Bằng phương pháp chiết siêu âm với cồn acid, chúng tôi đã chiết được alkaloid toàn phần từ lá trinh nữ hoàng cung (TNHC), từ đó định lượng được crinamidin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác và lặp lại, hiện nay HPLC đang được ứng dụng rất phổ biến trong nhiuều lĩnh vực, đặc biệt là trong kiểm nghiệm phân tích thành phần hoạt chất trong dược liệu. ĐẶT VẤN ĐỀ Trinh nữ hoàng cung từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng trong việc điều trị u xơ tử cung và phì đại tuyến tiền liệt. Trong nước và trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh công dụng này của cây TNHC. Hơn nữa, tại hội nghị phát triển dược liệu tại Bình Dương vào tháng 05 năm 2010, TNHC đã được công nhận là một trong ba sản phẩm quốc gia từ dược liệu. Chính vì vậy việc kiểm tra và theo dõi sự thay đổi hàm lượng hoạt chất trong lá TNHC theo thời gian và thổ nhưỡng là hết sức cần thiết. Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài với mong muốn ứng dụng kỹ thuật phân tích hiện đại vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc, góp phần nâng cao chất lượng thành phẩm đến tay người bệnh. THỰC NGHIỆM A. Chuẩn bị mẫu 1. Mẫu thử Lá TNHC thu hái tại các tỉnh Bình Định, Tây Ninh, Đồng Nai và Tp.Hồ Chí Minh. 2. Quy trình chiết alkolid toàn phần từ lá trinh nữ hoàng cung Lá TNHC thu hái, rửa sạch, xắt nhỏ, phơi khô trong bóng râm, xay nhuyễn. Cân chính xác khoảng 10g bột lá cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml hỗn hợp EtOH 96% và HCl 1% tỉ lệ 50 : 50 rồi siêu âm trong 1 giờ, lọc qua giấy lọc, (thực hiện 3 lần như trên). Gộp các dịch lọc lại sau đó kiềm hóa bằng NH4OH ññ ñeán pH » 9 10. Dịch lọc đã kiềm hóa cho vào bình lắng gạn 250 ml, chiết bằng CH2Cl2 đến khi thu được toàn bộ alkaloid dạng base.
Trang 1KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CRINAMIDIN
TRONG LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG
(Crinum latifolium L Amaryllidaceae)
THEO THỜI GIAN VÀ THEO THỔ NHƯỠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Phan Thanh Dũng, Trần Thị Quỳnh Trâm
TÓM TẮT
Bằng phương pháp chiết siêu âm với cồn acid, chúng tôi đã chiết được alkaloid toàn phần
từ lá trinh nữ hoàng cung (TNHC), từ đó định lượng được crinamidin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp này có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác và lặp lại, hiện nay HPLC đang được ứng dụng rất phổ biến trong nhiuều lĩnh vực, đặc biệt là trong kiểm nghiệm phân tích thành phần hoạt chất trong dược liệu
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trinh nữ hoàng cung từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng trong việc điều trị u xơ tử cung
và phì đại tuyến tiền liệt Trong nước và trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh công dụng này của cây TNHC Hơn nữa, tại hội nghị phát triển dược liệu tại Bình Dương vào tháng 05 năm 2010, TNHC đã được công nhận là một trong
ba sản phẩm quốc gia từ dược liệu Chính vì vậy việc kiểm tra và theo dõi sự thay đổi hàm lượng hoạt chất trong lá TNHC theo thời gian và thổ nhưỡng là hết sức cần thiết Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài với mong muốn ứng dụng kỹ thuật phân tích hiện đại vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc, góp phần nâng cao chất lượng thành phẩm đến tay người bệnh
THỰC NGHIỆM
A Chuẩn bị mẫu
1 Mẫu thử
- Lá TNHC thu hái tại các tỉnh Bình Định, Tây Ninh, Đồng Nai và Tp.Hồ Chí Minh
2 Quy trình chiết alkolid toàn phần từ lá trinh nữ hoàng cung
Lá TNHC thu hái, rửa sạch, xắt nhỏ, phơi khô trong bóng râm, xay nhuyễn Cân chính xác khoảng 10g bột lá cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml hỗn hợp EtOH 96% và HCl 1%
tỉ lệ 50 : 50 rồi siêu âm trong 1 giờ, lọc qua giấy lọc, (thực hiện 3 lần như trên) Gộp các
Trang 2dịch lọc lại sau đĩ kiềm hĩa bằng NH4OH đđ đến pH » 9 - 10 Dịch lọc đã kiềm hĩa cho
100 ml EtOH 96% : HCl 1% (50:50) Siêu âm 1 giờ Lọc
NH4OH đđ pH » 9 -10 CH2Cl2
Lắc kỹ, để tách lớp
Cơ dung mơi(tủ hot)
Sơ đồ 1 Quy trình chiết alkaloid tồn phần từ lá TNHC.
3 Xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)
- Cắn alkaloid được chiết theo sơ đồ 1 được hịa tan trong 0,5-1ml MeOH, thêm 20 ml
vào bình định mức dung tích 50 ml và điền tới vạch
được dịch trong, màu vàng nhạt
4 Mẫu đối chiếu
- Cân chính xác khoảng 5mg crinamidin, cho vào bình định mức 5ml, hịa tan và điền tới
vạch bằng MeOH, sau đĩ pha lỗng 25 lần
Bột lá TNHC (10 gam)
Bã dược liệu Dịch chiết cồn acid
Dịch kiềm Dịch CH2Cl2
Cắn alkaloid tồn phần (» 45 mg)
Trang 35 Thăm dò điều kiện triển khai HPLC
- Thực hiện trên cột sắc ký cột Phenomenex C8 (250 mm x 4,6 mm; 5µm)
- Lưa chọn sắc ký đồ ở nhiều bước sóng 214 nm, 224 nm, 254 nm, 285 nm, nhưng chỉ có sắc ký đồ ở bước sóng 214 nm cho các đỉnh tách rõ nhất và diện tích cao nhất
- Thăm dò pha động: Tiến hành thăm dò trên nhiều hệ pha động MeOH - đệm phosphat
Đệm phosphat
Acid formic
-(+): Đỉnh tách, chân đỉnh không đẹp; (++): Đỉnh tách rõ, đẹp
(-): Đỉnh tách không rõ; (- -): Đỉnh không tách
Sau khi tiến hành thăm dò, điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:
- Hệ thống HPLC hiệu Waters 2695 (Mỹ), đầu dò Waters 2996 Photodiode Array Detector, hệ thống bơm mẫu tự động, phần mềm xử lý Empower
- Cột sắc ký: Phenomenex C8 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)
- Bước sóng phát hiện: UV - 214 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút
- Thể tích bơm: 10 µl
Trang 4Sau khi xác định được điều kiện triển khai HPLC, tiến hành định tính và định lượng crinamidin trong lá trinh nữ hoàng cung
- Định tính: trên sắc ký đồ cho thấy trong dịch chiết từ lá TNHC có peak có thời gian lưu
trùng với thời gian lưu của chất đối chiếu crinamidin
Dịch chiết từ lá TNHC
Mẫu đối chiếu crinamidin
-Định lượng
:
Hàm lượng Crinamidine có trong 100 gam lá TNHC được tính theo công thức:
100 100
100 50
h m
a Cc Sc
St P
B Thẩm định quy trình định lượng
1 Tính đặc hiệu
Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, trên sắc ký đồ, diện tích đỉnh của đỉnh của Crinamidin trong mẫu thử tăng so với lúc chưa cho chất chuẩn
Quy trình đạt yêu cầu về tính đặc hiệu
chất đối chiếu
Trang 52 Tính tuyến tính
y = 70177x - 16376 R² = 0,9998
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Nồng độ (µg/ ml)
Hình 1 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của crinamidin.
Kết quả cho thấy có sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh của crinamidin với
khoảng tuyến tính 0,212 – 42,4 µg/ml theo phương trình hồi quy tuyến tính ŷ = 70177x
3
Độ đúng
Bảng 3 Kết quả khảo sát độ đúng.
Tỷ lệ phục hồi trung bình nằm trong giới hạn cho phép, quy trình đạt yêu cầu về độ đúng
4 Độ lặp lại
Bảng 3 Kết quả khảo sát độ lặp lại.
RSD nằm trong giới hạn cho phép, quy trình đạt yêu cầu vầ độ lặp lại
C Định lượng crinamidin trong lá TNHC theo thời gian và theo thổ nhưỡng
Mức thêm
vào
Hàm lượng chuẩn thêm
SD = 0,32 RSD% = 3,59 Giới hạn tin cậy = 0,34 Khoảng tin cậy = 9,05 ± 0,34
Trang 6Bảng 4 Kết quả định lượng Crinamidine theo tháng và nơi trồng.
Nơi thu hái
Tháng thu hái
Độ ẩm
Hàm lượng Crinamidine (mg/100g lá)
Trung bình (mg/100g lá)
Bình Định
Tây Ninh
Đồng Nai
Tp.HCM
Nhận xét: qua thực nghiệm cho thấy có sự tác động của khí hậu và thổ nhưỡng đến việc
trồng cây TNHC Hàm lượng crinamidin thu hái tại các tỉnh đều tăng cao vào tháng 05, và
lá TNHC thu hái tại Tp.HCM có hàm lượng crinamidin cao nhất
KẾT LUẬN
Khảo sát sự thay đổi hàm lượng crinamidin trong lá TNHC theo thời gian và theo thổ nhưỡng bằng phương pháp HPLC giúp cho quá trình kiểm soát nguyên liệu đầu vào được
Trang 7chặt chẽ hơn, từ đó sản xuất được thành phẩm thuốc chứa TNHC đạt tiêu chuẩn chất lượng và nâng cao hiệu quả trong điều trị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Tuấn Anh, Phạm Thị Giảng, Trịnh Văn Quỳ (2006), “Tạp chí kiểm
nghiệm thuốc”, số 4, Tập 4(14), tr 10-14.
2 Đặng Văn Hòa, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Đức Tuấn, Vĩnh Định, Nguyễn Thị
Hồng Hương (2009), Giáo trình lý thuyết kiểm nghiệm thuốc, Bộ môn Hóa phân
tích - Kiểm nghiệm, Trường Đại Học Y Dược Tp.HCM, tr 96-125
3 Võ Thị Bạch Huệ, Lê Thị Tuyết Vân, Đặng Văn Hòa (1998), “ Xác định alkaloid
toàn phần chiết xuất từ lá của một số loài thuộc chi Crinum Họ Thủy Tiên
(Amaryllidaceae)”, Tạp chí Dược học, số 10, tr 18-19.
4 Đỗ Tất Lợi (2000), Những cấy thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr.
511-512
5 C.W Fennell, J Van Staden (2001), “Crinum species in traditional and modern medicine”, Journal of Ethnopharmacology 78, pp 15-26.
6 Nguyen Thi Ngoc Tram, Tz V Titorenkova, V St Bankova, N.V Handjieva, S.S
Popov (2002), “Crinum L Amaryllidaceae”, Fitoterapia 73, pp 183-208.
7 The United States Pharmacopeia 32 (2009), pp 236
