MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 CÂY BA KÍCH 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố đặc tính sinh thái 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Tác dụng Y học cổ truyền 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1.2.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 1.2.2 Giới thiệu vùng rDNA vùng ITS 1.2.3 Giới thiệu sơ lược Kỹ thuật giải trình tự GEN (DNA sequencing) 1.2.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích 11 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 13 2.1.2 Dung môi, hóa chất 14 2.1.3 Thiết bị dùng nghiên cứu 14 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Phân tích hình thái 15 2.2.2 Phân tích hóa học 16 2.2.3 Đánh giá đa dạng di truyền dựa thị ITS 17 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 21 3.1.1 Đa dạng sinh học mẫu thuộc loài Morinda officinalis dựa vào đặc điểm hình thái 21 3.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu thuộc chi Polygala 36 3.1.3 So sánh đặc điểm hình thái mẫu thuộc loài Morinda officinalis How mẫu Polygala sp 37 3.2 SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA CÁC MẪU BA KÍCH THUỘC LOÀI MORINDA OFFICINALIS HOW VÀ POLYGALA SP 38 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ADN 40 3.3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 40 3.3.2 Kết phân tích sản phẩm khuếch đại gel agarose 41 3.3.3 Kết giải trình tự vùng ITS-rDNA 41 3.3.4 Cây phân loại trình tự ITS-rADN 53 Chương 4: BÀN LUẬN 55 4.1 Về phân tích hình thái 55 4.2 Về phân tích đặc điểm hóa học 56 4.3 Về phân tích đa dạng di truyền thị ITS 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADN CTAB dATP dCTP dGTP dNTP dTTP EDTA EtBr ETS HNIP HPTLC IGS ITS LSU NCBI PCR RAPD rDNA Rf rRNA SSU TAE TLC TWINSPAN Tên đầy đủ Acid Deoxyribo Nucleic Cetyl trimethylammonium bromide 2’-deoxyadenosin triphosphat 2’-deoxycytidin-5’-triphosphat 2’-deoxyguanosin triphosphat deoxynucleotide Triphosphate 2’-deoxythymin triphosphat Ethylendiamin Tetraacetic Acid Ethidium bromide External Transcribed Spacer High performance thin layer chromatography Intergenic spacer Internal Transcribed Spacer Large subunit National Center for Biotechnology Information Polymerase Chain Reaction Random Amplification of Polymorphic DNA Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid Retention factor Ribosomal Ribonucleic Acid Small subunit Tris base-acetate-EDTA Thin-layer chromatography Two way indicator species analysis Diễn giải Acid Deoxyribo Nucleic Cetyl trimethylammonium bromide 2’-deoxyadenosin triphosphat 2’-deoxycytidin-5’-triphosphat 2’-deoxyguanosin triphosphat deoxynucleotide Triphosphate 2’-deoxythymin triphosphat Ethylendiamin Tetraacetic Acid Ethidium bromide Vùng phiên mã bên Phòng tiêu Trường Đại học Dược Hà Nội Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Vùng biến động bên Vùng phiên mã bên Tiểu đơn vị lớn Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học Phản ứng chuỗi trùng hợp DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid Hệ số lưu giữ Ribosomal Ribonucleic Acid Tiểu đơn vị nhỏ Tris base-acetate-EDTA Sắc ký lớp mỏng Phép phân loại đa biến bảng chiều loài thị DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 2.1 Các thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.2 Chu trình khuếch đại ADN 18 Bảng 3.1 Các đặc điểm khác 11 mẫu Morinda officinalis 29 Bảng 3.2 Các đặc điểm hình thái phân biệt mẫu Morinda officinalis How mẫu Polygala sp 37 Bảng 3.3 Diện tích peak Nystose 13 mẫu Ba kích 40 Bảng 3.4 Kết giải trình tự ITS 11 mẫu nghiên cứu .42 Bảng 3.5 Thành phần bốn loại nucleotide mẫu giống nghiên cứu .45 Bảng 3.6: Bảng so sánh gióng hàng ADN 11 mẫu Ba kích thực phần mềm Megav6.0 46 Bảng 3.7 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN 11 mẫu .53 Bảng 4.1: Trình tự Gen vùng ITS mẫu Morinda Officinalis công bố NCBI 57 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Một số anthraquinon rễ Ba kích Hình 1.2: Một số iridoid có Ba kích Hình 1.3: Một số oligosaccharid tác dụng rễ Ba kích Hình 1.4 Một số hợp chất thuộc coumarin sterol phân lập từ rễ Ba kích Hình 1.5: Sơ đồ vùng rDNA- ITS Hình 3.1 Dạng sống loài Morinda officinalis How .22 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái rễ loài Ba kích Morinda officinalis How .23 Hình 3.3 Đặc điểm hình thái thân non loài Morinda officinalis How 23 Hình 3.4 Đặc điểm hình thái kèm loài Morinda officinalis How 24 Hình 3.5 Đặc điểm bề mặt loài Morinda officinalis How 24 Hình 3.6 Cụm hoa loài Morinda officinalis How 25 Hình 3.7 Các dạng hoa loài Morinda officinalis How 25 Hình 3.8 Đài hoa loài Morinda officinalis How 25 Hình 3.9 Tràng hoa loài Morinda officinalis How .26 Hình 3.10 Các dạng nhụy loài Morinda officinalis How 26 Hình 3.11 Các dạng cụm loài Morinda officinalis How .27 Hình 3.12 Quả hạt loài Morinda officinalis How 27 Hình 3.13 Phân loại mẫu Morinda officinalis phép phân loại đa biến TWINSPAN 35 Hình 3.14 Đặc điểm hình thái loài Polygala sp .36 Hình 3.15 Sắc ký đồ dịch chiết methanol 13 mẫu Ba kích khai triển với hệ Ethyl Acetat: Nước: Acid Acetic: Acid Formic (6,5:2,5:2:2) bước sóng 366nm ánh sáng thường sau phun thuốc thử 39 Hình 3.16 Ảnh điện di ADN tổng số 11 mẫu Ba Kích .40 Hình 3.17 Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 11 mẫu Ba Kích với thang chuẩn Marker: 100bp .41 Hình 4.1 Thực trạng bán giả Ba kích Sa Pa (Lào Cai) Quản Bạ (Hà Giang) 55 Hình 4.2 Cây phân loại 11 mẫu với mẫu công bố NCBI dựa so sánh trình tự ITS-Radn 59 ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích (Morinda officinalis How.) vị thuốc sử dụng rộng rãi Y học cổ truyền Y học đại với tác dụng bổ thận dương, mạnh gân xương Trước đây, Ba kích khai thác chủ yếu từ tự nhiên phục vụ nhu cầu nước mà phục vụ xuất Hiện nay, khai thác mức, dẫn đến nguồn Ba kích tự nhiên bị cạn kiệt Nhiều địa phương Bắc Giang, Quảng Ninh, Lạng Sơn triển khai trồng Ba kích mang lại hiệu kinh tế định Tuy nhiên nguồn giống Ba kích thu hái tự nhiên từ nhiều nơi khác điều ảnh hưởng lớn đến chất lượng dược liệu suất trồng Hơn dược liệu Ba kích làm giả mạo số thuộc chi Polygala; đặc biệt tỉnh Lào Cai (khu du lịch Sa Pa) [10] Trước có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học Ba kích chưa đủ để phục vụ công tiêu chuẩn hóa giống dược liệu Ba kích mà cần có thêm nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích thông qua đặc điểm hình thái, đặc biệt thông qua phân tích sinh học phân tử - phương pháp đại sử dụng nhiều giới cập nhật tiêu chuẩn dược liệu Vì lý đó, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích (Morinda officinalis How.) miền Bắc Việt Nam” thực với mục tiêu sau: Phân tích đặc điểm hình thái định tính hóa học số mẫu Ba kích thuộc loài Morinda officinalis How số mẫu làm giả Ba kích thuộc chi Polygala khu vực miền Bắc Việt Nam Xác định tính đa dạng di truyền số mẫu Ba kích thuộc loài Morinda officinalis How khu vực miền Bắc Việt Nam Chương TỔNG QUAN 1.1 CÂY BA KÍCH 1.1.1 Đặc điểm thực vật Tên khoa học:Morinda officinalis How Tên thường gọi: Ba kích Tên gọi khác: Ba kích thiên, Dây gà, Chấu phóng xì (Hải Ninh), Thau tày cáy (Tày), Chồi hoàng kim, Sáy cày (Thái), Chày kiang dòi (Dao), Liên châu ba kích, Medicinal indian Mulberry (Anh) [8], [11] Cây thảo, sống lâu năm, leo thân cuốn, dài hàng mét Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, vỏ màu hồng nhạt, thịt màu hồng hay tím, mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, có lõi [4] Thân hình tròn trơn, màu nâu xám, có nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với Thân non màu tím có lông, sau nhẵn, lóng dài 5-10cm [1],[2],[4],[9] Lá mọc đối Cuống dài 5-7mm Phiến hình mác bầu dục, thuôn nhọn, dày cứng, dài 6-14cm, rộng 2,5-6cm, lúc non có lông dày mặt dưới, thường tập trung gân mép lá, màu xanh lục, sau già lông màu trắng, gân phụ 8-9 cặp Lá kèm mỏng, ôm sát vào thân [1],[2],[3],[4] Cụm hoa mọc thành tán đầu cành, dài 0,31,5cm Hoa nhỏ màu trắng, sau vàng Đài hình chén hay hình ống gồm đài nhỏ phát triển không Tràng hàn liền phía thành ống ngắn Nhị 4, bầu Quả hình cầu, rời dính liền thành khối, chín màu đỏ, mang đài tồn đỉnh, có long [4],[9],[11] Mùa hoa: Tháng 56 Mùa quả: Tháng 7- 10 [3],[4],[5] 1.1.2 Phân bố đặc tính sinh thái Ba kích mọc hoang ven rừng thứ sinh, trung du miền núi Cây trồng nhiều nơi, trồng đoạn rễ đất nhiều màu, ẩm, mát, che bóng có giá tựa cho leo [4] Ba kích gặp nhiều Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Phú Thọ, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Bắc Ninh Còn có Trung Quốc [4] 1.1.3 Bộ phận dùng Rễ (Radix Morindae officinalis), đào rễ quanh năm, tốt vào mùa thu đông, rửa cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy cho gần khô, đập dẹt phơi sấy tiếp khô hẳn [4] 1.1.4 Thành phần hóa học Các nghiên cứu chứng minh rễ Ba kích có nhiều hợp chất thuộc nhóm anthraquinon, iridoid (nhóm diterpenoid), terpenoid, phytosterol, sacchrid (nhất nhóm oligosaccharid) acid hữu cơ, coumarin… * Nhóm chất anthraquinon Tên chất Physcion Rubiandin 1,8-dihydroxyanthraquinon 2-methylanthraquinon R1 R2 R3 -OH -H -OH -CH3 -OH -H -H -OH -H -H -H -OH -H -CH3 -H -H -H OCH3 R6 R8 -CH3 -H Hình 1.1: Một số anthraquinon rễ Ba kích Một số anthraquinon phân lập từ Ba kích như: Rubiadin, rubiadin1-methyl ether, 1-hydroxy anthraquinon, 1-hydroxy-2-methyl anthraquinon, 1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxy anthraquinone [15], 1,6-dihydroxy-2-methoxy anthraquinon, 1-hydroxy-2-methoxy anthraquinon, physcion, 2-methylanthraquinon, 1-hydroxy-2-hydroxymethyl anthraquinon, 1,3-dihydroxy-2- methoxy-anthraquinon, 1,4-dimethoxy-2-hydroxy anthraquinone [24], 1,4dihydroxy-2-methyl-anthraquinon, 1-methoxy-2-hydroxy anthraquinone [30], alizarin-1-methylether, lucidin-ω-methylether, 1-hydroxy-2,3-dimethyl- anthraquinon, 1-hydroxy-3-hydroxymethyl anthraquinon, 3-hydroxy-1,2dimethoxy-anthraquinon, 2-hydroxy-1-methoxy anthraquinon, 1,2-dihydroxy3-methyl-anthraquinon, 1,3,8-trihydroxy-2-methoxy-anthraquinon, 2- hydroxymethyl-3-hydroxy anthraquinon, 2-methoxy-anthraquinon, alizarin-2methylether, 1,2-dimethoxy anthraquinon… (Hình 1.1), [21],[25],[34],[46] * Nhóm chất iridoid glycosid (diterpenoid) - Nhóm gắn đường glucose: Asperulosid, monotropein [27], asperulosid tetra-acetat, morofficinalosid, acid asperulosidic [39], acid desacetylasperulosidic… [16] - Nhóm gắn đường lacton: Morindoli, monotropein, morofficinalosid… (Hình 1.2) [10],[28],[42],[43] H3CO O HO O HO 2) O Glc Morindoli Monotropein Morofficinalosid Hình 1.2: Một số iridoid có Ba kích * Nhóm chất terpenoid: Một số terpenoid phân lập từ rễ Ba kích như: L-borneol-6-O-ß-Dapiosyl-ß-D-glucosid, acid rotungenic… [37], [38], [41], [42] * Nhóm chất sacchrid Hiện có nhiều công bố nhóm chất saccharid nhóm hoạt chất có tác dụng tác dụng cường dương Ba kích, số saccharid phân lập từ Ba kích như: Nystose, fructofuranosyl-nystose, inulin-type hexasaccharid and heptasaccharid, sucrose, inulin-type trisaccharide, inulotriose, inulotetrose, inulopentose, 1-kestose (nhóm oligosaccharid), Arabinose, galactose, galacturonic acid [30.], acidic polysaccharides (nhóm monosaccharid)… (Hình 1.3) Hiện nystose dùng để đánh giá chất lượng chuyên luận Ba kích số quốc gia vùng lãnh thổ Trung Quốc, Hồng Kông,… [18],[20],[21],[34] Bajijiasu Nystose Hình 1.3: Một số oligosaccharid tác dụng rễ Ba kích 5) Nhóm coumarin: Scopoletin [35], [43] 6) Nhóm sterol: Một số phytosterol phân lập từ rễ Ba kích sigmasterol, daucosterol [30],[34], β-sitosterol … [21] 7) Các acid hữu : Acid fumaric, acid succinic…[21], [24] Scopoletin Sigmasterol ... Nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích Các nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích trước tiến hành chủ yếu sử dụng mồi RAPD Đặc điểm hình thái di truyền Ba kích nhà khoa học 11 Trung Quốc nghiên cứu. .. giả Ba kích thuộc chi Polygala khu vực miền Bắc Việt Nam Xác định tính đa dạng di truyền số mẫu Ba kích thuộc loài Morinda officinalis How khu vực miền Bắc Việt Nam Chương TỔNG QUAN 1.1 CÂY BA KÍCH... nhiều nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học Ba kích chưa đủ để phục vụ công tiêu chuẩn hóa giống dược liệu Ba kích mà cần có thêm nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen Ba