BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HƠ MỀM SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Học viên: Vũ Anh Tú Cao học: Khóa 17 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hoài Nam Hà Nội – 2015 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Lời cảm ơn Luận văn hồn thành Viện Hố sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, hết lòng bảo tạo điều kiện giúp đỡ thời gian làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn GS VS Châu Văn Minh, TS Nguyễn Văn Thanh, TS Nguyễn Xuân Cường tập thể cán phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Thị Thảo anh chị Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành nghiên cứu hoạt tính sinh học thử nghiệm dược lý Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Luận văn hỗ trợ kinh phí thực khuôn khổ nội dung Nhiệm vụ nhánh Hợp tác quốc tế với L.B.Nga cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nhiệm vụ Trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, VAST.TĐ.ĐAB.02/13-15 TS Nguyễn Hoài Nam làm chủ nhiệm Tác giả luận văn Vũ Anh Tú i Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Lời cam đoan Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thực hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Nam Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Vũ Anh Tú ii Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Danh mục chữ viết tắt CC Sắc ký cột (Collumn chromatography) YMC Sắc ký cột pha ngược TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatomatography) MPLC Sắc ký lỏng trung áp NMR Phổ cộng hưởng từ nhân (Nuclear Magnetic Resonance) 13C Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) HSQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single-Quantum Coherence) Mp Điểm nóng chảy (Melting point) MTT [3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide] LU-1 Dòng tế bào ung thư phổi người (Lung carcinoma cell line) MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú người (Human breast cancer cell line) KB Dòng tế bào ung thư biểu mơ HepG2 TBUT Dòng tế bào ung thư gan người Tế bào ung thư iii Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu san hơ mềm I.2 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tnh sinh học số lồi san hơ mềm điển hình thuộc giống Sinularia giới I.3 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học giống 12 Sinularia nước CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 II.1 Đối tượng nghiên cứu 13 II.2 Phương pháp nghiên cứu 14 II.2.1 Phương pháp thu thập mẫu sinh vật biển 14 II.2.2 Phương pháp nghiên cứu xử lý mẫu tạo dịch chiết 14 II.2.3 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hợp chất 16 II.2.4 Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tnh diệt tế bào ung thư 17 19 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19 III.1 Xử lý mẫu, tạo dịch chiết phục vụ nghiên cứu III.2 Phân lập hợp chất, số vật lý, liệu phổ hợp chất 20 III.3 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 25 28 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ 28 IV.1 Kết xác định cấu trúc hợp chất 52 IV.2 Đánh giá hoạt tnh gây độc tế bào hợp chất phân lập 53 KẾT LUẬN 55 Tài liệu tham khảo 58 Danh mục cơng trình cơng bố PHỤ LỤC iv Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú MỞ ĐẦU Cùng với tiến hóa nhanh văn minh nhân loại phát triển vượt bậc khoa học kỹ thuật bệnh nguy hiểm gia tăng nhiều, đặc biệt thấy gia tăng ngày lớn bệnh ung thư quái ác, thuộc tứ chứng nan y y học Nó gây nỗi ám ảnh đáng sợ cho lồi người Và biệt dược phục vụ cơng tác chữa bệnh, thực phẩm chức hỗ trợ phục hồi sức khỏe giúp người bệnh chống lại bệnh tật tốt nhà khoa học trọng nghiên cứu Các sinh vật biển có nhiều người biết đến Hải sâm, Sao biển, Cá ngựa, cầu gai, san hô, bọt biển… hay gần gũi thực phẩm giàu dinh dưỡng bữa ăn loài ốc, sò, cá, cua, sứa biển … nghiên cứu nhiều theo hướng thực phẩm thực phẩm chức Nghiên cứu nguồn hợp chất thiên nhiên biển năm 50 kỷ trước ngày nhận quan tâm nhà khoa học giới Những nghiên cứu nguồn dược liệu biển thời gian gần tăng chất lượng số lượng đạt thành đáng ý Đã có nhiều hợp chất có nguồn gốc biển trở thành loại thuốc quan trọng lĩnh vực sống loài người Các sinh vật biển trở thành tâm điểm cho nhiều cơng trình nghiên cứu có ý nghĩa to lớn cho sức khỏe đời sống Các nguồn dược liệu từ sinh vật biển bổ sung, hỗ trợ điều trị bệnh nguy hiểm ngày gia tăng xã hội phát triển Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tnh sinh học lồi san hơ góp phần chuyển sinh vật khơng có giá trị mặt hải sản trở thành sinh vật biển có giá trị nghiên cứu y dược Chính vậy, có nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm kiếm hợp chất từ san hô mềm nghiên cứu hoạt tnh sinh học hợp chất phát Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu san hô mềm San hô loài sinh vật biển thuộc lớp Anthozoa, lớp Anthozoa chia thành hai phân lớp tùy theo số xúc tu, đường đối xứng loạt phận tương ứng với kiểu xương bao gồm phân lớp san hơ có tám xúc tu gọi san hô tám ngăn Octocorallia, phân lớp san hơ có số xúc tu lớn tám bội số sáu gọi san hô sáu ngăn Hexacorallia Các san hô mềm, san hô sừng bút chì biển thuộc phân lớp san hơ Octocorallia, san hô cứng nằm phân lớp Hexacorallia Theo thống kê giới, phân lớp Octocorallia có khoảng 2000 lồi chia làm 310 giống 45 họ San hơ sinh vật đơn giản, chúng tồn khắp vùng biển, nông sâu cá thể hình trụ nhỏ có hàng xúc tu đỉnh, sử dụng để bắt mồi môi trường nước Mặc dù trông giống cây, san hô thực động vật cấu tạo tương tự sứa hải quì, chúng thuộc vào nhóm động vật biển có trâm gây ngứa (thích ty bào) Có đến hàng trăm kiểu san hô khác tất cá thể nhỏ bé, gọi polyp tạo nên Các cá thể tiết canxi cacbonat để tạo xương cứng, xây nên rạn san hô vùng biển nhiệt đới Trên giới, rạn san hô ngầm ước tính bao phủ 284.300 km2, chủ yếu vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (91,9%) Các rạn san hô mềm phân bố rộng rãi đại dương giới có vai trò quan trọng hệ sinh thái rạn san hô, chúng tạo nguồn vật chất hữu cơ, habitat, tham gia tạo rạn Cuộc sống cộng sinh san hô mềm với loài tảo biển tạo nên đặc điểm sinh học vô thú vị san hô mềm Rất nhiều hợp chất thứ cấp ditecpen dạng cembranoid, steroids … từ san hơ mềm sinh từ mối tương tác với môi trường sinh thái [1] Tuy đầu san hô trông thể sống, thực đầu nhiều cá thể giống hoàn toàn di truyền, polip Các polip sinh vật đa bào với nguồn thức ăn nhiều loại sinh vật nhỏ hơn, từ sinh vật phù du tới loài cá nhỏ Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Polip thường có đường kính vài milimet, cấu tạo lớp biểu mơ bên ngồi lớp mô bên giống sứa gọi ngoại chất Polip có hình dạng đối xứng trục với xúc tu mọc quanh miệng - cửa tới xoang vị (hay dày), thức ăn bã thải qua miệng Dạ dày đóng kín đáy polip, nơi biểu mơ tạo xương ngồi gọi đĩa Bộ xương hình thành vành hình khuyên chứa canxi ngày dày thêm Các cấu trúc phát triển theo chiều thẳng đứng thành dạng ống từ đáy polip, cho phép co vào xương ngồi cần trú ẩn Polip mọc cách phát triển khoang hình cốc (calices) theo chiều dọc, chia thành vách ngăn để tạo đĩa cao Qua nhiều hệ, kiểu phát triển tạo nên cấu trúc san hô lớn chứa canxi, lâu dài tạo thành rạn san hơ Sự hình thành xương chứa canxi kết việc polip kết lắng aragonit khoáng từ ion canxi thu từ nước biển Tuy khác tùy theo loài điều kiện mơi trường, tốc độ kết lắng đạt mức 10 g/m² polip/ngày Điều phụ thuộc mức độ ánh sáng, sản lượng ban đêm thấp 90% so với trưa Các xúc tu polip bẫy mồi cách sử dụng tế bào châm gọi nematocyst Đây tế bào chuyên bắt làm tê liệt mồi sinh vật phù du, có tiếp xúc, phản ứng nhanh cách tiêm chất độc vào mồi Các chất độc thường yếu, san hô lửa, đủ mạnh để gây tổn thương cho người Các lồi sứa hải quỳ có nematocyst Chất độc mà nematocyst tiêm vào mồi có tác dụng làm tê liệt giết chết mồi, sau xúc tu kéo mồi vào dày polip dải biểu mô co giãn gọi hầu Các polip kết nối với qua hệ thống phức tạp gồm kênh hô hấp tiêu hóa cho phép chúng chia sẻ đáng kể chất dinh dưỡng sinh vật cộng sinh Đối với lồi san hơ mềm, kênh có đường kính khoảng 50-500μm Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú cho phép vận chuyển chất trình trao đổi chất thành phần tế bào Ngoài việc dùng sinh vật phù du làm thức ăn, nhiều lồi san hơ, nhóm Thích ti (Cnidaria) khác hải quỳ (ví dụ giống Aiptasia), hình thành quan hệ cộng sinh với nhóm tảo vàng đơn bào thuộc chi Symbiodinium Thông thường, polip sống loại tảo cụ thể Thông qua quang hợp, tảo cung cấp lượng cho san hô giúp san hơ q trình canxi hóa Tảo hưởng lợi từ mơi trường an tồn, sử dụng điơxít cacbon chất chứa nitơ mà polip thải Hình I.1a Cận cảnh polip tế bào châm ( Nguồn internet) Sinh sản Hữu tnh San hô chủ yếu sinh sản hữu tnh, với 25% san hô phụ thuộc tảo (san hô đá) tạo thành quần thể đơn tnh phần lại lưỡng tnh Khoảng 75% san hô phụ thuộc tảo "phát tán giống" cách phóng giao tử (trứng tinh trùng) vào nước để phát tán quần thể san hô xa Các giao tử kết hợp với thụ tinh để hình thành ấu trùng nhỏ gọi planula, thường có màu hồng hình ơvan; quần thể san hơ cỡ trung bình năm tạo vài nghìn ấu trùng để vượt qua xác suất nhỏ việc ấu trùng tạo quần thể Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Ấu trùng planula bơi phía ánh sáng, thể quang xu hướng tnh dương, lên đến vùng nước bề mặt nơi chúng trôi dạt phát triển thời gian trước bơi trở lại xuống phía đáy biển để tìm bề mặt mà bám vào xây dựng quần thể Nhiều giai đoạn trình có tỷ lệ thất bại lớn, quần thể san hô phát tán hàng triệu giao tử, có quần thể hình thành Thời gian từ phóng giao tử ấu trùng định cư thường ngày, kéo dài đến tháng Ấu trùng san hô phát triển thành polip san hô cuối trở thành đầu san hô cách sinh sản vơ tính tạo polip Hầu hết lồi san hơ, mà khơng phải san hơ đá, khơng phát tán giao tử Các lồi phóng tinh trùng giữ trứng, cho phép phát triển ấu trùng planula lớn để sau thả đủ sẵn sàng để lắng xuống Ấu trùng phát triển thành polip san hô cuối trở thành đầu san hô mọc chồi vô tính phát triển để tạo polip Việc phóng giao tử đồng thường xảy điển hình rạn san hơ, rạn có nhiều lồi, tất san hơ rạn phóng giao tử vào đêm Sự đồng thiết yêu để giao tử đực gặp để tạo thành ấu trùng planula Những dấu hiệu hướng dẫn cho việc phóng giao tử phức tạp, xét thời gian ngắn, bao gồm thay đổi mặt trăng, thời gian mặt trời lặn, tn hiệu hóa học Việc phóng giao tử đồng thời tạo kết hình thành dạng san hơ lai, có lẽ tham gia vào q trình tạo lồi san hơ Tại số nơi, tượng san hơ phóng giao tử bật, thường xảy vào ban đêm, nước biển vốn trở nên mờ đục "đám mây" giao tử San hô phải phụ thuộc vào dấu hiệu môi trường, tùy theo loại, để xác định thời gian xác để giải phóng giao tử vào nước Có hai phương pháp mà san hơ dùng để sinh sản hữu tính, chúng khác chỗ giao tử có giải phóng hay khơng: San hô gieo rắc, phần lớn chúng sinh sản hàng loạt, phụ thuộc nặng nề vào dấu hiệu môi trường, ngược lại với san hô ấp trứng, chúng giải l s Marine Environment and Resources, VAST) A voucher specimen (SD042010_01) was deposited at the Institute of Marine Biochemistry and Institute of Marine Environment and Resources, VAST The sample of sof coral S dissecta was collected during April 2010 at Hai Van - Son Cha, Hue, Vietnam and identified by Prof Do Cong Thung (Institute of I s o l a t i o n Fresh frozen samples of the sof coral S dissecta (1.5 kg) were well grinded and extracted three times with hot MeOH (at 50 °C for h each time) The 28 28 eluting with CH2Cl2MeOH (25:1), followed by Sephadex LH-20 with MeOH-acetone (70:30) to yield compound (10 mg) Gorgost-4-ene3-one (1): White powder; 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) see table 1; ESI-MS m/z 425 [M+H]+ (C30H48O, M 424) = Ergost-4-ene-3-one (2): White Hpowder; NMR (500 MHz, CDCl3) C-NMR (125 MHz, CDCl3) and see + table 1; ESI-MS m/z 421 (C28H46O, M = [M+Na] 398) obtained solutions were filtered, combined, and concentrated under reduced pressure to yield a dark brown viscous residue (9.15 g, A) This residue was suspended in water (0.5 L) and partitioned in turn with n-hexane (2×0.5 L) and CH2Cl2 (3×0.5 24-methyleneergost-4-ene-3-one (3): White powder; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) L) The combined 13 dichloromethane soluble portions were and C-NMR (125 evaporated under reduced pressure to MHz, CDCl3) see table 2; ESI-MS m/z 397 afford CH2Cl2 extract (1.83 g, B) Extract B [M+H]+ was crudely separated by silica gel CC using (C28H44O, M = 396) gradient concentrations of ethyl acetate in n-hexane from to 100 % to yield four fractions, B-1 to B-4 Fraction B1 (647 mg) was further separated on silica gel CC using n- hexaneEtOAc (25:1) as eluents, to give three subfractions, B1.1 to B1.3 Subfraction B1.1 (253 mg) was then chromatographed over silica gel CC using Ergost-4-ene-3,6-dione (4): White powder; 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) and 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) see table 2; ESI-MS m/z 435 [M+Na]+ (C28H44O2, M = 412) 24-methylenecholest-4-ene-3,6-dione (5): White powder; 1H-NMR (500 MHz, eluent of n-hexaneacetone (14:1), and further purified by YMC RP-18 CC eluting with LH-20 CC (MeOH-acetone 1:1) Subfraction B1.3 MeOHacetoneH2O (4:2:0.2) to afford (110 mg) Compound (20 mg) was purified from subfraction B1.2 (158 mg) by silica gel CC eluting with n- hexaneEtOAc (15:1) and followed by Saphadex (230 mg) afforded (52 mg), after subjecting it to silica gel CC eluting with dichloromethaneacetone (21.5:1), followed by YMC RP-18 CC with MeOHacetone (6.5:1) 29 29 CDCl3) and 13CNMR (125 MHz, CDCl3) see table 2; ESI-MS m/z 433 [M+Na]+ H4O2, M = 410) (C28 Fraction B2 (80 mg) was separated by YMC RP-18 CC, using eluent of MeOHacetoneH2O (95:3:2) to yield three subfractions, B-2.1 to B-2.3 Subfraction B2.3 (28 mg) aforded compound (17 mg), afer subjecting it to silica gel CC eluting with n-hexaneEtOAc (8.5:1) Fraction B4 (740 mg) was passed through Sephadex LH-20 with MeOHacetone (1:1) to yield five subfractions, B4.1 to B4.5 Subfraction B4.2 (46 mg) was further separated by silica gel RESULTS AND DISCUSSION CC Compound was obtained as a white powder The 1H-NMR spectrum revealed signals of three tertiary methyl [H 0.65 (H18), 1.14 (H-19), and 0.87 (H-29), each 3H, s] and three secondary methyl groups [H 0.82 (H-26), 0.92 (H-27), and 0.90 (H28), each 3H, d, J = 7.0 Hz] A seventh methyl signal appeared as a broad singlet at H 0.96, which was overlapped with a methine multiplet of H-20, and four highfield protons at H 0.13 (1H, m, H-22), 0.20 (1H, m, H-24), 0.16 (1H, dd, J = 4.0, 6.0 Hz, H-30), and 0.46 (1H, dd, J = 4.0, 9.0 Hz, H30), is characteristic of a gorgosterol-type side chain possessing a cyclopropane ring [14, 15] In addition, one olefinic proton was identified at H 5.76 (1H, br s, H-4) The 13C-NMR spectrum of showed 30 carbon signals, of which even methyl groups were at C 12.40 (C-18), 17.79 (C-19), 21.53 (C-21), 21.96 (C- 30 30 26), 22.59 (C-27), 15.89 (C-28), and 14.70 (C- carbon signals of the ketone group was 29) A good agreement of the 13C-NMR strongly shifed upfield suggesting its data for the side chain of (table 1) conjugated location with the double bond with those of gorgost-5-eneThe 13C-NMR data for the steroidal skeleton 3,9,11-triol [9] and combination with of were similar to those of 24the HMBC ethylcholest-4-ene-3-one [16] Detailed correlations (figure 2) confirmed the analysis of other HMBC cross-peaks (figure gorgosterol- type side chain Moreover, 2) led to assignment of the structure of one ketone group [C as gorgost-4-ene-3-one [17] This is the 200.00 (C-3)] and a tri-substituted double bond [C first report of the 13C-NMR data of 124.16 (d, C-4)/172.06 (s, C-5)] were observed The 29 29 Figure 1: Chemical structures of compounds 15 Table 1: 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of 13 and reported compounds C 1b aδC δC δC δH (J = Hz) δH (J= Hz) 36.10 0.98 m 1.67 dd (5.0, 14.0) b cδC dδC δH (J = Hz) δC 35.7 36.22 1.66/1.97 m 1.66/1.97 m b 36.23 34.40 2.22/2.34 m 2.38/2.30 m 34.0 33.48 2.22/2.34 m 33.45 - 200.00 - 199.6 200.08 - 199.92 5.68 brs 124.16 5.76 brs 123.7 124.28 5.68 brs 124.28 - 172.06 - 171.9 172.15 - 171.97 32.45 1.79/2.31 m 1.81/0.98 m 32.9 32.58 1.79/0.97 m 32.56 0.89/1.33 33.26 2.35/2.22 m 31.1 31.09 0.89/1.33 m 31.47 1.47 m 36.07 1.47 m 35.6 36.14 1.47 m 36.12 0.85 m 54.25 0.89 m 53.8 54.35 0.87 m 54.39 30 30 10 - 38.99 - 38.6 39.11 - 39.10 11 21.48 1.45/1.36 m 1.49/1.37 m 21.0 21.55 1.48/1.38 m 21.55 12 40.11 1.97/1.09 m 1.15/2.02 m 39.6 40.14 1.52/2.02 m 40.15 13 - - 42.4 42.90 - 42.94 43.24 31 31 14 58.28 1.21 m 56.0 56.39 0.95 m 56.39 0.95 m 15 24.84 1.06/1.58 m 24.70 1.54/1.69m 16 28.60 1.99/1.29 m 17 56.15 0.99 m 24.2 24.71 1.55/1.04 m 28.1 28.68 1.80/1.23 m 55.9 56.46 1.07 m 28.69 1.81/1.21 m 55.7 56.47 1.06 m 18 12.40 0.65 s 11.9 12.49 0.66 s 11.7 12.49 0.64 s 19 17.79 1.14 s 17.4 17.91 1.13 s 18.3 17.90 1.11 s 35.8 35.12 1.09 m 20 35.2 35.67 0.97 m 36.1 36.68 1.31 m 21 21.1 21.53 0.96 brs 18.8 19.36 0.87 d 7.0) 18.8 19.17 0.88 d 7.0) 22 31.9 32.46 0.13 m 23 25.8 26.23 - 24 50.7 51.88 0.20 m 33.7 34.18 1.34/0.89 m 30.6 31.09 0.89/1.33 m 39.1 40.67 1.98 m 25 31.9 32.47 1.53 m 31.5 31.98 1.51 m 26 21.6 21.96 0.82 d (7.0) 27 22.2 22.59 0.92 d (7.0) 28 15.5 15.89 0.90 d (7.0) 17.6 18.14 0.73 d (7.0) 20.5 21.07 0.80 d (7.0) 15.4 15.99 0.86 d (7.0) 29 14.3 14.70 0.87 s 30 34.7 34.49 2.38/2.24 m 30.9 31.47 2.03/1.78 m 157.0 157.1 33.9 34.30 2.27 m 22.1 22.53 0.95 d (7.0) 22.1 22.40 0.95 d (7.0) 106.0 106.5 4.64 d (7.0) 4.58 d (7.0) 21.3 21.73 -0.16 dd (4.0, 6.0) 0.46 dd (4.0, 9.0) aC of gorgost-5-ene-3,9,11-triol [9], brecorded in CDCl3, cC of ergost-4-ene-3-one [10], dC for the side chain of 3β,7α-dihydroxyergosta-5,24(28)-diene [11] 30 The 1H- and 13CNMR data of and were similar to those of 1, except for diffence in the data of the side chain The most easily visible changes are the absence of four high-field proton signals and the presence of 28 carbon signals in and relative to Four secondary methyl proton signals (each 3H, d, J = 7.0 Hz) in the side chain of were observed at H 0.87 (H-21), 0.73 (H26), 0.80 (H-27), and 0.86 (H-28) suggesting for the presence of an ergosterol-type side chain, which was further confirmed by an agreement of the 13C-NMR data of The presence of a 1,1-disubstituted double bond at C 157.14 (s, C-24) and 106.57 (t, C28)/H 4.64 and (table 1) with those of ergost-4-ene-3one [10] and combination with HMBC correlations (figure 2) 4.64 (each 1H, d, J = 7.0 Hz, H-28), and secondary three methyl groups at H 0.88 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-21) and 0.95 (6H, d, J = 7.0 Hz, H-26 and H-27) indicating a 24methylene ergosterol-type side chain o f [ 1 , ] 31 Compounds and were elucidated as ergost-4- ene-3,6dione [10, 12] and 24methylenecholest4ene-3,6-dione [13] by comparison of their 13C-NMR data with the reported values and combination with 2D-NMR data This is the first report of compounds 15 from S dissecta Table 2: 1H-NMR (500 MHz) and 13C-NMR (125 MHz) data of 4, 5, and reported compounds C dδC aδC 4c 5c bδC δC δH mult (J = Hz) mult (J = Hz) δC δH 1.39/1.86 m 36.63 36.15 2.12/1.88 m 35.5 36.01 2.12/2.52 m 34.46 34.60 2.51/2.43 m 33.8 34.46 198.16 200.21 - 199.5 200.01 - brs 125.82 126.08 6.14 brs 125.5 125.94 6.12 160.77 161.75 - 161.0 161.56 - 200.98 203.03 - 202.4 202.82 - 2.63/1.99 m 46.36 47.45 2.01/2.65 m 47.8 47.28 34.44 34.84 1.87 m 34.0 34.29 2.18 m 51.09 51.60 1.34 m 50.9 51.43 1.33 m 10 39.78 40.70 - 39.1 40.30 - 11 1.46/1.60 m 23.65 21.50 1.61/1.47 m 20.8 21.37 12 1.22/2.06 m 40.07 39.74 1.21/2.07 m 39.8 39.62 13 43.07 43.15 - 42.5 43.07 - 14 56.46 57.16 1.18 m 55.8 57.02 1.15 m 15 1.57/1.14 m 24.50 24.61 1.59/1.15 m 23.9 24.46 32 16 1.28/1.87 m 28.69 28.60 1.30/1.87 m 28.0 28.50 17 55.9 56.98 56.40 1.14 m 56.5 56.29 1.14 m 18 11.9 12.54 12.52 0.69 s 11.9 12.39 0.68 s 33 19 17.4 18.03 18.22 1.13 s 17.5 18.01 1.12 s 20 36.1 36.63 36.71 1.35 m 35.6 36.11 2.11 m 21 18.8 19.39 19.45 0.90 d (7.0) 18.6 19.14 0.92 d (7.0) 22 33.7 35.97 34.60 2.51/2.43 m 34.5 35.04 1.50/1.12 m 23 30.6 26.69 31.15 1.35/0.93 m 30.9 31.42 1.84/2.06 m 24 39.1 34.40 39.66 2.07 m 156.6 157.11 - 25 31.5 29.71 32.08 1.54 m 34.2 34.29 2.17 m 26 17.6 19.77 18.14 0.76 d (3.0) 21.8 22.50 0.99 d (3.5) 27 20.5 20.53 21.15 0.82 d (7.0) 22.0 22.37 0.97 d (3.5) 28 15.4 21.41 16.08 0.75 d (3.0) 106.1 106.61 4.68/4.61 brs aC for the side chain of ergost-4-ene-3-one [10], bC of 24S-ergost-4-ene-3,6-dione [12], crecorded in CDCl3, dC of 24- methylenecholest-4-ene-3,6-dione [13] 2D-NMR spectroscopic methods and comparison of their data with the published values This is the first report of these compounds from S dissecta Acknowledgements This work was financially supported by Vietnam Academy of Science and Technology (Codes: VAST.TÐ.ÐAB.02/13–15 and VAST.HTQT.Nga.06.13-14) Figure 2: Key HMBC correlations of 1, 2, and CONCLUSION 32 Five sterols, gorgost-4-ene-3one (1), ergost-4ene-3-one (2), 24- REFERENCES methyleneergost-4ene-3-one (3), M V D'Auria, L Minale, R Riccio ergost-4-ene-3,6dione (4), and 24methylenecholest4-ene-3,6-dione (5), were isolated from the methanol extract of the soft coral Sinularia dissecta Their structures were elucidated by 1D and 33 Koh, P V Kiem, C V Minh, Y H Kim Steroidal constituents from the soft coral Sinularia dissecta and their inhibitory efects on lipopolysaccharide-stimulated production of pro-inflammatory cytokines in bone marrow- derived dendritic cells Bull Korean Chem Soc., 34(3), 949 - 952 (2013) Polyoxygenated steroids of marine origin Chem Rev., 93(5), 1839-1895 (1993) N S Sarma, M S Krishna, S G Pasha, T S P Rao, Y Venkateswarlu, P S Parameswaran Marine metabolites: The sterols of sof coral Chem Rev., 109(6), 2803-2828 (2009) V Lakshmi, R Kumar Metabolites from Sinularia species Nat Prod Res., 23(9), 801-850 (2009) B M Jagodzinska, J S Trimmer, W Fenical, C Djerassi Sterols in marine invertebrates 49 Isolation and structure elucidation of eight new polyhydroxylated sterols from the sof coral Sinularia dissecta J Org Chem., 50(9), 1435-1439 (1985) B M Jagodzinska, J S Trimmer, W Fenical, C Djerassi Sterols in marine invertebrates 51 Isolation and structure elucidation of C-18 functionalized sterols from the soft coral Sinularia dissecta J Org Chem., 50(16), 2988-2992 (1985) P Jin, Z Deng, Y Pei, H Fu, J Li, L Van Ofwegen, P Proksch, W Lin Polyhydroxylated steroids from the sof coral Sinularia dissecta Steroids, 70(8), 487493 (2005) P Ramesh, Y Venkateswarlu Novel steroid constituents of the soft coral Sinularia dissecta Steroids, 64(11), 785-789 (1999) N P Thao, N H Nam, N X Cuong, B H Tai, T H Quang, N T T Ngan, B T T Luyen, S Y Yang, C H Choi, S Kim, D Chae, Y.-S 33 H T D'Armas, B S Mootoo, W F Reynolds Steroidal compounds from the Caribbean octocoral Eunicea laciniata J Nat Prod., 63(12), 1669-1671 (2000) 10 W.-R Abraham, G SchmedaHirschmann (24S)-3β- hydroxy-ergost5-en-6-one from Cyttaria johowii Phytochemistry, 36(2), 459-461 (1994) 11 F De Riccardis, L Minale, M Iorizzi, C Debitus, C Lévi Marine sterols Side-chainoxygenated sterols, possibly of abiotic origin, from the new Caledonian sponge Stelodoryx chlorophylla Journal of Natural Products, 56(2), 282287 (1993) 12 K A Eshbakova, B Tashkhodzhaev, Z I Tursunov, K K Turgunov, K M Bobakulov, N D Abdullaev Structure of a new sterol 24S-4-en-3,6-dione from Aconitum septentrionale Chem Nat Comp., 47(1), 73-75 (2011) 13 A Migliuolo, V Piccialli, D Sica Steroidal ketones from the sponge Geodia cydonium J Nat Prod., 53(5), 1262-1266 (1990) 14 H T D'Armas, B S Mootoo, W F Reynolds Steroidal compounds Caribbean octocoral from the Eunicea laciniata J Nat Prod., 63(12), 1669-1671 (2000) 15 A Rueda, E Zubıa, M a J Ortega, J Salvá Structure and cytotoxicity of new polyhydroxylated sterols from the Caribbean gorgonian Plexaurella grisea Steroids, 66(12), 897-904 (2001) 16 P Georges, M Sylvestre, H Ruegger, P Bourgeois Ketosteroids and hydroxyketosteroids, minor metabolites of sugarcane wax Steroids, 71(8), 647652 (2006) 17 S Popov, R M K Carlson, A Wegmann, C Djerassi Minor and trace sterols in marine invertebrates General methods of analysis Steroids, 28(5), 699-732 (1976) 34 Corresponding author: Nguyen Hoai Nam Institute of Marine Biochemistry, Vietnam Academy of Science and Technology 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam E-mail: namnguyenhoai@imbc.vast.vn ... hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học giống Sinularia nước San hô mềm thuộc giống Sinularia chưa có nhiều nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu Việt Nam đầu tiến loài San hơ mềm thuộc giống Sinularia. .. thể hoạt tnh kháng viêm với giá trị IC50 4.0 ± 0.1 μM [22] Trên sở đó, luận văn với tiêu đề Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học san hơ mềm Sinularia dissecta Việt Nam ... lồi san hơ mềm Sinularia dissecta Việt Nam, khảo sát hoạt tnh sinh học gây độc tế bào chúng nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tnh tốt, tạo sở cho nghiên cứu hướng nghiên cứu chất có hoạt tnh sinh học