXH1 : Cao chiết xuất từ bột P.palatiferum CXH2 : Cao chiết xuất từ bột P.bracteatum DXH1 : Dịch chiết xuất từ bột P.palatiferum DXH2 : Dịch chiết xuất từ bột P.bracteatum DMSO : Dimethyl sulfoxide DTB : Dịch chiết từ bột vị thuốc bắc DRM : Dịch chiết từ bột rau má MIC: Minimal inhibitory concentration Nor : norfloxacin viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hàm lượng chất khoáng P palatiferum Bảng 3.1 Tóm tắt quy trình thực MIC 24 Bảng 4.1 Ẩm độ bột dược liệu vả cao thô 26 Bảng 4.2 Hiệu suất chiết cao 27 Bảng 4.3 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm Sta aureus 28 Bảng 4.4 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm Salmonella spp 28 Bảng 4.5 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm E.coli 28 Bảng 4.6 Đường kính vòng vơ khuẩn norfloxacin vi khuẩn nghiên cứu .29 Bảng 4.7 Kết kiểm tra tính nhạy cảm vi khuẩn chế phẩm 29 Bảng 4.8 Tính nhạy cảm chủng vi khuẩn chế phẩm 30 Bảng 4.9 Tỉ lệ nhạy cảm vi khuẩn chế phẩm 31 Bảng 4.10 Giá trị MIC 34 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hoa P.palatiferum Hình 2.2 Lá P.palatiferum Hình 2.3 Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Hình 2.4 Hoa P bracteatum Hình 2.5 P bracteatum Hình 4.1 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm Sal sp 33 Hình 4.2 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm Sta.aureus 33 Hình 4.3 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm E.coli 33 Hình 4.4 Giá trị MIC cao XH1 Sal sp 35 Hình 4.5 Giá trị MIC cao XH2 Sal sp 35 Hình 4.6 Giá trị MIC cao XH1 E.coli 35 Hình 4.7 Giá trị MIC cao XH2 E.coli 35 Hình 4.8 Giá trị MIC cao XH1 Sta aureus 35 Hình 4.9 Giá trị MIC cao XH2 Sta aureus 35 x 4.2 Hiệu suất chiết cao Bảng 4.2 Hiệu suất chiết cao Khối lượng bột Khối lượng cao Hiệu suất chiết sử dụng (g) thu (g) cao (%) P palatiferum 200 21,1243 10,56 P bracteatum 200 5,2642 2,63 Hiệu suất chiết cao từ P palatiferum cao hiệu suất chiết cao từ P.bracteatum ẩm độ nguyên liệu bột P palatiferum cao ẩm độ nguyên liệu bột P bracteatum Sự khác biệt chất lượng bột P bracteatum từ phía cơng ty cung cấp Như g bột P palatiferum tương đương với 0,1 g cao g bột P bracteatum tương đương với 0,03 g cao Khối lượng tươi P palatiferum sử dụng 12300 g khối lượng bột P palatiferum thu sau xay 2691,19 g Vậy cần 4,6 g tươi P palatiferum 0,1 g cao P palatiferum 4.3 Đường kính vòng vơ khuẩn Các kí hiệu sau sử dụng từ trở sau: CXH1 : Cao chiết xuất từ bột P.palatiferum CXH2 : Cao chiết xuất từ bột P.bracteatum DXH1 : Dịch chiết xuất từ bột P.palatiferum DXH2 : Dịch chiết xuất từ bột P.bracteatum DTB : Dịch chiết từ bột vị thuốc bắc DRM : Dịch chiết từ bột rau má 27 4.3.1 Đối với Staphyloccocus aureus Bảng 4.3 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm Sta aureus 4.3.2 Đối với Salmonella spp Bảng 4.4 Đường kính vòng vô khuẩn chế phẩm Salmonella spp Đối với Escherichia coli 4.3.3 Bảng 4.5 Đường kính vòng vơ khuẩn chế phẩm E.coli Đường kính (mm) Liều (mg bột nguyên liệu/ đĩa) CXH1 CXH2 DXH1 DXH2 DTB DRM 10 0 0 0 11 13.67±1.15 14.67±1.53 0 0 12 16.33±1.16 16±1.73 14.33±1.16 7.33±0.58 10.67±2.08 13 19±2.65 18.33±1.53 16.33±2.08 10±1 14.67±1.53 4.3.4 Hiệu lực kháng khuẩn norfloxacin số vi khuẩn: Liều (µg/đĩa) Đường kính (mm) Sta aureus Sal sp E coli 10 26±1.73 24.5±0.87 26.67±2.89 11 27.67±2.52 24.83±1.26 27±2.65 28 12 28.17±1.76 26±1.73 28.67±1.16 13 29.67±1.53 26±1.73 31±2.65 Bảng 4.6 Đường kính vòng vơ khuẩn norfloxacin vi khuẩn nghiên cứu Kết trình bày bảng 4.6 cho thấy dịch chiết từ bột rau má khơng có tác dụng kháng khuẩn Nồng độ sử dụng 10 mg bột ngun liệu/ đĩa khơng có tác dụng kháng khuẩn Kết cho thấy tất chế phẩm dạng dịch chiết khả kháng khuẩn sử dụng liều 10 mg bột nguyên liệu/đĩa Trong đó, Chế phẩm thử nghiệm Chủng vi Nồng độ (mg bột nguyên khuẩn Sta aureus E coli Sal sp Norfloxacin CXH1 CXH2 DXH1 DXH2 DTB DRM Nồng độ Hiệu (µg/đĩa) liệu/đĩa) < 10 - - - - - - 10 + + - - - - 10 + 11 ++ ++ + - + - 11 + 12 ++ ++ + + ++ - 12 + 13 +++ +++ + ++ ++ - 13 + < 10 - - - - - - 10 - - - - - - 10 + 11 + + - - - - 11 + 12 ++ ++ + - + - 12 + 13 ++ ++ ++ + + - 13 + < 10 - - - - - - 10 - - - - - - 10 + 11 + + - - - - 11 + 12 + + - - + - 12 + 13 + ++ + + + - 13 + 29 liều lượng này, chế phẩm dạng cao cho kết ức chế vi khuẩn Sta.aureus Những kết có mối quan hệ liều lượng sử dụng với nhạy cảm vi khuẩn, nghĩa độ lớn đường kính vòng vơ khuẩn tăng theo liều lượng sử dụng chủng vi khuẩn thí nghiệm Ở liều 13 mg bột nguyện liệu/ đĩa, đường kính vòng vô khuẩn chế phẩm thể rõ Cụ thể sau: - Đối với Sta aureus: Y = 3,6 X – 31,4; R2 = 27 % - Đối với Salmonella spp.: Y = 3,39 X – 34,2; R2 = 41,8 % - Đối với E.coli: Y = 4,52 X – 44,9; R2 = 44,6 % Trong đó: Y: đường kính vòng vơ khuẩn X: liều lượng sử dụng Vi khuẩn Tổng số quan sát Sta aureus 72 E.coli 72 Salmonella spp 72 Kháng Nhạy Rất nhạy Cực nhạy 25 (34,72 %) 44 (61,11 %) 39 (54,17 %) 20 (27,78 %) 23 (31,94 %) 12 (16,67 %) 19 (26,39 %) (5,56 %) 19 (26,39 %) (11,11 %) (1,39 %) (1,39 %) 30 Biểu đồ 4.1 Kết so sánh nhạy cảm chủng vi khuẩn Kết trình bày bảng 4.7 biểu đồ 4.1 cho thấy có 65,28 % số trường hợp vi khuẩn Sta aureus quan sát có phản ứng nhạy đến cực nhạy chế phẩm thử nghiệm, khí tỉ lệ đạt 45,83 % vi khuẩn Salmonella spp.và 38,89 % vi khuẩn E.coli Biểu đồ 4.2 Kết so sánh nhạy cảm chủng vi khuẩn chế phẩm Kết trình bày bảng 4.8 biểu đồ 4.2 cho thấy tỉ lệ chủng vi khuẩn kiểm tra có phản ứng nhạy đến nhạy chế phẩm dạng cao 83,33 % 80,56 % CXH1 CXH2 Trong đó, tỉ lệ thấp 60 % chế phẩm dạng dịch chiết, cụ thể là: 47,22 % DXH1, 33,33 % DXH2 55,56 % DTB 31 E.coli M.P.p 15 15 (µg/ml) 4.4 15 25 15 Sta aureus 15 15 15 15 15 15 15 (mg bột nguyên liệu/ ml) Nor 15 15 (mg bột nguyên liệu/ ml) M.P.b 15 Sal spp 15 25 12,5 25 12,5 12,5 15 15 15 15 15 25 15 15 15 15 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 Giá trị MIC theo phương pháp pha loãng liên tiếp môi trường lỏng Bảng 4.10: Giá trị MIC Kết MIC chủng vi khuẩn thử nghiệm loại chế phẩm kiểm tra CXH1 CXH2 15 mg bột nguyên liệu/ml tương đương với 1500 µg CXH1/ml hay với 450 µg CXH2/ml Nồng độ CXH1 sử dụng thí nghiệm chúng tơi cao nồng độ CXH1 sử dụng thí nghiệm Huỳnh Kim Diệu (2011), điều phù hợp với nhận định Huỳnh Kim Diệu cho có nhiều dòng Xn Hoa khác đặc tính kháng khuẩn biến đổi theo dòng Xn Hoa Ngồi dung môi sử dụng để chiết xuất ảnh hưởng đến kết thí nghiệm, dung mơi méthanol sử dụng thí nghiệm Huỳnh Kim Diệu Tuy nhiên, với định hướng sản xuất thuốc trị bệnh, ethanol 32 sử nhằm giảm thiểu nguy gây độc cho vật nuôi cung cấp qua đường uống 33 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Ẩm độ nguyên liệu tiến hành chiết cao đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam dược liệu ( 28 Hồng Nam, 2002 Phòng trị số bệnh thường gặp động vật NXB Văn Hóa Dân tộc, Hà Nội, pp 1-3 29 Vũ Duy Giảng, 17/11/2009, “Thay kháng sinh bổ sung chăn nuôi”, 6/5/2011, 30 Padee P, Nuakkaew S, Talubmook C et Sakaljaitrong S., 2010 Nov 11, « Hypoglycemic effect of a leaf extract of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk in normal and streptozotocin-induced diabetic rats », Mahasarakham Université – Thailand, 24/5/2011, 31 Peerawit Padee, Somsak Nualkeaw, Chusri Talubmook, Supasorn Sakuljaitrong, 2009, « Acute Toxicity and Sub-acute Toxicity of Pseuderanthemun palatiferum (Nees) Radlk Leaf Extract » Journal of Pharmaceutical Sciences (1) 39 PHỤ LỤC Mối quan hệ đường kính vòng kháng khuẩn liều lượng sử dụng Sta aureus Regression The regression equation is y = - 31.4 + 3.60 x Predictor Constant x Coef -31.444 3.5972 S = 6.710 StDev 8.172 0.7073 R-Sq = 27.0% T -3.85 5.09 P 0.000 0.000 R-Sq(adj) = 25.9% Analysis of Variance Source Regression Residual Error Total DF 70 71 SS 1164.6 3151.7 4316.3 MS 1164.6 45.0 F 25.87 P 0.000 Mối quan hệ đường kính vòng kháng khuẩn liều lượng sử dụng Salmonella spp Regression The regression equation is y = - 34.2 + 3.39 x Predictor Constant x Coef -34.183 3.3861 S = 4.534 StDev 5.522 0.4779 R-Sq = 41.8% T -6.19 7.08 P 0.000 0.000 R-Sq(adj) = 40.9% Analysis of Variance Source Regression Residual Error Total DF 70 71 SS 1031.9 1439.1 2471.0 MS 1031.9 20.6 40 F 50.19 P 0.000 Mối quan hệ đường kính vòng kháng khuẩn liều lượng sử dụng E.coli Regression Analysis The regression equation is dkinh3 = - 44.9 + 4.52 lieu Predictor Constant lieu Coef -44.867 4.5222 S = 5.710 StDev 6.954 0.6019 R-Sq = 44.6% T -6.45 7.51 P 0.000 0.000 R-Sq(adj) = 43.9% Analysis of Variance Source Regression Residual Error Total DF 70 71 SS 1840.5 2282.1 4122.6 MS 1840.5 32.6 F 56.46 P 0.000 Chi-Square Test cho tỉ lệ nhạy cảm vi khuẩn thử nghiệm chế phẩm Chi-Square Test Expected counts are printed below observed counts R 25 36.00 S 20 18.67 T.S 19 14.00 E.S 3.33 Total 72 E.coli 44 36.00 23 18.67 14.00 3.33 72 Sal spp 39 36.00 13 18.67 19 14.00 3.33 72 108 56 42 10 216 Sta.aureus Total Chi-Sq = 3.361 + 0.095 + 1.786 1.778 + 1.006 + 7.143 0.250 + 1.720 + 1.786 DF = 6, P-Value = 0.000 cells with expected counts less + + + 6.533 + 1.633 + 1.633 = 28.725 than 5.0 41 Chi-Square Test cho hiệu kháng khuẩn chế phẩm chủng vi khuẩn Chi-Square Test Expected counts are printed below observed counts R 18.00 S 12 9.33 T.S 13 7.00 E.S 1.67 CXH2 18.00 10 9.33 14 7.00 1.67 36 DXH1 19 18.00 12 9.33 7.00 1.67 36 DXH2 24 18.00 9.33 7.00 1.67 36 DTB 16 18.00 13 9.33 7.00 1.67 36 DRM 36 18.00 9.33 7.00 1.67 36 Total 108 56 42 10 216 CXH1 Chi-Sq = 8.000 + 0.762 + 5.143 6.722 + 0.048 + 7.000 0.056 + 0.762 + 0.571 2.000 + 0.012 + 2.286 0.222 + 1.440 + 0.000 18.000 + 9.333 + 7.000 DF = 15, P-Value = 0.000 cells with expected counts less + + + + + + 6.667 6.667 1.667 1.667 1.667 1.667 than 5.0 42 + + + + + = 89.357 Total 36 ... lớp bần, phơi hay sấy khô Glycyrrhiza uralensis Fisch Glycyrrhiza inflata Bat hoặc Glycyrrhiza glabra L.; họ Cánh bướm Fabaceae Rễ có đường kính 0,5 – 2,5 cm, dài 20 – 30 cm, màu nâu hồng, màu... 2.2.1 Escherichia coli Là giống vi khuẩn đường ruột sống bình thường ruột E coli có tên Bacterium coli commune, Bacillus, colicommunis Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em E coli xuất sớm ruột... trình chiết dừng màu dung dịch ống trụ khơng Sau đó, dịch chiết làm bay dung mơi đồng thể tích 40 ml ethanol 99,5% Nếu sau làm bay dung mơi, ta định lượng dung dịch, thể tích lớn 40 ml, ta tiếp