VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỖ HẢI LAN ẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đỗ Hải Lan NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz) Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Lê Trần Bình Viện Cơng nghệ sinh học PGS.TS Lê Văn Sơn Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2017 i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình PGS TS Lê Văn Sơn, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam người thầy tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu thực hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn lãnh đạo tập thể cán Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng diểm cơng nghệ gen, Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, phận Quản lý đào tạo sau đại học, Viện Công nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi mặt, hỗ trợ thực thủ tục cần thiết để tơi hồn thành chương trình học tập nghiên cứu Nghiên cứu sinh Tôi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ quý báu TS Hoàng Văn An NCS Võ Thị Xuân Kiều, College of Life Science, Kyung Hee University, Hàn Quốc q trình tơi thực luận án Tơi nhận tạo điều kiện giúp đỡ mặt từ Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - Hóa, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Đào tạo sau đại học, Trường Đại học Tây Bắc suốt q trình thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, đồng nghiệp ln động viên khích lệ tơi thời gian qua Hà Nội, tháng 11 năm 2017 Tác giả luận án Đỗ Hải Lan ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi, thực hướng dẫn khoa học GS.TS Lê Trần Bình PGS TS Lê Văn Sơn Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả khác Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2017 Tác giả luận án Đỗ Hải Lan iii MỤC LỤC Nội dung Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung sắn 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Vai trò giá trị kinh tế 1.1.3 Tình hình phát triển sắn 1.2 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro hệ thống chuyển gen sắn 10 1.2.1 Nghiên cứu chọn tạo giống sắn theo phương pháp truyền thống 10 1.2.2 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro tái sinh 11 1.2.3 Các nghiên cứu quy trình chuyển gen sắn 15 1.2.4 Tạo sắn chuyển gen tăng cường hàm lượng tinh bột 18 1.3 Tinh bột q trình tạo tinh bột có củ 23 1.3.1 Giới thiệu tinh bột 23 1.3.2 Cơ chế tổng hợp tinh bột 24 1.3.3 Các enzim gen liên quan tích lũy tinh bột 26 1.4 Gen tổng hợp biểu thực vật 31 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Các phương pháp liên quan đến nuôi cấy mô, tái sinh sắn chuyển gen 37 2.2.2 Các phương pháp liên quan đến tổng hợp gen thiết kế vector mang gen nhân tạo mã hóa enzyme AGPase phục vụ cho chuyển gen 42 2.2.3 Các phương pháp liên quan đến phân tích dòng chuyển 49 iv gen 2.2.4 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 52 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 Kết xây dựng quy trình ni cấy tái sinh sắn 53 3.1.1 Kết đánh giá khả tạo phôi soma 54 3.1.2 Kết đánh giá khả tái sinh phôi soma 58 3.2 Kết tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thị gus vào sắn 62 3.2.1 Tối ưu chủng vi khuẩn A tumefaciens vector chuyển gen vào sắn 62 3.2.2 Tối ưu vật liệu phương pháp lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens vào sắn 64 3.2.3 Tối ưu thời điểm lây nhiễm mật độ vi khuẩn A tumefaciens cho chuyển gen vào mảnh mầm sắn KM94 66 3.2.4 Tối ưu nồng độ (AS) thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens 66 3.2.5 Tối ưu thời gian đồng nuôi cấy 68 3.2.6 Tối ưu loại kháng sinh ngưỡng chọn lọc 69 3.2.7 Phân tích sắn KM94/pCB-gus 72 3.3 Kết thiết kế vector mang gen mã hóa AGPase 73 3.3.1 Tổng hợp gen nhân tạo mã hóa AGPase 73 3.3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen AGPopt 77 3.3.3.Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp chứa vector pBI121/AGPopt thiết kế 79 3.3.4 Đánh giá biểu gen AGPopt thuốc 80 3.4 Chuyển gen AGPopt vào sắn 88 3.4.1 Biến nạp gen AGPopt vào sắn KM94 nhờ A tumefaciens CV58/pGV2260 88 3.4.2 Phân tích sắn chuyển gen KM94/AGPopt 90 CHƢƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 93 v 4.1 Nuôi cấy mô tái sinh sắn phục vụ chuyển gen 93 4.2 Chuyển gen thị chọn lọc gus vào sắn 99 4.3 Tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa enzyme AGPase thiết kế vector pBI121/AGPopt 103 4.4 Chuyển gen AGPopt vào sắn KM94 108 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 112 SUMMARY 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 PHỤ LỤC vi DANH MỤC BẢNG STT Bảng 1.1 Tên bảng Trang Danh mục loại chiếm kim ngạch xuất cao ngành nông nghiệp 2015 Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lượng sắn năm 2016 Bảng 3.1 Ảnh hưởng 2,4D, picloram NAA lên tỉ lệ tạo phôi soma từ loại vật liệu giống sắn KM140 KM94 56 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ picloram tới hình thành phơi soma từ đỉnh chồi non hai giống sắn KM94 KM140 nuôi cấy in vitro Bảng 3.3 58 Ảnh hưởng BAP IBA lên khả tạo chồi phôi soma từ non đỉnh chồi giống sắn KM140 KM94 Bảng 3.4 59 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến q trình tạo chồi từ phơi soma sau tuần nuôi cấy 60 Bảng 3.5 Khả tạo rễ chồi 61 Bảng 3.6 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn A tumefaciens, vector loại vật liệu lây nhiễm đến hiệu hiệu chuyển gen gus vào sắn KM94 KM140 Bảng 3.7 63 Ảnh hưởng phương pháp loại vật liệu lây nhiễm đến hiệu chuyển gen gus vào sắn KM94 KM140 Bảng 3.8 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn thời điểm lây nhiễm đến hiệu chuyển gen gus vào mầm sắn KM94 Bảng 3.9 65 66 Ảnh hưởng nồng độ AS thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen gus vào mầm sắn KM94 67 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy nồng độ AS đến hiệu chuyển gen gus vào mầm sắn KM94 68 Bảng 3.11 Ảnh hưởng ngưỡng chọn lọc kanamycin, neomycin 70 vii paromomycin lên hiệu chuyển gen gus vào mầm sắn KM94 Bảng 3.12 Hiệu chuyển gen AGPopt vào thuốc K326 81 Bảng 3.13 Hàm lượng tinh bột thuốc K326/pBI121/AGPopt 87 Bảng 3.14 Khả tạo tạo chồi rễ mẫu sắn KM94 /AGPopt 90 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Hình 1.1 Diện tích trồng sắn phân theo vùng kinh tế Hình 1.2 Cơ cấu sử dụng sắn Việt Nam 10 Hình 1.3 Sơ đồ bước tái sinh sắn 12 Hình 1.4 Sơ đồ bốn hệ thống chuyển gen vào sắn 16 Hình 1.5 Các phản ứng sinh tổng hợp tinh bột 26 Hình 1.6 Các enzim tham gia sinh tổng hợp tinh bột 19 Hình 1.7 Cấu trúc enzim AGPase 24 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 36 Hình 2.2 Sơ đồ bước thiết kế vector pBI121/AGPopt 42 Hình 2.3 Sơ đồ tổng hợp vector pBI121/AGPopt 47 Hình 2.4 Sơ đồ bước tách chiết enzim AGPase 51 Hình 3.1 Hình ảnh minh họa bước chuẩn bị, tạo vật liệu khởi đầu Trang phục vụ tái sinh sắn 53 Hình 3.2 Các loại vật liệu cho ni cấy mô tái sinh sắn 54 Hình 3.3 Hình ảnh mẫu qua giai đoạn tái sinh sắn khác 62 Hình 3.4 Kết nhuộm X-gluc với loại vật liệu lây nhiễm 64 Hình 3.5 Số lượng KM94/pCB-gus tạo thành mơi trường chọn lọc với kháng sinh có nồng độ khác 72 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen nptII từ dòng sắn chuyển gen Hình 3.7 Kết so sánh trình tự nucleotide gen AGPopt glgC E coli K12 Hình 3.8 Hình 3.9 73 75 Hình 3.8 Kết so sánh trình tự protein suy diễn từ gen AGPopt với glgC (E coli K12) 76 Sơ đồ cấu trúc gen AGPopt tổng hợp nhân tạo 77 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm phản ứng cắt vector pBI121 pUCIDT/AGPopt XbaI SacI 78 133 143 Preiss J (1998) Biosynthesis of starch and its regulation In: Preiss J., ed The biochemistry of plant 181-254 144 Puigbò P, Guzmán E, Romeu A, Garcia-Vallvé S (2007) OPTIMIZER: Aweb server for optimizing the codon usage of DNA sequences Nucleic Acids Research 35: W126–W131 145 Raemakers CJJM (1993) Primary and cyclic somatic embryogenesis in cassava Manihot esculenta Crantz PhD Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands 119 146 Raemakers CJJM, Amati M, Staritsky G, Jacobsen E, Visser RGF (1993) Cyclic somatic embryogenesis and plant regeneration in cassava Annals of Botany 71:289-294 147 Raemakers CJJM, Bessembinder J, Staritsky G, Jacobsen E, Visser RGF (1993) Induction, germination and shoot development of somatic embryos in cassava Plant Cell Tissue and Organ Culture 33:151-156 148 Raemakers CJJM, Schavemaker CM, Jacobsen E, Visser RGF (1993) Improvements of cyclic somatic embryogenesis of cassava (Manihot esculenta Crantz) Plant Cell Reports 12:226-229 149 Raemakers CJJM, Sofiari E, Jacobsen E, Visser RGF (1997) Regeneration and transformation of cassava Euphytica 96: 153–161 150 Raemakers CJJM, Sofiari E, Taylor NG, Henshwa E, Jacobsen E, Visser RGF (1996) Production of transgenic cassava plants by particle bombardment using luciferase activity as a selection maker Molecular Breeding 2:339-349 151 Ral JP, Bowerman AF, Li Z, Sirault X, Furbank R, Pritchard JR (2012) Down-regulation of glucan water-dikinase activity in wheat endosperm increases vegetative biomass and yield Plant Biotechnol Journal 10:871–82 152 Regierer B, Fernie AR, Springer F, Perez-Melis A, Leisse A, Koehl K (2002) Starch content and yield increase as a result of altering adenylate pools in transgenic plants Nature Biotechnology 20:1256–60 153 Ren JS (1996) Cassava products for food and chemical industries: China 134 In: Dufour DO, Brien GM and Best R, eds Cassava floor and starch: progress in research and development CIAT, Cali Colombia 48-54 154 Roldán I, Wattebled F, Mercedes LM, Delvalle D, Planchot V, Jimenez S (2007) The phenotype of soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana suggests a novel function of elongation enzymes in the control of starch granule formation Plant Journal 49:492–504 155 Rösti S, Rudi H, Rudi K, Opsahl-Sorteberg HG, Fahy B, Denyer K (2006) The gene encoding the cytosolic small subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase in barley endosperm also encodes the major plastidial small subunit in the leaves Journal of Experimental Botany 57: 3619–3626 156 Rudder S, Doohan F, Creevey CJ, Wendt T, Mullins E (2014) Genome sequence of Ensifer adhaerens OV14 provides insights into its ability as a novel vector for the genetic transformation of plant genomes BMC Genomics 15:268 157 Rybicki EP, Williamson A-L, Meyers A, Hitzeroth II (2014) Vaccine farming in capetown Hum Vaccin 7:339–348 158 Saithong T, Rongsirikul O, Kalapanulak S, Chiewchankaset P, Siriwat W, Netrphan S, Suksangpanomrung M, Meechai A, Cheevadhanarak S (2013) Starch biosynthesis in cassava: a genome-based pathway econstruction and its exploitation in data integration BMC Systems Biology 7:75 159 Salvador E, Steenkamp V, McCrindle CME (2014) Production, consumption and nutritional value of cassava (Manihot esculenta Crantz) in Mozambique: an overview Journal of Agricultural Biotechnology and Sustainable Development 6:29–38 160 Sambrook J, Fritsch E, Maniatis J (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press 161 Sarria R, Torres E, Angel F, Chavarriaga P, Roca WM (2000) Transgenic plants of cassava (Manihot esculenta) with resistance to Basta obtained by Agrobacterium-mediated transformation Plant Cell Reports 19:339–344 135 162 Sarria R, Torres E, Balcazar N, Destefano L, Roca WM (1995) Progress in Agrobacterium-mediated transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz) In: The cassava biotechnology network: proceedings of the second international scientific meeting, Bogor, Indonesia (August 1994) 241 163 Sayre R, Beeching JR, Cahoon EB, Egesi C, Fauquet C, Fellman J, Fregene M, Gruissem W, Mallowa S, Manary M, Maziya-Dixon B, Mbanaso A, Schachtman DP, Siritunga D, Taylor N, Vanderschuren H, Zhang P (2011) The BioCassava Plus Program: Biofortification of Cassava for Sub-Saharan Africa Annual Review of Plant Biology 62: 251–272 164 Schöpke C, Franche C, Bogusz D, Chavarriaga P, Fauquet C, Beachy RN (1993) Transformation in Cassava (Manihot esculenta Crantz) In: Bajaj YPS, ed Biotechnology in agriculture and forestry Vol 23: plant protoplasts and genetic engineering IV Springer, Berlin Heidelberg New York 273-289 165 Schünemann D, Borchert S, Flügge U-I, Heldt HW (1993) ATP/ADP translocator from pea root plastids: comparison with translocators from spinach chloroplasts and pea leaf mitochondria Plant Physiology 103:131–137 166 Scofield GN, Hirose T, Gaudron JA, Upadhyaya NM, Ohsugi R, Furbank RT (2002) Antisense suppression of the rice sucrose transporter gene, OsSUT1, leads to impaired grain filling and germination but does not affect photosynthesis Functional Plant Biology 29:815–26 167 Shewmaker CK, Boyer CD,Wiesenborn DP, Thompson DB, BoersigMR, Oakes JV (1994) Expression of Escherichia coli glycogen synthase in the tubers of transgenic potatoes (Solanum tuberosum) results in a highly branched starch Plant Physiology 104: 1159–66 168 Singh P, Punjabi M, Jolly M, Rai RD, Sachdev A (2013) Characterization and expression of codon optimized soybean phytase gene in E coli Indian Jounal of Biochemistry & Biophysics 50:537-547 169 Siritunga D, Sayre RT (2003) Generation of cyanogen-free transgenic cassava Planta 217: 367–373 136 170 Smidansky ED, Clancy M, Meyer FD, Lanning SP, Blake NK, Talbert LE, Giroux MJ (2002) Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activity in wheat endosperm increases yield Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States 99: 1724–1729 171 Smith AM, Neuhaus HE, Stitt M (1990) The impact of decreased activity of starch branching enzyme on photosynthetic starch synthesis in leaves of wrinkled-seeded peas Planta 181(3):310-5 172 Sofiari E (1996) Regenration and transformation in cassava Manihot esculenta Crantz PhD Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands 136 173 Stamp JA (1982) Somatic embryogenesis in cassava Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 105:183-187 174 Stamp JA, Henshaw GG (1987) Secondary somatic embryogenesis and plant regeneration in cassava Plant Cell Tissue and Organ Culture 10:227-233 175 Stark DM, Timmerman KP, Barry GF, Preiss J, Kishore GM (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADP-glucose pyrophosphorylase Science 258: 287–292 176 Su WW (2002) Cell culture and regeneration of plant tissues In: Khachatourians GG, McHughen A, Scorza R, Nip WK, Hui YH, eds Transgenic Plants and Crops Marcel Dekker, New York: 151–176 177 Szabados L, Hoyos R, Roca W (1987) In vitro somatic embryogenesis and plant regeneration of cassava Plant Cell Reports 6:248-251 178 Szydlowski N, Ragel P, Raynaud S, Roldán I, Montero M, Lucas MM (2009) Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of either class IV or class III starch synthase Plant Cell 21:2443–57 179 Taylor N, Gaitan-Solis E, Moll T, Trauterman B, Jones T, Pranjal A, Trembley C, Abernathy V, Corbin D, Fauquet CM (2012) A high-throughput platform for the production and analysis of transgenic cassava plants Tropical Plant Biology Journal 127–139 137 180 Taylor NJ, Chavarriaga P, Raemakers K, Siritunga D, Zhang P (2004) Development and application of transgenic technologies in cassava Plant Molecular Biology 56: 671–688 181 Taylor NJ, Edwards M, Henshaw GG (1995) Production of friable embryogenic calli and suspension culture system in two genotypes of cassava In: Second International Scientific Meeting of Cassava Biotechnology Network 11 Bogor Indonesia: 229-240 182 Taylor NJ, Munyaradzi VM , Rosa C, Thao H, Schöpke C, Fauquet CM (2001) Production of embryogenic tissues and regeneration of transgenic plants in cassava (Manihot esculenta Crantz) Euphytica 120: 25–34 183 Tessy J, Hock-Hin Y, Chiang-Shiong L (2001) Linamarin content and genetic stability of cassava plants derived by somatic embryogenesis Euphytica 120: 7–13 184 Tiessen A, Hendriks JH, Stitt M, Branscheid A, Gibon Y, Farré EM, Geigenberger P (2002) Starch synthesis in potato tubers is regulated by posttranslational redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase: a novel regulatory mechanism linking starch synthesis to the sucrose supply Plant Cell 14(9): 2191-213 185 Trần Cơng Khanh, Hồng Kim, Nguyễn Hữu Hỷ (2011) Giống Sắn KM140 http://iasvn.org/chuyen-muc/Giong-San-KM94-507.html 186 Vanderschuren H, Moreno I, Anjanappa RB, Zainuddin IM, Gruissem W (2012) Exploiting the combination of natural and genetically engineered resistance to cassava mosaic and cassava brown streak viruses impacting cassava production in Africa PLoS ONE 7(9): e45277 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045277 187 Waltz E (2016) Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation Nature 532:293 138 188 Wang Z, Chen X, Wang J, Liu T, Liu Y, Zhao L (2007) Increasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants Plant Cell Tissue Organ 88:83–92 189 Webster GR, Teh AYH, Ma JKC (2017) Synthetic Gene Design—The Rationale for Codon Optimization and Implications for Molecular Pharming in Plants Biotechnology and Bioengineering 114: 190 Weichert N, Saalbach I, Weichert H, Kohl S, Erban A, Kopka J (2010) Increasing sucrose uptake capacity of wheat grains stimulates storage protein synthesis Plant Physiology 152:698–710 191 Weng L, Deng L, Lia F, Xiao G (2014) Optimization of the Cry2Aa gene and development of insect-resistant and herbicide-tolerant photoperiodsensitive genic male sterile rice Czech J Genet Plant Breed 50: 19–25 192 Wenham JE (1995) Post-harvest deterioration of cassava - A biotechnology perspective Natural Resources Institute Chatham, UK FAO Plant Production and Protection: 130 193 Wheatley CC, Chuzel G (1993) Cassava: the nature of the tuber and use as a raw material In: Macrae R, Robinson RK, Saddler MJ, eds Encyclopedia of Food science, Food technology and Nutrition Academic Press, San Diego, CA: 734-743 194 Wiwithaphon S, Suttangkakul A, Leelapon O, Teerakathiti T, Boonseng O, Duerasor O, Paktanadechanon U, Chanvivattana Y (2013) Study of the Role of Cassava MFT Members in Storage Organ Development International Graduate Research Conference 195 Woo JW, Kim J, Kwon SI, Corvalán C, Cho SW, Kim H, Kim SG, Kim ST, Choe S, Kim JS (2015) DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins Natural Biotechnology 33:1162–1164 139 196 Wu G, Bashir-Bello N, Freeland SJ (2006) The synthetic gene designer: A flexible web platform to explore sequence manipulation for heterologous expression Protein Expression and Purification Jounal 47:441–445 197 Xue FY, Guo H, Hu Y, Liu R, Huang L, Lv H, Liu C, Yang M, Ma L (2016) Expression of Codon-Optimized Plant Glycosyltransferase UGT72B14 in Escherichia coli Enhances Salidroside Production BioMed Research International 198 Zainuddin I, Schlegel K, Gruissem W, Vanderschuren H (2012) Robust transformation procedurefortheproduction of transgenic farmer-preferred cassava cultivars Plant Methods 8:24 199 Zeeman SC, Kossmann J, Smith AM (2010) Starch: Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants Annual Reviews Plant Biology 61:209-234 200 Zhang P, Phansiri S, Puonti-Kaerlas J (2001) Improvement of cassava shoot organogenesis by the use of silver nitrate in vitro Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67: 47–54 201 Zhang P, Potrykus I, Puonti-Kaerlas J (2000) Efficient production of transgenic cassava using negative and positive selection Transgenic Research 9:405–415 202 Zhang Y, Chen X, Wang H, Xia Zhiqiang, Ling Peng, Wang Wenquan (2016) Annotation and validation of genes involved in photosynthesis and starch synthesis from a Manihot full-length cDNA library Frontiers of Agricultural Science Engineering 3(4): 308–320 203 Zhu ZP, Hylton CM, Rossner U, Smith AM (1998) Characterization of starch debranching enzymes in pea embryos Plant Physiology 118: 561-590 204 Zrenner R, Salanoubat M,Willmitzer L, Sonnewald U (1995) Evidence of the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants (Solanum tuberosum L.) Plant Journal 7:97–107 PHỤ LỤC Sơ đồ cấu trúc vector pBI121 Cấu trúc vector tổng hợp pUCIDT-AMP:AGPopt AGPopt pUCICT-AMP: AGPopt Ref ID: 64938955 2,674,781,9 g/mole Trình tự nucleotide gen AGPopt tổng hợp nhân tạo Sơ đồ biểu diễn đồ gen tổng hợp nhân tạo AGPase Sơ đồ bƣớc xác định hoạt tính enzim AGPase Quy trình tái sinh sắn phục vụ chuyển gen Vật liệu: đỉnh chồi, thùy non Môi trường cảm ứng tạo phôi soma MS bổ sung: Picloram 12 mg l Môi trường cảm ứng tạo chồi MS bổ sung: BAP 0,3 mg l Mơi trường tạo rễ MS khơng bổ sung kích thích sinh trưởng Quy trình chuyển gen thị gus v o sắn Chủng vi khuẩn/vector A tumefaciens CV58/pGV2260/pBI121 Phương pháp vật liệu lây nhiễm Lắc mẫu với huyền phù vi khuẩn với tốc độ 50 v/p; mảnh mầm Thời điểm lây nhiễm mật độ vi khuẩn Mật độ khuẩn OD 0,8 600 Thời điểm: sau cảm ứng môi trường tạo phôi soma ngày Nồng độ AS thời gian lây nhiễm AS 100 μM; Thời gian lây nhiễm 15 phút Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp AS 150 μM; Thời gian đồng ni cấy ngày Loại kháng sinh ngưỡng chọn lọc thích hợp Kanamycin 50 mg/l Hoạt tính AGPase thuốc K326/AGPopt Hoạt tính AGPase Tỉ lệ % so với đối chứng ĐC 0.1 100% L1 0.137 137% L2 0.145 145% L3 0.137 137% L4 0.144 144% L5 0.140 140% L6 0.121 121% L7 0.153 153% L8 0.146 146% Thành phần môi trường nuôi cấy in vitro Loại môi trường Thànhh phần MS lỏng MS (I-V) + Sucrose 30 mg/l; pH 5,8 MS đặc MS lỏng + 7,5 g Agar CIM MS (I - V) bổ sung picloram 12 mg/l, sucrose 30 g/l 7,5g agar, pH 5,8 CEM MS (I - V) bổ sung BA 0,3 mg l, sucrose 30 mg l 7,5g agar, pH 5,8 10 Thành phần môi trường nuôi khuẩn Môi trường YEB đặc Thành phần g/l yeast extract + g/l beef extract + g/l NaCl + g/l tryptone + g/l sucrose 15 g/l bacto agar, pH = 7,0 YEB lỏng g/l yeast extract + g/l beef extract + g/l NaCl + g/l tryptone + g/l sucrose, pH = 7,0 LB lỏng 10 g/l Tryptone+ g/l yeast Extract + 10 g/l NaCl, pH = 7,0 LB đặc 10 g/l Tryptone+ g/l yeast Extract + 10 g/l NaCl, 15 g/l bacto agar, pH = 7,0 11 Thành phần sol I, sol II, sol III Sol I: 50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris (pH 8,0) Sol II: 0,2 N NaOH, % SDS Sol III: M KOAc (pH 6,0) ... vụ chuyển gen 93 4.2 Chuyển gen thị chọn lọc gus vào sắn 99 4.3 Tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa enzyme AGPase thiết kế vector pBI121 /AGPopt 103 4.4 Chuyển gen AGPopt vào sắn. ..VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đỗ Hải Lan NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz) Chuyên ngành:... biến vào trình tự gen nhân tạo để gia tăng hiệu sinh tổng hợp tinh bột Về kỹ thuật di truyền tập trung thiết kế vector chuyển gen mang gen tổng hợp nhân tạo, tiến hành kiểm tra hoạt động vector gen