HOÀNG VÂN ANH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG KHÁNG SINH DRRC TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES PEUCETIUS 2014 - 2016 HOÀNG VÂN ANH Hà Nội, 1/2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 60420201 NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG KHÁNG SINH DRRC TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES PEUCETIUS HỌC VIÊN: HOÀNG VÂN ANH HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TẠ THỊ THU THỦY Hà Nội, 1/2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2017 Tác giả Hoàng Vân Anh LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn anh chị bạn phòng Sinh học phân tử, khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội - nơi thực luận văn hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tơi trình nghiên cứu Xin cảm ơn thầy cô, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình làm luận văn Lời cảm ơn sâu sắc xin dành cho gia đình người thân u tơi Xin chân thành cảm ơn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Lịch sử kháng sinh 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.3.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào 1.1.3.2 Tổn thương màng nguyên sinh chất 1.1.3.3 Ức chế trình tổng hợp protein 1.1.3.4 Ức chế tổng hợp axit nucleic 1.1.3.5 Ức chế chuyển hóa axit folic 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.2.2 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius 1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 1.3 Kháng sinh Doxorubicin 1.3.1 Giới thiệu chung Doxorubicin 1.3.2 Cấu trúc Doxorubicin 10 1.3.3 Cơ chế hoạt động Doxorubicin 11 1.4 Giới thiệu gen drrC 11 1.5 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 12 CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 13 2.1.1 Vật liệu 13 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 15 2.1.3 Hóa chất 18 2.1.4 Thiết bị 19 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ xạ khuẩn 21 2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi 22 2.2.3 Phương pháp PCR 23 2.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 26 2.2.5 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose 26 2.2.6 Phương pháp nối DNA 27 2.2.7 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 28 2.2.8 Phương pháp cắt DNA enzym giới hạn 28 2.2.9 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn E coli sốc nhiệt 29 2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans 31 2.2.11 Phương pháp biểu gen thu nhận enzym xạ khuẩn 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Tách dòng gen drrC vector tách dòng pGEM-T 33 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 33 3.1.2 Nhân gen drrC tạo vector pGEM-T drrC 34 3.1.3 Giải trình tự gen drrC 37 3.2 Tạo vector biểu pIBR25.drrC 43 3.3 Biểu gen drrC hệ xạ khuẩn Streptomyces lividans 44 3.3.1 Điều kiện thích hợp chuyển pIBR25.drrC vào xạ khuẩn 44 3.3.2 Điều kiện thích hợp biểu gen drrC 47 3.3.2.1 Nhiệt độ biểu thích hợp 47 3.3.2.2 Thời gian biểu thích hợp 48 3.3.2.3 Môi trường phù hợp để biểu protein từ chủng tái tổ hợp 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Đề xuất 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích bp base pair DNA Deoxyribonucleic acid DNR Daunorubicin DXR Doxorubicin kb kilobase kDa kilodalton PEG Polyethylene Glycols PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate PolyAcrylamide RNA Ribonucleic acid DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Kháng sinh phát qua năm Hình 1.2: Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.3: Công thức cấu tạo Doxorubicin 10 Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pGEM-T Easy 14 Hình 2.2: Cấu trúc vector biểu pIBR25 15 Hình 2.3 : Sơ đồ nghiên cứu 20 Hình 2.4: Sơ đồ phản ứng PCR 25 Hình 3.1: Streptomyces peucetius mơi trường NDYE 33 Hình 3.2: DNA tổng số tách chiết từ Streptomyces peucetius 34 Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR gen drrC 35 Hình 3.4: Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-drrC 35 Hình 3.5: Điện di DNA pGEM-T-drrC plasmid 36 Hình 3.6: pGEM-T-drrC cắt EcoRI HindIII 37 Hình 3.7: Kết so sánh gen drrC giải trình tự với gen drrC Genbank 39 Hình 3.8: So sánh độ tương đồng gen drrC tách dòng với trình tự gen drrC Genbank 42 Hình 3.9 : Khuẩn lạc E coli JM109 có chứa pIBR25.drrC 43 Hình 3.10 Kết điện di pIBR25-drrC cắt EcoRI HindIII 44 Hình 3.11: Khuẩn lạc mơi trường thạch 46 Hình 3.12: Điện di enzyme drrC điều kiện nhiệt độ khác 48 Hình 3.13: Điện di protein drrC điều kiện thời gian khác 49 Hình 3.14: Điện di protein tách chiết môi trường khác nhau: 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Chủng vi sinh vật sử dụng đề tài 13 Bảng 2.2: Thành phần môi trường LB 15 Bảng 2.3: Thành phần môi trường NDYE 16 Bảng 2.4: Thành phần môi trường AMP 16 Bảng 2.5: Thành phần môi trường R2YE 17 Bảng 2.6: Thành phầ môi trường ISP2 17 Bảng 2.7: Thành phần môi trường ISP4 18 Bảng 3.1 Khảo sát điều kiện thích hợp cho chuyển gen vào tế bào 45 Sbjct 2065 GTGTACATCTTCGACGAGCCCACGATCGGCCTGCACCCCAGCGACGTCCAGCGGCTCAGC 2124 Query 1141 CGGCTCCTGATGGAACTGGCCGAGAAGGGCAACACCGTGCTGGTGGTCGAGCACGACCGC 1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2125 CGGCTCCTGATGGAACTGGCCGAGAAGGGCAACACCGTGCTGGTGGTCGAGCACGACCGC 2184 Query 1201 GACATCATCGAGGTGGCCGAGCACGTCATCGACATCGGGCCCGGGGCCGGGCGGCACGGA 1260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2185 GACATCATCGAGGTGGCCGAGCACGTCATCGACATCGGGCCCGGGGCCGGGCGGCACGGA 2244 Query 1261 GGCGAGATCGTCTACCAGGGCGACGTCCGGGGCCTCACCGAGGCGGACACGCCGACCGGA 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2245 GGCGAGATCGTCTACCAGGGCGACGTCCGGGGCCTCACCGAGGCGGACACGCCGACCGGA 2304 Query 1321 CGGTTCCTCCGCAGGATCATCCCGATCAAGGAGCGATTCCGCGGGCCCAGGGGACACCTG 1380 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2305 CGGTTCCTCCGCAGGATCATCCCGATCAAGGAGCGATTCCGCGGGCCCAGGGGACACCTG 2364 Query 1381 GAGGTGACGGGAGCCCGGATCCACAACCTCAAGGACATCAGCGTACGGATTCCGCTCGGC 1440 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2365 GAGGTGACGGGAGCCCGGATCCACAACCTCAAGGACATCAGCGTACGGATTCCGCTCGGC 2424 Query 1441 GTACTGACCGCCGTCACCGGACCGGCTGGCTCCGGCAAGAGCACGCTCATCCACGACGTA 1500 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2425 GTACTGACCGCCGTCACCGGACCGGCTGGCTCCGGCAAGAGCACGCTCATCCACGACGTA 2484 Query 1501 CTGCTGCGGCAGCACCCCTCGGCGGTCGTCATCGACCAGTCCGCGGTCACCACCAACCGG 1560 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2485 CTGCTGCGGCAGCACCCCTCGGCGGTCGTCATCGACCAGTCCGCGGTCACCACCAACCGG 2544 Query 1561 CGTTCGAACCCGGCGACCTACACCGGCATCATGGACGAGATCCGCAGGCTGTTCGCCCGC 1620 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2545 CGTTCGAACCCGGCGACCTACACCGGCATCATGGACGAGATCCGCAGGCTGTTCGCCCGC 2604 Query 1621 GAGAACCAGGTCAGCCCCTCACTGTTCAGCTTCAACTCCGAGGGCGCCTGCCCCACCTGC 1680 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2605 GAGAACCAGGTCAGCCCCTCACTGTTCAGCTTCAACTCCGAGGGCGCCTGCCCCACCTGC 2664 Query 1681 CAGGGACACGGCATCATCTACACCGACCTCGCCTTCATGGATCCGATGATCACGACCTGC 1740 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2665 CAGGGACACGGCATCATCTACACCGACCTCGCCTTCATGGATCCGATGATCACGACCTGC 2724 Query 1741 GAGGTCTGCGCGGGGATGCGTTTCACCGATGACGTCCTGCGCCTGACCCTGCGCGGGCAG 1800 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2725 GAGGTCTGCGCGGGGATGCGTTTCACCGATGACGTCCTGCGCCTGACCCTGCGCGGGCAG 2784 Query 1801 AACATCCACGACGTGCTGTCGATGAGCGCCGCTGAGGCGGCCGAGTTCTTCACCGAACCC 1860 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 41 Sbjct 2785 AACATCCACGACGTGCTGTCGATGAGCGCCGCTGAGGCGGCCGAGTTCTTCACCGAACCC 2844 Query 1861 AAGGTTGCCAAGACCCTCCGTTCCATCAACCAGGTCGGCCTCGGCTATCTCCAGCTCGGG 1920 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2845 AAGGTTGCCAAGACCCTCCGTTCCATCAACCAGGTCGGCCTCGGCTATCTCCAGCTCGGG 2904 Query 1921 CAGCCGCTCAACACCCTCTCCGGCGGCGAGTGCCAGCGCATCAAGCTCGCCACGGAGCTT 1980 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2905 CAGCCGCTCAACACCCTCTCCGGCGGCGAGTGCCAGCGCATCAAGCTCGCCACGGAGCTT 2964 Query 1981 GGGAAGAAGGGCAGCGTCTACGTCATGGACGAGCCCACCACCGGACTCCACATGTCCGAC 2040 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2965 GGGAAGAAGGGCAGCGTCTACGTCATGGACGAGCCCACCACCGGACTCCACATGTCCGAC 3024 Query 2041 GTCGACAGCCTCGTACACCTGGTCGACGGCCTCGTCGAGAAGGGGAACTCGGTCATCGTC 2100 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| Sbjct 3025 GTCGACAGCCTCGTACACCTGGTCGACGGCCTCGTCGAGAAGGGGGACTCGGTCATCGTC 3084 Query 2101 ATCGAGCACAATCTCGACGTCGTCAAGCATGCGGACTGGGTCGTCGACCTCGGCCCCGGG 2160 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3085 ATCGAGCACAATCTCGACGTCGTCAAGCATGCGGACTGGGTCGTCGACCTCGGCCCCGGG 3144 Query 2161 GGCGGCAGCGAGGGCGGCCGGGTGATCTTTGAGGGCACCCCCGCTGACCTGGCGGAGGCC 2220 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3145 GGCGGCAGCGAGGGCGGCCGGGTGATCTTTGAGGGCACCCCCGCTGACCTGGCGGAGGCC 3204 Query 2221 GAGCACTCCGTCACTGGGCGGTTCCTCGCCGCGTCCCTGGCGGGCGCCGGTTCCGAGGCC 2280 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3205 GAGCACTCCGTCACTGGGCGGTTCCTCGCCGCGTCCCTGGCGGGCGCCGGTTCCGAGGCC Query 2281 GACCACCGGGCCCGGCGCTGA 3264 2301 ||||||||||||||||||||| Sbjct 3265 GACCACCGGGCCCGGCGCTGA Identities 3285 Gaps 2300/2301 (99%) 0/2301 (0%) Strand Plus/Plus Hình 3.8: So sánh độ tương đồng gen drrC tách dòng với trình tự gen drrC Genbank 42 3.2 Tạo vector biểu pIBR25.drrC Tiến hành cắt plasmid pGEM-T-drrC enzyme giới hạn EcoRI HindIII để thu đoạn gen drrC Tiếp cắt vector biểu pIBR25 enzyme giới hạn Cuối thực phản ứng ligase gen drrC vào vector biểu pIBR25 để tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC Biến nạp pIBR25-drrC vào E.coli JM 109, nuôi cấy môi trường thạch LB-Amp xuất khuẩn lạc (hình 3.9) Hình 3.9 : Khuẩn lạc E coli JM109 có chứa pIBR25.drrC Sau nhặt khuẩn lạc nuôi lỏng để tách DNA plasmid kiểm tra việc chuyển gen drrC vào vector pIBR25 có thành công hay không Các plasmid tách từ khuẩn lạc kiểm tra lại phản ứng cắt với enzym giới hạn Qua hình ảnh điện di (hình 3.10) quan sát thấy chiều dài đoạn DNA tương ứng với 9,3 kb tương đương với chiều dài plasmid pIBR25 (7,0kb) kết hợp với chiều dài đoạn drrC (2,3kb) Tương tự cắt plasmid enzyme sản phẩm thu tương đương với chiều dài gen mong muốn điều chứng tỏ thành công chuyển đoạn gen drrC vào vector pIBR25 để tạo vector pIBR25.drrC 43 Hình 3.10 Kết điện di pIBR25-drrC cắt EcoRI HindIII M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder; Mẫu 1: gen drrC 3.3Biểu gen drrC hệ xạ khuẩn Streptomyces lividans 3.3.1 Điều kiện thích hợp chuyển pIBR25.drrC vào xạ khuẩn Thực tế nghiên cứu cho thấy việc chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn vô khó khăn thực nhiều thử nghiệm Để tạo tế bào trần tốt cho việc chuyển gen cần thiết phải khảo sát tìm điều kiện thích hợp có ảnh hưởng đến chuyển gen như: điều kiện vi sinh vật, nồng độ lyzozyme ủ thời gian xử lý, nồng độ PEG thêm vào chuyển gen, nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc chuyển thành cơng (transformant) Để tìm điều kiện phù hợp cho thành công tạo tế bào tái tổ hợp thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu xuất chuyển gen là: Thời gian ủ lysozyme để loại bỏ lớp thành tế bào (petidoglycon) từ 20 - 70 phút; nồng độ PEG xúc tác cho trình chuyển gen từ 10 - 60% nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen từ 50 100 µg.ml-1 44 Bảng 3.1 Khảo sát điều kiện thích hợp cho chuyển gen vào tế bào ST Thiostrepton Xử lý với PEG Thời gian ủ lyzozyme T Nồng độ Khả Nồng Khả Thời Tế bào trần Tsr phát triển độ gian thích hợp µg.ml-1 S.p (%) chuyển (phút) gen 50 ++ 10 - 30 - Tỷ lệ tế bào sống cao - Không chuyển gen 60 + 20 - 40 - Tỷ lệ tế bào sống cao - Không chuyển gen 70 - 30 + 50 - Tỷ lệ tế bào sống cao - Chuyển gen thành công 80 - 40 ++ 60 - Tỷ lệ tế bào sống thấp - Chuyển gen thành công 90 - 50 - 100 - 60 - Ghi chú: (+) phát triển; (-) không phát triển; 45 70 Tế bào chết Kết khảo sát tìm điều kiện thích hợp để chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn tổng kết theo bảng 3.1 Với thời gian xử lý lysozyme 50 phút thích hợp số tế bào trần có tỷ lệ sống cao tế bào khả biến thích hợp Trong thực tế thí nghiệm ủ lysozyme thời gian ngắn có lượng tế bào loại bỏ lớp vỏ peptidoglycon, thời gian dài toàn tế bào trần chết Khi phủ kháng sinh thiostrepton với dải nồng độ khác nhau, nồng độ chủng tự nhiên bị ức chế khơng phát triển ta lấy nồng độ chuẩn để phủ kháng sinh với mẫu chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc thành công Tương tự với nồng độ PEG thích hợp 40% với nồng độ kháng sinh phủ lên đĩa chuyển gen 70 µg.ml-1 tỷ lệ tế bào nhận vector tái tổ hợp (tế bào tái tổ hợp) đạt cao (Hình 3.11) A B Hình 3.11: Khuẩn lạc môi trường thạch A) Các khuẩn lạc phát triển đĩa thạch sau chuyển gen 36 B) Đĩa cấy chuyển chủng S.lividan pIBR drrC tái tổ hợp Thực tế thí nghiệm cho thấy có số lượng tế bào chuyển thành cơng, thơng thường hiệu xuất đạt 0,2 – 0,5% thí nghiệm để khảo sát điều kiện thích hợp hầu hết phải quan sát trực tiếp chủng xạ khuẩn có điều kiện thích hợp cho chuyển gen hoàn toàn 46 khác Đặc biệt tế bào trần protoplast dễ vỡ, yếu dễ bị chết tế bào Vì cần tác động khơng thích hợp cho dù nhỏ gây chêt tế bào chuyển gen không thành công Sau chuyển gen quan sát thấy đĩa khuẩn lạc phát triển chậm nhiều so với chủng tự nhiên, tỷ lệ chuyển gen đạt thấp khuẩn lạc tiềm có khả sinh tổng hợp kháng sinh 3.3.2 Điều kiện thích hợp biểu gen drrC Để tìm điều kiện thích hợp mà vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym hiệu nhất, tiến hành thử nghiệm biểu enzym điều kiện nhiệt độ thời gian khác nhau: 3.3.2.1 Nhiệt độ biểu thích hợp Tiến hành ni cấy Streptomyces lividans mang gen drrC 28°C sau 48h để tế bào đạt pha sinh trưởng ổn định Tiếp theo biểu Streptomyces lividans mang gen drrC nhiệt độ khác 22°C, 24°C, 26°C, 28°C nuôi thời gian để kiểm tra khả biểu protein tế bào Sau thời gian biểu thu nhận protein tế bào kiểm tra qua điện di protein kết cho thấy nhiệt độ 26°C nhiệt độ thích hợp để biểu gene Qua kết điện di ta thấy nhiệt độ 26°C cho kết lượng enzyme biểu nội bào vật chủ biểu cao (băng protein số 03, hình 3.11) Cũng có nhiều ý kiến cho với điều kiện nhiệt độ cao protein biểu mạnh khơng kịp biến đổi nên thành dạng khơng tan dính thành tế bào Ở điều kiện nhiệt độ cao 26°C cho kết lượng enzym có mặt nội bào lớn nhiên lượng enzyme nội bào biểu nhiều khơng phải enzyme có khối lượng khối lượng tính tốn enzyme drrC 74,7 kDa 47 Hình 3.12 : Điện di enzyme drrC điều kiện nhiệt độ khác 1, 2, 3, tương ứng với nhiệt độ 22, 24, 26 28oC 3.3.2.2 Thời gian biểu thích hợp DrrC protein enzym nội bào biểu protein bị ảnh hưởng lớn thời gian biểu Nếu thời gian biểu ngắn lượng protein thu không đáng kể, thời gian biểu dài, protein tổng hợp chuyển trạng thái thành protein không tan gắn thành tế bào bị biến tính Tiến hành ni cấy Streptomyces lividans mang gen drrC 28°C, lắc 200 vòng/phút, thời gian 48h để tế bào đạt độ tưởng thành Tiếp biểu Streptomyces lividans mang gen drrC mức thời gian khác 12h, 24h, 36h, 48h 60h nuôi điều kiện nhiệt độ nghiên cứu thích hợp để biểu 26°C 48 Hình 3.13 : Điện di protein drrC điều kiện thời gian khác 1: thời gian biểu 36h; 2: thời biểu 48h Sau thời gian biểu khác nhau, thu nhận protein enzym nội bào điện di sản phẩm thu Qua kết điện di ta thấy, thời gian biểu gen tế bào vật chủ 36h đến 48h cho lượng protein lớn tương ứng với vạch khối lượng phân tử protein 74,7 kDa Từ kết cho thấy, điều kiện 26°C thời gian 36 -48h xạ khuẩn Streptomyces lividans mang gen drrC biểu gen tốt 3.3.2.3 Môi trường phù hợp để biểu protein từ chủng tái tổ hợp Môi trường dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng cho việc biểu thu nhận protein tế bào, tiến hành nghiên cứu thử nghiệm với 04 môi trường biểu gen khác gồm ISP2, R2YE, AMP ISP4 để biểu gen Sau thời gian lên men 48h, 26°C, phân tích kết điện di sản phẩm cho thấy điều kiện nuôi cấy môt trường R2YE chủng xạ khuẩn phát 49 triển mạnh biểu protein DrrC cao R2YE mơi trường giàu dinh dưỡng hẳn Hình 3.14: Điện di protein tách chiết môi trường khác nhau: 1,2 môi trường R2YE, 3: Môi trường ISP2 50 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Từ kết thu đề tài nghiên cứu, tơi có kết luận sau: Tách dòng thành cơng gen drrC vector pGEM-T Easy kết giải trình tự gen so sánh với trình tự gen drrC Genbank có độ tương đồng đạt 99% Thiết kế thành công vector biểu mang đoạn gen drrC vector pIBR25 biến nạp thành công vào xạ khuẩn Streptomyces lividans Đã biểu gen drrC Streptomyces lividans tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ, thời gian môi trường để biểu gen drrC Streptomyces lividans 4.2 Đề xuất Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu thu trên, xin đề xuất số kiến nghị sau: Tinh enzyme sinh Xác định hoạt tính enzyme 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt PGS TS Kiều Hữu Ảnh (2007), Giáo trình vi sinh vật học (tập 2), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyển Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 3), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ sinh học, Hà Nội Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học PGS TS Lê Gia Hy (2010), Giáo trình vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Lê Xuân Phương (2000), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất Xây dựng Hà Nội TS Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Cao Văn Thu (2000), Bài giảng kháng sinh vitamin, Trường Đại học Dược Hà Nội 52 Tiếng Anh 10 Arcamone F, CassineHG, Fantini G et al (1996)," Adriamycin 14Hydroxydaunomycin, a new antitunmor antibiotic from Streptomyces Peucetius Varaesius", Biotechnol Bioeng 11 Brawner, Mary; Poste, George; Rosenberg, Martin; Westpheling, Janet (1991) "Streptomyces: A host for heterologous gene expression" Current Opinion in Biotechnology 12 Caroline A.A , Katherline L.M.(1998), Eukaryotic ADN Topoisomease II beta, Review BioEssays 13 Champoux JJ (2001), ADN topoisomerases: structure, function, and mechanism, Annu Rev Biochem 14 Di Marco A, Gaetani M, Scarpinato B (February 1969), "Adriamycin (NSC-123,127): a new antibiotic with antitumor activity" Cancer Chemother Rep 53 15 Dr B Schlegel, C Stengel, G Schumann, H Prauser and K Eckardt (1987), Aklanonic acid-producing mutants of Streptomyces galilaeus and Streptomyces peucetius var caesius, Journal of Basic Microbiology 16 Euzéby JP (2008) "Genus Streptomyces" - List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature 17 Fornari FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA (April 1994), Interference by doxorubicin with ADN unwinding in MCF-7 breast tumor cells 18 Howard T Dulmage (March 1953), The Production of Neomycin by Streptomyces fradiae in Synthetic Media,Applied Microbiology 19 Kämpfer, Peter (2006), The Family Streptomycetaceae, Part I: Taxonomy" In Dworkin, Martin; Falkow, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heinz; Stackebrandt, Erko.The Prokaryotes 53 20 Leblond P, Redenbach M, Cullum J (1993), Physical map of the Streptomyces lividans 66 genome and comparison with that of the related strain Streptomyces coelicolor A3 21 Lomovskaya N, Otten SL(1999), "Daunorubicin over production in Streptomyces Peucetius: Cloning and characterization of the dnrU keto recductase and dnrV gene and the Dox a Cytochrome P-450 hydroxylase gene" 22 Madigan M, Martinko J, ed (2005), Brock Biology of Microorganisms 23 Momparler RL, Karon M, Siegel SE, Avila F (1976),"Effect of adriamycin on ADN, RNA, and protein synthesis in cell-free systems and intact cells" Cancer Res36 24 Natalie Lomovskaya, Sharee L Otten, Yukiko Doi-Katayama, Leonid Fonstein, Xiao-Chun Liu, Toshio Takatsu, Augusto Inventi-Solari, Silvia Filippini, Francesca Hutchinson (1999), Torti, Anna Doxorubicin Luisa Colomboand C Overproduction Richard in Streptomyces peucetius: Cloning and Characterization of the dnrU Ketoreductase and dnrV Genes and the doxA Cytochrome P-450 Hydroxylase Gene 25 N Lomovskaya, S K Hong, S U Kim, L Fonstein, K Furuya, and R C Hutchinson (1996), The Streptomyces peucetius drrC gene encodes a UvrA-like protein involved in daunorubicin resistance and production 26 Tan C, Tasaka H, Yukp, Murphy ML, Karnofsky DA (March 1967), "Daunorubicin an antitumor antibiotic in the treatment of neoplastic disease clinical evaluation with special reference to childhood leukemia " 27 Waksman, S.A (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams Wilkins Co, Baltimore, USA 28 Walcazak RJ, Dickens ML, Priestley ND, Strohl WR (1999), "Purification, Properties, and 54 Characterization of Recombinan Streptomyces sp Strain C5 DoxA, a Cytochrome P-450 Catalyzing Multiple Steps in Doxorubicin Biosynthesis” 29 Weiss RB (December 1992), The anthacylines will we ever find a better Doxorubicin, Seminars in Oncology 30 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH (2007), Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro Websites: https://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.sinhhocvietnam.com https://vi.wikipedia.org 55 ... nghiên cứu cụ thể gen Vì vậy, tơi định chọn đề tài: Nghiên cứu tách dòng biểu gen kháng kháng sinh drrC từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh. .. chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 Gen drrC gen tham gia vào trình sinh tổng hợp doxorubicin Gen drrC gen kháng kháng sinh, vừa có tác dụng sinh tổng hợp kháng sinh, vừa giúp xạ khuẩn. .. gen xạ khuẩn Streptomyces lividans Nội dung nghiên cứu - Tách dòng gen drrC - Thiết kế vector biểu pIBR25 drrC - Biểu gen drrC tế bào xạ khuẩn 12 CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1