Nguyễn Phú Hùng Nature and Society Faculty of Thai Nguyen University 1. M c l ch ố ị sử Ngày 14-9-1990, vi n s c kh e qu c gia M ệ ứ ỏ ố ỹ (U.S.National Instituse of Helth) th nghi m li u pháp ử ệ ệ gen đ u tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tu i v i c n b nh ầ ổ ớ ă ệ di truy n hi m nghèo có tên là severe combined ề ể immune deficiency SCDI (thi u h t h th ng mi n d ch ế ụ ệ ố ễ ị nghiêm tr ng).ọ . Tách tế bào bạch cầu ra khỏi cơ thể G ắn gen thi ếu v ào t ế b ào Đ ưa trở lại máu T ăng hệ thống mi ễn dịch • Li u pháp gen là s thay th m t gen lành ệ ự ế ộ vào v trí c a gen b nh ho c b xung gen ị ủ ệ ặ ổ lành t ng ng vào c th b b nh.   ươ ứ ơ ể ị ệ 2. Khái ni m v li u pháp genệ ề ệ Cách 1: Thay th gene b nh b ng gen lànhế ệ ằ Ưu: Nhược: Có tính chất triệt để Khó thực hiện Cách 2: Thêm gene lành để bổ trợ cho gen hỏng: - Ưu: - Nhược: Dễ thực hiện Nguy hiểm: Không nằm trong phức hợp điều hòa – biểu hiện tùy tiện 1 Gây hiệu quả không mong muốn 2 hoạt hóa một gen tiền ung thư thành gen ung thư 3 Liệu pháp gen tế bào soma Liệu pháp gen Gồm hai nhóm Liệu pháp gen tế bào sinh dục 3. Phân lo i li u pháp genạ ệ 3. Phân lo i li u pháp genạ ệ 4. Có 3 m c khác nhau c a li u pháp ứ ủ ệ gen Gen chuyển hòa nhập DNA nhiễm sắc thể vật chủ 1 Gen chuyển không hòa nhập DNA nhiễm sắc thể vật chủ 2 Sử dụng các oligonucleotit tổng hợp nhân tao (ribozyme/antisense) 3 5. Các b c c b n trong li u ướ ơ ả ệ pháp gen Sử dụng các vector virus đã biến đổi để chuyển gen vào tế bào theo 4 bước: Bước 2 Bước 2 Bước 3 Bước 3 Bước 1 Bước 1 Bước 4 Bước 4 Nhân dòng gen trị liệu (gen đích) Theo dõi sự hoạt động của gen đích Tạo vector tái tổ hợp phù hợp Đưa vector tái tổ hợp, vào cơ thể 3 Lựa chọn phương thức ( có thể tiến hành invitro Sau đó cấy ghép vào cơ thể hoặc chuyển trực tiếp vector vào mô bệnh) 1 Có bản sao đầy đủ Có trình tự điều hòa(trình tự khời động) Trình tự khởi động có thể đặc hiệu mô 2 Lựa chọn kỹ thuật đích 6. Các yêu c u chung v m t k thu t ầ ề ặ ỹ ậ trong li u pháp genệ G n ắ tr c ự ti p ế DNA tr n ầ vào t ế bào c yấ G n ắ tr c ự ti p ế DNA tr n ầ vào t ế bào c yấ S ử d ng ụ vector virus đ đ a ể ư gen vào tbbào Chuyể n gen thông qua ph c ứ h hóa ệ h cọ 7. Vector virus trong chuy n genể 3 Các virus khác nhau có tính chất chuyển gen khác nhau: tế bào nhiễm, in vivo hay in vitro, thời gian biểu hiện gen, mức độ biểu hiện gen, vấn đề an toàn) 1 Virus cho phép chuyển gen đặc hiệu tế bào thông qua tương tác virus – thụ thể tế bào 2 Virus có thể cho phép mang được những đoạn gen có kích thước tương đối lớn từ 5 – 30 kb (tùy từng loại vector virus cụ thể) Hiện có một số dạng vector virus chính: Retrovirus, Adenovirus, Adeno – associate virus, lentivirus và Herpes simplex virus  Kích th c nhướ ỏ  Chuyên tr b m t th pở ề ặ ấ  Vòng đ i dàiờ Vector đi vào máu theo sự lưu thông dòng Vector Thành tế bào máu Tế bào bệnh Các đ c tính c a vector:ặ ủ [...]... thể nhiễm trực tiếp hoặc Exvivo Mức độ biểu hiện vừa phải, Có thể gây đột biến gen Có thể gây đột biến gen Liposomes vector Liposomes vector Liệu pháp gen điều trị HIV I Liệu pháp kìm hãm HIV nộii bào I Liệu pháp kìm hãm HIV nộ bào 1 2 3 Liệu pháp dựa trên cac axit nucleic của virus Liệu pháp dựa trên các protein nội bào Liệu pháp miễn dịch ... Non-human primates Tổ chức genome và vector Thiết kế vector AAV Thiết kế vector AAV p19 p40 AAV Genome ITR AAV Vector With Transgene ITR p5 rep cap Transgene CMV ITR ITR Poly(A) Thiết kế vector AAV Phiên mã và dịch mã Tập hợp các nhân tố phiên mã Protein gắn kết vơi DNA Đặc tính của vector Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kb Mang được các đoạn khoả thước khoảng 8 Mang đoạn gengen có kích ng 4,5... bào nuôi cấy 7.3 Vector Retrovirus Được sử dụng trong khoảng 60% dự án liệu pháp gen Thuộc họ retroviridae Genome của retrovirus Sự nhân lên của virus trong tế bào Thiết kế vector Rtrovirus Thiết kế vector Rtrovirus Đặc tính của vector Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng kb Mang được các đoạn khoả thước khoảng Mang đoạn gengen có kích ng 8 kb88 kb Ghép nốii (hợp nhất) vào nhiễm sắc thể Ghép nố... (fiber) Genome có bản chất là DNA sợi kép, mạch thẳng Có trình tự lặp lại đảo ngược (invert - ITR) Kích thước 33 – 45 kb Các gen trong genome của virus Các gen sớm(biểu hiện trước khi sao chép): E1a, E1b, E2a, E3 và E4: - E1a điều hòa phiên mã, E2 và E3 và E4 điều hòa dịch mã Các gen muộn: L1, L2, L3, L4, L5 chỉ biểu hiện sau khi khởi đầu sao chép DNA Các gen trung gian: B2b và IV92 Giản đồ sắp xếp các gen. .. plasmid mang gen đích vào tế bào nuôi cấy E1A E1B L1 Gen đích Chữa bệnh 36 Kbp L2 L4 L3 E3 L5 DNA Ad Genome E2B E2A E4 Vector adenovirus thế hệ đầu Khiếm khuyết khả năng tái bản E1A E1B L1 ITR ψ DNA chèn vào E2B L2 L4 L3 Gen chuyển E3 L5 ITR DNA chèn vào E2A Vector thế hệ gần đây E4 Một số đặc tính cơ bản của vector adenovirrus Mang được các đoạn gen có kích thước khoảng 8 kb Mang ạn các đoạn gen có kích... có kích kb Mang đođược gen khoảng 8thước khoảng 8 kb Có thể tiên hành in vitro hoặc tiêm trực tiếp Có thể tiên hành in vitro hoặc tiêm trực tiếp vào cơ thể vào cơ thể Có tính đặc hiệu mô, nhiễm vào các tế bào không phân chia Liều lượng 108 – 1010 cfu/mL Thời gian biểu hiện gen ngắn (vài tuần), Thời gian biểu hiện gen ngắn (vài tuần), mức độ biểu hiện gen cao mức độ biểu hiện gen cao 7.2 Vector AAV... hiện sau khi khởi đầu sao chép DNA Các gen trung gian: B2b và IV92 Giản đồ sắp xếp các gen trong genome của Adenovirus Nếu Loại bỏ E1 sẽ làm hỏng khả năng tái bản của virus bởi sản phâm gen E1 cần thiết cho sự điều hòa quá trình phiên mã (điều khiển các promoter của các gen muôn E2, E3 và E4 (MLP).Các gen E1, E2, và E4 được hoạt hóa bởi các nhân tố phiên mã nội sinh tế bào chủ Vector thế hệ 3 ngoài... ngắn (vài tuần), Thời gian biểu hiện gen ngắn (vài tuần), mức độ biểu hiện gen cao mức độ biểu hiện gen cao 7.2 Vector AAV (adeno – associated Virus) -Thuộc họ parvoviridae -có 5 họ phụ - Kích thước genome nhỏ - Không có khả năng tự nhân lên Có khoảng 11 type huyết thanh khác nhau 􀂃 Adeno-associated virus 1 Non-human primates 􀂃 Adeno-associated virus 2 Humans 􀂃 Adeno-associated virus 3 Humans 􀂃 Adeno-associated . một gen tiền ung thư thành gen ung thư 3 Liệu pháp gen tế bào soma Liệu pháp gen Gồm hai nhóm Liệu pháp gen tế bào sinh dục 3. Phân lo i li u pháp gen . gen ệ 3. Phân lo i li u pháp gen ệ 4. Có 3 m c khác nhau c a li u pháp ứ ủ ệ gen Gen chuyển hòa nhập DNA nhiễm sắc thể vật chủ 1 Gen chuyển không hòa nhập