BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG -o0o - ĐỖ NGỌC ÁNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI-2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG o0o - ĐỖ NGỌC ÁNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Ký sinh trùng Mã số : 62 72 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Khắc Lực PGS.TS Trần Thanh Dƣơng HÀ NỘI – 2017 i LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đƣợc cơng trình nghiên cứu này, tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ cá nhân, tổ chức Tơi xin bày tỏ lòng cám ơn tới Đảng ủy – Ban giám đốc Học viện Quân y, Ban lãnh đạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn, Phân viện thú y Miền Trung, Bộ môn Ký sinh trùng Côn trùng – Học viện Quân y, Phòng Khoa học Đào tạo – Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng, Trạm thú y huyện Nghĩa Đàn – Nghệ An, Đại học Đồng Tháp, Chi cục thú y Đồng Tháp, Chi cục thú y Cần Thơ… tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực thu thập mẫu vật, triển khai đề tài Đặc biệt, tơi xin tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, cảm ơn chân thành tới ngƣời thầy đáng kính PGS.TS Nguyễn Khắc Lực – Chủ nhiệm Bộ môn Ký sinh trùng Côn trùng – Học viện Quân y, PGS.TS Trần Thanh Dƣơng - Viện trƣởng Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng theo sát, động viên, đơn đốc, tận tình bảo trực tiếp hƣớng dẫn tơi q trình học tập, thu thập mẫu vật, triển khai thí nghiệm, phân tích số liệu nhƣ q trình hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn GS TS Lê Bách Quang, TS Phạm Văn Minh, TS Lê Trần Anh, PGS.TS Nguyễn Duy Bắc anh/chị em Bộ môn Ký sinh trùng Côn trùng – Học viện Quân y; PGS TS Cao Bá Lợi, PGS.TS Nguyễn Thu Hƣơng cán Phòng Khoa học Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài nhƣ cho tơi đóng góp ý kiến q báu để tơi hồn thành luận án Tôi xin cảm ơn chân thành tới Đề tài cấp Nhà nƣớc “Đặc điểm dịch tễ học biện pháp phòng chống bệnh sán gan lớn Việt Nam”, mã số ii KC.10.26/06-10 thuộc Chƣơng trình Khoa học Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu phát triển ứng dụng công nghệ phục vụ bảo vệ, chăm sóc nâng cao sức khỏe cộng đồng”, mã số KC.10/06-10 tài trợ phần kinh phí cho thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp ủng hộ giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập thực đề tài Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn tới Cha, Mẹ ngƣời vất vả sinh thành ni tơi khơn lớn để tơi có đƣợc kết nhƣ ngày hơm nay! Cảm ơn tồn thể gia đình sát cánh, động viên, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn truyền nhiệt huyết cho tơi q trình học tập hồn thành luận án Hà Nội, tháng năm 2017 Tác giả Đỗ Ngọc Ánh iii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khoa học khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tính trung thực, khách quan, khoa học kết nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2017 Tác giả iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADN ARN Bp BL BR BW BYT CT-scan CS cox1 cob CT dNTP ELISA GOT GPT ITS IUPAC Tên tiếng Anh đầy đủ Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic Base pair Body length Body roundness Body width Computer tomography scan Cytochorome c oxydase subunit Cytochrome b Deoxynucleoside triphosphates Enzyme linked immunosorbent assay Glutamic oxaloacetic transaminase Glutamic pyruvic transaminase Internal Transcribed Spacer International Union of Pure and Applied Chemistry KST LAMP Max Min MgCl2 nad1 NCBI OS PCR PCR-SSCP RFLP SR VS VS-P WHO Loop Mediated Isothermal Amplification Maximum Minimum Magnesium chloride Nicotinamide dehydrogenase subunit National Center for Biotechnology Information Oral sucker Polymerase Chain Reaction PCR - Single –Strand Conformation Polymorphism Restriction fragment length polymorphism Ventral sucker Distance between the ventral sucker and the posterior end of the body World Health Organization Nghĩa/Tên tiếng Việt Axít deoxyribonucleic Axít ribonucleic Cặp base chuỗi ADN Chiều dài thể Chu vi thể Chiều rộng thể Bộ Y tế Chụp X quang cắt lớp vi tính Cộng Một gen thuộc hệ gen ty thể Một gen thuộc hệ gen ty thể Côn trùng Đơn vị cấu tạo nên ADN Phản ứng miễn dịch gắn men Enzyme trao đổi acid amin Enzyme trao đổi acid amin Đoạn giao gen Hiệp hội Hóa học túy Hóa học ứng dụng Quốc tế Ký sinh trùng Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ADN Giá trị lớn Giá trị nhỏ Một loại muối Một gen thuộc hệ gen ty thể Trung tâm tin sinh học Quốc gia - Mỹ Giác miệng Phản ứng chuỗi Polymerase Kỹ thuật phân tích đa dạng đoạn ADN sợi đơn Kỹ thuật xác định đa hình độ dài đoạn giới hạn Sốt rét Giác bụng Khoảng cách từ giác bụng đến điểm cuối thân Tổ chức Y tế giới v MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sán gan lớn Fasciola spp bệnh sán gan lớn (Fasciolosis) 1.1.1 Đặc điểm sinh học Fasciola spp 1.1.2 Đặc điểm bệnh Fasciola spp 12 1.2 Một số yếu tố tác động tỷ lệ nhiễm SLGL ngƣời động vật 15 1.2.1 Một số yếu tố tác động tới nhiễm sán gan lớn ngƣời động vật 15 1.2.2 Tình hình nhiễm sán gan lớn ngƣời động vật 16 1.3 Các phƣơng pháp xác định loài sán gan lớn 21 1.3.1 Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola sp 21 1.3.2 Tính đa hình di truyền tầm quan trọng tính đa hình di truyền sán gan lớn 29 1.3.3 Tình hình nghiên cứu xác định lồi sán gan lớn Việt Nam 35 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu 39 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 39 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 39 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 40 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 40 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 40 2.2.3 Các phƣơng pháp kỹ thuật sử dụng nghiên cứu hình thái 45 2.2.4 Các phƣơng pháp kỹ thuật sử dụng giám định lồi, phân tích đặc điểm phân tử 49 2.2.5 Những hạn chế phƣơng pháp nghiên cứu 63 2.3 Đạo đức y đức nghiên cứu 64 vi 2.4 Xử lý phân tích kết nghiên cứu 64 2.4.1 Xử lý số liệu hình thái 64 2.4.2 Xử lý số liệu sinh học phân tử 64 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 68 3.1 Xác định số số hình thái phân loại sán gan lớn dựa vào hình thái học 68 3.1.1 Xác định số số hình thái sán gan lớn 68 3.1.2 Phân loại SLGL dựa vào số số hình thái 75 3.2 Kết xác định lồi phân tích số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam 77 3.2.1 Kết xác định loài phân loại sán gan lớn Việt Nam 77 3.2.2 Kết xác định số đặc điểm phân tử 96 Chƣơng BÀN LUẬN 112 4.1 Về kết xác định số số hình thái phân lồi sán gan lớn dựa vào hình thái 112 4.1.1 Về kết xác định phân tích số số hình thái 112 4.1.2 Về kết phân loại sán gan lớn dựa vào hình thái 120 Về kết phân loại sán gan lớn 120 4.2 Kết xác định thành phần lồi phân tích số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam 125 4.2.1 Về kết xác định thành phần loài sán gan lớn Việt Nam 125 4.2.2 Về số đặc điểm sinh học phân tử sán gan lớn Việt Nam 134 KẾT LUẬN 149 KIẾN NGHỊ 151 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 152 DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 153 TÀI LIỆU THAM KHẢO 154 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm sán gan lớn trâu/bò 19 Bảng 1.2 Chiều dài sai khác nucleotide gen thuộc hệ gen ty thể Fasciola sp (Fsp), F gigantica (Fg) F hepatica (Fh) 30 Bảng 1.3 Số lƣợng acid amin mã hóa gen tỷ lệ sai khác acid amin Fasciola sp (Fsp), F gigantica (Fg) F hepatica (Fh) 31 Bảng 2.1 Danh sách mẫu gen đích giải trình tự 44 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 55 Bảng 2.3 Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 kích thƣớc mảnh cắt giới hạn với enzyme RsaI, AluI 60 Bảng 2.4 Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R kích thƣớc mảnh cắt giới hạn với enzyme RsaI 61 Bảng 2.5 Danh sách trình tự SLGL tham khảo ngân hàng gen 65 Bảng 3.1 Một số số hình thái SLGL khu vực nghiên cứu 69 Bảng 3.2 Một số số hình thái SLGL vật chủ khác 70 Hình 3.3 Chiều dài SLGL thu từ dê, cừu Ninh Thuận từ trâu Nghệ An 2015 71 Bảng 3.3 Kích thƣớc số số hình thái SLGL thu thập từ ngƣời 71 Bảng 3.4 Sự khác biệt số hình thái SLGL thu từ bò khu vực nghiên cứu 72 Bảng 3.5 Sự khác biệt hình thái SLGL thu từ trâu khu vực nghiên cứu 73 Bảng 3.6 Sự khác biệt hình thái SLGL thu từ bò trâu 74 Bảng 3.7 So sánh hình thái F gigantica Fasciola sp Việt Nam 74 Bảng 3.8 Phân nhóm SLGL động vật theo khu vực địa lý dựa vào chiều dài thể 75 viii Bảng 3.9 Phân nhóm SLGL thu thập động vật dựa vào chiều dài thể 75 Bảng 3.10 Kích thƣớc số hình thái nhóm SLGL 76 Bảng 3.11 Phân nhóm SLGL theo tỷ số Dài/Rộng 76 Bảng 3.12 Kích thƣớc số hình thái nhóm SLGL phân loại theo tỷ số chiều dài/chiều rộng 77 Bảng 3.13 Kết phân nhóm 17 mẫu SLGL dựa trình tự đoạn gen cox1 hệ gen ty thể 81 Bảng 3.14 Kết phân loại số mẫu SLGL dựa vào gen nad1 84 Bảng 3.15 Kết phân loại loài SLGL phƣơng pháp PCR-RFLP dựa vào thị gen ITS1 enzyme RsaI 87 Bảng 3.16 Phân bố loài SLGL theo khu vực địa lý 87 Bảng 3.17 Phân bố loài SLGL theo vật chủ 88 Bảng 3.18 Phân bố lồi theo nhóm kích thƣớc chiều dài SLGL 88 Bảng 3.19 Kết phân nhóm 16 chủng SLGL dựa trình tự đoạn gen ITS1 hệ gen nhân 89 Bảng 3.20 Kết phân nhóm 16 mẫu SLGL dựa trình tự đoạn gen ITS-2 hệ gen nhân 92 Bảng 3.21 Bảng liên quan phân loại hình thái với kết phân tích lồi PCR-RFLP SLGL thu từ động vật 95 Bảng 3.22 Bảng liên quan phân loại hình thái với kết phân tích lồi PCR-RFLP mẫu đƣợc so sánh trình trình tự 95 Bảng 3.23 Tỷ lệ tƣơng đồng đoạn nucleotide chứa phần gen cox mẫu sán gan lớn Việt Nam với giới 97 Bảng 3.24 Các vị trí có sai khác đoạn nucleotide chứa phần đoạn gen cox1 chủng SLGL Việt Nam giới 98 Bảng 3.25 Tỷ lệ tƣơng đồng nucleotide gen nad1 SLGL nghiên cứu với chủng ngân hàng gen 101 ... tích số đặc điểm phân tử sán gan lớn Việt Nam 125 4.2.1 Về kết xác định thành phần loài sán gan lớn Việt Nam 125 4.2.2 Về số đặc điểm sinh học phân tử sán gan lớn Việt Nam 134 KẾT LUẬN... i Việt Nam đƣợc thực nhằm mục tiêu: Xác định số số hình thái phân loại sán gan lớn Việt Nam phƣơng pháp hình thái học Xác định thành phần lồi phân tích số đặc điểm sinh học phân tử sán gan lớn. .. Kết xác định loài phân loại sán gan lớn Việt Nam 77 3.2.2 Kết xác định số đặc điểm phân tử 96 Chƣơng BÀN LUẬN 112 4.1 Về kết xác định số số hình thái phân lồi sán gan lớn dựa vào