BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MƠI TRƯỜNG NI CHÍN TRỨNG VÀ MƠI TRƯỜNG NI PHƠI ĐỂ TĂNG HIỆU QUẢ SẢN XUẤT PHƠI BỊ IN VITRO Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : CHU LƯƠNG HÚY Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MƠI TRƯỜNG NI CHÍN TRỨNG VÀ MƠI TRƯỜNG NI PHƠI ĐỂ TĂNG HIỆU QUẢ SẢN XUẤT PHƠI BỊ IN VITRO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS CHUNG ANH DŨNG CHU LƯƠNG HÚY Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Khoá luận tốt nghiệp, bước cuối chứng minh trưởng thành sinh viên để trở thành kỹ sư đóng góp học cho phát triển đất nước Trong q trình học tập thực khố luận tốt nghiệp, em giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ động viên từ gia đình, từ quý thầy bạn Nhờ mà em hồn thành luận văn mong muốn, xin cho phép em gửi lời cám ơn sâu sắc chân thành đến: Cha mẹ người dạy dỗ nuôi em khôn lớn em bước chân vào giảng đường đại học Chú Nguyễn Hồng Ngun, Nguyễn Thị Thim thay mặt cha mẹ lo lắng, động viên cho em vượt qua khó khăn để đạt kết cuối Các thầy cô trường cấp 1, cấp xã Phước Tân, cấp Tam Phước dạy cho em kiến thức làm tảng để em tiếp thu thông tin Các thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM truyền đạt kiến thức quý báu để từ em phát triển thêm vốn hiểu biết vận dụng công việc sau Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, Ban lãnh đạo viện Khoa học Kỹ thuật Miền Nam, Phòng Cơng nghệ sinh học, tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy TS.Chung Anh Dũng, người trực tiếp hướng dẫn đề tài Trong trình làm luận văn, thầy tận tình hướng dẫn thực đề tài, giúp em giải vấn đề nảy sinh q trình làm luận văn hồn thành luận văn định hướng ban đầu Em xin cảm ơn anh Nguyễn Chí Hiếu, chị Hồng Ngọc Minh khơng quản ngại khó khăn, vất vả giúp đỡ, động viên, giải đáp thắc mắc, lời khuyên anh chị có ý nghĩa giúp em đạt kết cuối Cuối xin gửi lời cảm ơn tới chị Lê Thị Lan Chi, người chị người bạn tơi chung sức hồn thành đề tài, chia sẻ khó khăn lần đầu tiến hành nghiên cứu độc lập tác phong làm việc nhóm, có lúc có mâu thuẫn, tất bạn bè người chia chuyện buồn vui sống giúp đỡ tơi lúc khó khăn Tp Hồ Chí Minh, 07/2011 Chu Lương Húy TÓM TẮT Trong luận văn này, trứng chọc hút từ buồng trứng thụ tinh với tinh trùng đông lạnh Sau thu lò mổ, buồng trứng vận chuyển phòng thí nghiệm nước muối sinh lý (0,9% NaCl) Sau thời gian bảo quản, buồng trứng chọc hút bơm tiêm ml với đầu kim 18G Trứng nuôi dung dịch TCM-199 (bổ sung 5% huyết bê) với thời gian 20 Trứng trưởng thành thụ tinh với tinh trùng nồng độ 12 x 106 tế bào/ml Sau nuôi cấy, tinh trùng rửa trứng tiếp tục nuôi mơi trường Cr1aa Tồn quy trình ni cấy tiến hành điều kiện nhiệt độ 38,5oC 5% CO2 Kết thu cho thấy bổ sung 5% dịch nang trứng vào môi trường IVM, tỉ lệ IVM tăng cách có ý nghĩa từ 62,81% lên 77,87% Khi nuôi trứng sau thụ tinh mơi trường CR1aa có bổ sung IGF-1 với nồng độ 50, 100 ng/ml, tỉ lệ phôi dâu phôi nang cao so với nghiệm thức đối chứng, đặc biệt nồng độ 100 ng/ml (P = 0.01732) Sự kết hợp việc bổ sung dịch nang trứng vào môi trường IVM cải thiện khả trưởng thành có xu hướng cải thiện tỷ lệ thụ tinh trứng, IGF-1 vào môi trường IVC bước đầu làm tăng tỉ lệ phôi dâu phôi nang Kết cần nghiên cứu kĩ lưỡng trước đưa đến kết luận sau SUMMARY Thesis title: Research to improve IVM and IVC medium to enhance in vitro production of bovine embryos In this study, oocytes aspirated from ovaries were fertilized with frozen-thawed semen After collected from a slaughterhouse, ovaries were transported to the laboratory in physiological saline solution (0.9% NaCl) with antibiotic At the laboratory, ovaries were aspirated immediately by using a ml syringe with 18G needle Oocytes were cultured in TCM-199 medium (supplemented with 5% calf serum) for 20 hours Maturated oocytes were fertilized with sperm at a concentration of 12 x 106 cells/ml After hour co-culture, sperm was washed away and oocytes were continuously cultured in Cr1aa medium Culture condition was carried out at 38.5oC and 5% CO2 The result showed that addition of bovine follicular fluid into IVM medium led to the significant increase in mature oocyte rate (62.81% to 77.87%) Fertilized oocytes cultured in CR1aa medium supplemented with IGF-1 (at the concentrations of 50, 100 ng/ml) resulted in higher morula and blastocyst rates, especially in the 100 ng/ml treatment (P = 0.0173) The combination of adding follicular fluid into IVM medium and IGF-1 into IVF medium tended to increasing the rate of morula and blastocyst but further experiment should be carried out before having more exact conclusion MỤC LỤC Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng xi Danh sách hình xii Chương Mở đầu 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Yêu cầu đề tài 1.3.Nội dung đề tài Chương Tổng quan tài liệu 2.1.Lịch sử phát triển thụ tinh in vitro bò 2.2.Các nghiên cứu nước thuộc lĩnh vực đề tài 2.2.1.Các nghiên cứu nước 2.2.2.Các nghiên cứu nước 2.3.Thụ tinh in vitro 2.3.1.Khái niệm 2.3.2.Sinh lý sinh sản bò 2.3.2.1.Cấu tạo quan sinh dục 6 2.3.2.2.Sự phát triển nang noãn 2.3.3.Sinh lý sinh sản bò đực 2.3.3.1.Cấu tạo quan sinh dục đực 2.3.3.2.Sự tạo thành tinh trùng 11 2.3.3.3.Cấu tạo tinh trùng 12 2.3.4.Sinh lý trình thụ tinh 13 2.3.4.1.Sự hoạt hóa tinh trùng 13 2.3.4.2.Sự thụ tinh 13 2.3.4.3.Các giai đoạn phát triển phôi 14 2.3.5.Cơ chế tác động IGF-1 (Isulin like growth factor-1) 15 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 18 3.1.Thời gian địa điểm 18 3.2.Vật liệu 18 3.2.1.Đối tượng nghiên cứu 18 3.2.2.Hóa chất 18 3.2.3.Phương pháp chuẩn bị dịch nang trứng (FF) 19 3.2.4.Dụng cụ 19 3.2.5.Thiết bị 19 3.3.Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1.Thu nhận mẫu trứng bò lò mổ 19 3.3.2.Thụ tinh ống nghiệm 21 3.3.2.1.Chuẩn bị tinh dịch 21 3.3.2.2.Thụ tinh cho trứng trưởng thành 21 3.3.3.Nuôi theo dõi trứng sau thụ tinh 21 3.3.3.1.Nuôi trứng thụ tinh 21 3.3.3.2.Kiểm tra giai đoạn phát triển 22 3.3.3.3.Kiểm tra giai đoạn 22 3.4.Bố trí thí nghiệm 23 3.4.1.Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng dịch nang trứng lên trưởng thành trứng 23 3.4.1.1.Yếu tố thí nghiệm 23 3.4.1.2.Yếu tố cố định 23 3.4.1.3.Chỉ tiêu theo dõi 23 3.4.2.Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng IGF-1 lên tỷ lệ phôi in vitro 23 3.4.2.1.Yếu tố thí nghiệm 23 3.4.2.2.Yếu tố cố định 24 3.4.2.3.Chỉ tiêu theo dõi 24 3.4.3.Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng FF IGF-1 lên tỷ lệ phôi in vitro 24 3.4.3.1.Yếu tố thí nghiệm 24 3.4.3.2.Yếu tố cố định 24 3.4.3.3.Chỉ tiêu theo dõi 25 3.5.Tổng hợp xử lý liệu 25 Chương Kết thảo luận 26 4.1.Kết 26 4.1.1.Thí nghiệm Ảnh hưởng dịch nang trứng lên trưởng thành trứng 26 4.1.2.Thí nghiệm Ảnh hưởng IGF-1 lên tỷ lệ phôi in vitro 28 4.1.3.Thí nghiệm Ảnh hưởng FF IGF-1 lên tỷ lệ phôi in vitro 30 4.2.Thảo luận 31 Chương Kết luận đề nghị 34 5.1.Kết luận 34 5.2.Đề nghị 34 Tài liệu tham khảo 35 Phụ lục DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA (Bovine Serume Albumin): albumin huyết bò BO (Brackett – Oliphant): mơi trường dùng bước hoạt hóa tinh rửa trứng CS (Calf Serum): huyết bê Ctv: cộng tác viên D-PBS (Dubelco’s Phosphate Buffer Saline): dung dịch đệm phosphate Dubelco ET (Embryo Transfer): kĩ thuật cấy truyền phôi FF (Follicular Fluid): dịch nang trứng FBS (Fetal Bovine Serum): huyết thai bò IGF-1 (Isulin like growth factor-1): yếu tố tăng trưởng tương tự Isulin IVC (In vitro Culture): giai đoạn ni phơi điều kiện phòng thí nghiệm IVF (In vitro Fertilization): thụ tinh điều kiện phòng thí nghiệm IVM (In vitro Maturation): ni trứng trưởng thành điều kiện phòng thí nghiệm TCM-199 (Tissue Culture Media): mơi trường ni trứng trưởng thành 10 Hình 4.3 Trứng tinh trùng thụ tinh 4.1.2 Thí nghiệm Ảnh hưởng IGF-1 lên tỷ lệ phôi in vitro Bảng 4.2 Kết số phôi phát triển đến giai đoạn phơi nang thí nghiệm mơi trường ni phơi bò in vitro bổ sung IGF-1 nồng độ: 50, 100 ng/ml đối chứng Nồng độ IGF-1 Tổng số trứng trưởng thành Tổng số phôi tạo thành Tỷ lệ thụ tinh (%) Phôi nang Tỷ lệ phôi nang (%) Đối chứng 129 50 ng/ml 124 100 ng/ml 70 66 58 37 51,16 46,77 52,86 11 7,58 18,97 24,32 Giai đoạn sau, phôi phát triển đến phôi dâu phôi nang nghiệm thức bổ sung IGF-1 nghiệm thức: đối chứng, 50, 100 ng/ml 7,58%, 18,97%, 24,32% Khi xử lý kết tỷ lệ với trắc nhiệm χ2, P(ĐC, 50, 100) = 0,0588 khác tỷ lệ sai khác khơng có ý nghĩa mặt thống kê (P > 0,05) Nhưng xét cặp nghiệm thức bổ sung IGF-1: ĐC – 50, ĐC – 100, 50 – 100 ng/ml, cặp giá trị P(ĐC, 100) = 0,0173 có ý nghĩa thống kê (P