BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** NGUYỄN THỊ THU HÀ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N-ACYL-L-HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Hoàng Hoa Long HÀ NỘI - 2015 MỞ ĐẦU Cây khoai tây (Solanum tuberosum L), thuộc họ Cà (Solanaceae) lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Khoai tây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, người Pháp đưa vào Việt Nam từ năm 1890 Có thời kỳ khoai tây xem lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngơ Khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao khoai tây có chứa vitamin, khống chất, caronoids phenol tự nhiên Khoai tây không lương thực mà dược phẩm Một nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát khoai tây chứa hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp ăn thường xuyên Trong nghiên cứu khác gần đây, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Đại học Y Toronto Canada phát thấy khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Theo thông tin Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Việt Nam quốc gia có khả phát triển mạnh khoai tây, nhiều đồng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ Tây Nguyên, với diện tích ước tính 200.000 Tuy nhiên, diện tích trồng khoai tây đạt 30.000-35.000 ha, với suất 10-11 tấn/ha Một nguyên nhân dẫn đến giảm suất diện tích trồng khoai tây tình trạng gây hại sâu bệnh, đặc biệt bệnh thối nhũn vi khuẩn Erwinia gây ra, phổ biến loài Erwinia carotovora subsp carotovora (Ecc) Bệnh gây chủ yếu loài trồng có giá trị kinh tế cao thuộc họ cà, họ thập tự, họ bầu bí, họ hành, số loài hoa lan… Bệnh gây hại cho từ trồng ngồi đồng ruộng thu hoạch bảo quản kho Đặc biệt điều kiện thời tiết nóng ẩm mưa nhiều bệnh trở nên trầm trọng Vi khuẩn Ecc sử dụng Quorum Sensing (QS) chế trao đổi thông tin tế bào phụ thuộc mật độ quần thể để kiểm soát gen liên quan đến tính độc hoạt động tế bào vi khuẩn Trong chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò chất tự cảm ứng (autoinducer) phân tử tín hiệu tổng hợp tiết suốt trình phát triển vi khuẩn Khi nồng độ phân tử AHLs tăng lên với phát triển quần thể vi khuẩn đạt đến ngưỡng định (quorum level), AHLs gây hiệu ứng kiểu hình thơng qua việc điều hòa biểu gen đích, mà vi khuẩn gây bệnh Ecc gen quy định tính độc chủ Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, biện pháp không mang lại hiệu cao, đặc biệt việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản môi trường sống người Do biện pháp phòng trừ sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng tự nhiên ngày đặc biệt quan tâm Nhiều nghiên cứu tự nhiên tồn nhóm vi khuẩn cư trú bên mô chủ không gây triệu chứng bệnh cho gọi vi khuẩn nội sinh (bacterial endophyte) Trong số chúng, có vi khuẩn có khả phân hủy AHLs qua chế Quorum Quenching (QQ), hoạt động xảy tự nhiên có tác dụng chặn đứng bước quan trọng hệ thống QS hình thành, tích lũy tiếp nhận phân tử tín hiệu Dựa vào cấu trúc phân tử AHLs, nhà khoa học xác định nhóm enzyme phân hủy AHLs: AHL-lactonase, AHL-acylase AHL- oxidoreductase Cho đến nay, enzyme AHL-lactonase nghiên cứu nhiều Enzyme phát lần từ chủng vi khuẩn Bacillus sp 240B có khả bất hoạt phân tử AHL Gen mã hóa enzyme chuyển vào chủng vi khuẩn gây bệnh E carotovora SCG1 làm giảm đáng kể giải phóng AHL, giảm hoạt động enzyme pectolytic ngoại bào giảm độc tính khoai tây, cà, cải bắp, cà rốt,… Kể từ giới, nhiều vi khuẩn có hoạt tính AHL-lactonase miêu tả Bacillus thuringiensis subsp morisoni, Arthrobacter sp., Microbacterium testaceum Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu chế gây bệnh vi khuẩn thối nhũn sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh (VKNS) đối kháng để phân hủy AHLs vi khuẩn gây bệnh phòng trừ bệnh thối nhũn Do vậy, tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Phân lập xác định đặc tính enzyme N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) lactonase vi khuẩn nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây” với hy vọng hướng nghiên cứu góp phần đặt viên gạch để thiết lập biện pháp phòng trừ hiệu bệnh thối nhũn khoai tây vi khuẩn Ecc gây Việt Nam Mục đích đề tài Xác định hoạt tính enzyme phân hủy N-acyl-Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase chủng vi khuẩn nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây Yêu cầu đề tài - Phân lập xác định khả phân hủy AHLs vi khuẩn nội sinh từ cà dại - Thử nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy VKNS đến hoạt tính enzyme AHL lactonase - Thử nghiệm loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme AHL lactonase - Xác định hoạt tính enzyme AHL lactonase chủng VKNS phân hủy loại AHLs tổng hợp C6, C8 C10 - Thử nghiệm hiệu phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase điều kiện phòng thí nghiệm Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học - Thực đề tài giúp tơi có thêm kinh nghiệm, kiến thức kỹ thuật phân lập, xác định khả phân hủy, xác định hoạt tính enzyme phân hủy AHLs từ vi khuẩn nội sinh, đối tượng quan tâm, ngồi cung cấp thêm hiểu biết kỹ thuật khác mà công nghệ sinh học đại áp dụng - Kết nghiên cứu để tài cung cấp vật liệu khởi đầu cho việc nghiên cứu enzyme phân hủy AHLs tiền đề phát triển chiến lược phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây an tồn bền vững sau Ý nghĩa thực tiễn Ngoài ý nghĩa khoa học, vấn đề nghiên cứu đề tài có ý nghĩa thực tiễn Các chủng vi khuẩn có ích mang enzyme phân hủy AHLs sử dụng để ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh thối nhũn nhiều loài trồng có giá trị chuyển gen mã hóa enzyme vào trồng giúp trồng chống chịu với bệnh hại Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc địa lý phân bố khoai tây Khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Cà (Solanaceae) Đây lồi nơng nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Cây khoai tây có nguồn gốc vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 Anh Quốc vào năm 1590 Sau đó, lan truyền khắp châu Âu châu Á (Hawkes, 1994) Sau nhiều kỷ chọn lọc nhân giống, có nghìn lồi khoai tây khác Hơn 99% loài khoai tây trồng toàn cầu có nguồn gốc từ nhiều giống khác vùng đất thấp Trung-Nam Chile, giống di dời từ cao nguyên Andes Trên giới, khoai tây coi lương thực có tầm quan trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước ngô (Steveson cs., 2001) Năm 1890, người Pháp Giám đốc Vườn bách thảo Hà Nội đem hạt khoai tây trồng thử nước ta Điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa đơng có nhiệt độ trung bình 15 – 250C, thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng phát triển Vào năm 1980, Việt Nam trở thành nước sản xuất khoai tây lớn Đông Nam Á với 100.000 diện tích trồng (Batt., 2002) Khoai tây trở thành lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa ngô Việt Nam Tuy nhiên, theo thống kê Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), năm gần diện tích trồng khoai tây dao động khoảng 35.000 - 40.000 (Bảng 1.1) Trong 90% diện tích tập trung tỉnh thuộc đồng Bắc Bộ, số miền núi phía Bắc Trung Bộ, 0,5% diện tích lại trồng Đà Lạt (Lâm Đồng) (Phạm Xuân Tùng, 2001) Bảng 1.1: Tình hình sản xuất khoai tây Việt Nam giai đoạn 2005-2011 Năm Diện tích (ha) Sản lượng (tấn) 35.000 Năng suất (Tấn/ha) 10,6 2005 2006 37.613 11,1 419.161 2007 38.450 11,4 436.710 2008 41.160 11,8 486.184 2009 37.544 11,7 442.791 2010 37.100 12,0 446.200 2011 40.046 11,2 448.710 370.000 (Nguồn: FAO, 2012) Năng suất khoai tây trước thường đạt tấn/ha, cao 18-20 tấn/ha Từ năm 1981 đến nay, suất bình quân đạt gần 12 tấn/ha, cao đạt 35-40 tấn/ha, có thời điểm khoai tây xuất sang Nga (có năm tới 1.000 tấn) Khi lương thực lúa gạo ngơ dồi khoai tây nghiên cứu theo hướng chất lượng hiệu 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học Khoai tây Khoai tây thân thảo, tán gọn, ưa lạnh, phát triển khoảng 60 cm chiều cao, khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn 80-100 ngày, chết sau hoa Hoa có màu trắng, hồng, đỏ, xanh, màu tím, nhụy hoa màu vàng Khoai tây thụ phấn chủ yếu trùng, ong vò vẽ mang phấn hoa từ đến khác Sau khoai tây hoa, số giống cho màu xanh giống màu xanh trái cà chua anh đào, chứa 300 hạt (Wikipedia) 1.1.3 Vai trò Khoai tây Khoai tây nguồn cung cấp lương thực dồi Theo báo cáo Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) sản lượng khoai tây toàn Thế giới đến năm 2010 320 triệu tấn, 2/3 thức ăn trực tiếp người, lại thức ăn cho động vật nguyên liệu sản xuất tinh bột Ở Việt Nam, khoai tây nhập vào từ năm 1890 Do có giá trị kinh tế cao, thuộc nhóm ưa lạnh nên có lợi sản xuất vụ đơng, thời gian sinh trưởng ngắn, dễ trồng, tốn cơng chăm sóc, phù hợp với nhiều loại đất trồng nên khoai tây trở thành trồng xóa đói giảm nghèo cho bà nông dân nhiều địa phương thuộc tỉnh miền Bắc Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái,… (Nguồn báo điện tử: Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái) Tuy nhiên, ngành Nông nghiệp Việt Nam cung cấp 80% nhu cầu tiêu dùng khoai tây nước, phải nhập gần 100.000 khoai tây hàng năm Khoai tây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có 2% protein bao gồm lysine (một axit amin thường khơng có protein thực vật) nên phối hợp tốt với ngũ cốc Trong protein khoai tây có số axit amin tự chất kiềm purin Giá trị sinh học khoai tây tương đối cao lên tới 75% (theo phương pháp Mittchell) Người ta tính khoảng 200g khoai tây nướng vỏ cung cấp 844mg Kali (gấp đôi chuối), 28% phần sắt hàng ngày, 43% phần vitamin C, 35% phần vitamin B6 nhiều chất khác niacin, thiamin, folat… Việc sử dụng khoai tây làm thực phẩm khuyến khích số nhà khoa học Viện Thực phẩm Anh phát hiện, khoai tây có hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp ăn thường xuyên chữa bệnh “ngủ” Châu Phi Không sử dụng để làm lương thực thực phẩm khoai tây sử dụng y dược Qua nghiên cứu, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, phát thấy khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả ngăn ngừa q trình lão hóa, hạn chế phát triển ung thư số bệnh khác Còn nhà nghiên cứu Đại học Y Harvard, Mỹ, phát người thường xuyên ăn khoai tây có khả giảm ung thư tuyến tiền liệt 1.2 Bệnh thối nhũn khoai tây 1.2.1 Tác nhân gây bệnh tác hại bệnh Trong điều kiện thời tiết khí hậu nước ta năm gần nắng nóng, mưa nhiều đan xen nhiều bão liên tục điều kiện thuận lợi cho loài vi khuẩn gây bệnh trồng Bệnh vi khuẩn gây nguy hiểm gây nhiều khó khăn cho cơng tác phòng trừ bảo quản Thời gian ủ bệnh khó phát gây thiệt hại lớn thời kỳ sinh trưởng thời gian bảo quản, lưu trữ nông phẩm Đối với khu vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới bệnh thối nhũn khoai tây, cà rốt, hành tây, bắp cải….chủ yếu vi khuẩn Erwinia gây nên Những nghiên cứu trước kết luận vi khuẩn gây thối nhũn khoai tây có ba lồi: Erwinia carotovora pv carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv atroseptica (Eca) E chrysanthemi (Ech) Trong Ecc lồi chủ yếu gây bệnh thối nhũn củ khoai tây (Jerenial), (Randall cs) Vi khuẩn phổ biến bề mặt, vết thương củ khoai tây sau thu hoạch Ecc gây bệnh vùng khí hậu ơn đới nhiệt đới, có phổ ký chủ rộng Ecc cư trú đất, nước sơng, hồ chí đại dương Vi khuẩn nhân lên tồn vùng rễ nhiều chủ khơng phải chủ nhiều lồi cỏ dại Hai loài Eca Ech tác nhân gây bệnh thối đen 10 ... ti n hành ch n nghi n cứu đề tài Ph n l p xác định đặc tính enzyme N- acyl- L- homoserine lactone (AHL) lactonase vi khu n nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nh n củ khoai tây với hy vọng hướng... VÀ ĐÀO TẠO VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUY N SINH VẬT *** PH N L P VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM N- ACYL- L- HOMOSERINE LACTONE (AHL) LACTONASE CỦA VI KHU N NỘI... N- acyl- Lhomoserine lactones (AHLs), AHL lactonase chủng vi khu n nội sinh sử dụng phòng trừ bệnh thối nh n củ khoai tây Yêu cầu đề tài - Ph n l p xác định khả ph n hủy AHLs vi khu n nội sinh từ cà dại - Thử nghiệm