BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH HẠNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG HOẠT HÓA eNOS TRONG TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU CỦA SAPONIN CÓ TRONG NẦN NGHỆ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace) THU HÁI TẠI SƠN LA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH HẠNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG HOẠT HÓA eNOS TRONG TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU CỦA SAPONIN CÓ TRONG NẦN NGHỆ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace) THU HÁI TẠI SƠN LA CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hoàng Tuấn TS Đỗ Thị Nguyệt Quế HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, chuyên gia lĩnh vực đồng nghiệp gia đình Trước hết xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau Đại học, thầy cô giáo, kỹ thuật viên môn Dược liệu, Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập nghiên cứu Tiếp theo, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Cao đẳng Y tế Quảng trị, Sở Y tế Quảng Trị, giảng viên Khoa Dược – Trường Cao đẳng Y tế Quảng Trị tạo điều kiện cho yên tâm học tập hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Dược liệu, TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn, quan tâm bảo tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin cám ơn TS Đỗ Thị Hà, Trưởng khoa Hóa Thực vật- Viện Dược liệu, ThS Nguyễn Thị Duyên anh chị kỹ thuật viên Khoa Hóa thực vật- Viện Dược liệu tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho nghiên cứu hoàn thành luận văn Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, muốn gửi tới gia đình, người thân bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 04 tháng năm 2017 Nguyễn Thị Minh Hạnh MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nần nghệ 1.1.1 Vị trí phân loại .3 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng phân bố 1.1.4 Sinh thái thu hái 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Tác dụng sinh học 1.2 Cấu trúc mạch máu vai trò hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu bệnh tim mạch 13 1.2.1 Cấu trúc mạch máu 13 1.2.2 Vai trò hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu bệnh tim mạch 14 2.1 Đối tượng phương tiện nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tượng 17 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, máy móc .18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Chiết xuất phân lập, xác định cấu trúc saponin thân rễ nần nghệ thu (D collettii) hái Sơn La .20 2.2.2 Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu ECV 304 saponin phân lập từ nần nghệ (D collettii) 23 2.3 Phương pháp xử lý số liệu .28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .29 3.1 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin có nần nghệ (D collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái Sơn La 29 3.1.1 Chiết xuất 29 3.1.2 Phân lập 31 3.1.3 Xác định cấu trúc 35 3.2 Thử tác dụng hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu saponin có thân rễ nần nghệ (D collettii) 48 3.2.1 Thăm dò khả gây độc tế bào ECV 304 saponin NN02 .48 3.2.2 Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS saponin dioscin (NN02) 49 Chương BÀN LUẬN 51 4.1 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin nần nghệ 51 4.2 Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu ECV304 saponin NN02 có nần nghệ (D collettii) 53 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tiếng Anh Tài liệu trực tuyến PHỤ LỤC Phụ lục Phụ lục DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance CDCl3 : Deuterated chloroform COSY : Correlation spectroscopy d : doublet DEPT : Detortionless enhancement by polarisationtrasfer DMC : Dimethyl carbonat DMSO : Dimethyl sulfoxid DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DETA : Ethylen Diamin Tetraacetic acid eNOS : Endothelial nitric oxide synthase FBS : Fetal bovine serum : Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR HPLC : High-performance liquid chromatography HMBC : Heteronuclear multilpe bond cerelation HSQC : Heteronuclear single quantum corelation m/z : Khối lượng/điện tích ion NMR : Nuclear Magnetic Resonance MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide NO : Nitric oxid NOESY : Nuclear Magnetic Resonance P/đ : Phân đoạn s : singlet TT : Thứ tự SKLM : Sắc ký lớp mỏng TBT-T : Tris buffered saline TLC : Thin-layer chromatography TT : Thuốc thử TLTK : Tài liệu tham khảo v/v : Thể tích/ thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các sapogenin thân rễ nần nghệ Bảng 1.2 Các hợp chất saponin thu từ dịch chiết ethanol nần nghệ Bảng 3.1 Hàm lượng cắn phân đoạn chiết xuất từ thân rễ nần nghệ 30 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất NN01 gracillin 38 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất NN02 dioscin 45 Bảng 3.4 Giá trị mật độ quang mức độ gây chết tế bào lô tế bào sau ủ với MTT 48 Bảng 3.5 Số lần tăng mức độ biểu p-eNOS so với lô chứng 50 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Cấu trúc thành động mạch tĩnh mạch 14 Hình 2.1 Cây nần nghệ 17 Hình 2.2 Thân rễ nần nghệ 17 Hình 2.3 Thân rễ nần nghệ thái lát 17 Hình 2.4 Quá trình chạy điện di 26 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ thân rễ nần nghệ 30 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất saponin từ thân rễ nần nghệ .31 Hình 3.3 Cắn phân đoạn phân lập 33 Hình 3.4 Chất NN01 33 Hình 3.5 Chất NN02 33 Hình 3.6 Sắc ký đồ NN01, T (cao ethanol 80%) NN02 silica gel 60 RP-18 F254 (Merck, 5x10 cm), sau phun thuốc thử H2SO4 10% cồn tuyệt đối hơ nóng 34 Hình 3.7 Sắc ký đồ NN01, T (cao ethanol 80%) NN02 ánh sáng thường, silica gel 60 F254 (Merck, 5x10 cm), sau phun thuốc thử H2SO4 10% cồn tuyệt đối hơ nóng 34 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR hợp chất NN01 35 Hình 3.9 Phổ HSQC hợp chất NN01 35 Hình 3.10 Phổ 13C-NMR hợp chất NN01 36 Hình 3.11 Phổ HSQC hợp chất NN01 36 Hình 3.12 Phổ COSY hợp chất NN01 37 Hình 3.13 Phổ HMBC giãn hợp chất NN01 37 Hình 3.14 Phổ HR-ESI-MS chất NN01 .38 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học hợp chất NN01 .40 Hình 3.16 Các tương tác HMBC COSY hợp chất NN01 41 Hình 3.17 Phổ 1H-NMR hợp chất NN02 42 Hình 3.18 Phổ HSQC hợp chất NN02 42 Hình 3.19 Phổ 13C-NMR hợp chất NNO2 43 Hình 3.20 Phổ HSQC hợp chất NN02 43 Hình 3.21 Phổ DEPT chất NN02 43 Hình 3.22 Phổ HMBC giãn hợp chất NN02 44 Hình 3.23 Phổ COSY hợp chất NN02 44 Hình 3.24 Phổ APCI-MS chất NN02 45 Hình 3.25 Cấu trúc hóa học hợp chất NN02 47 Hình 3.26 Tương tác HMBC tương tác COSY phân tử NN02 47 Hình 3.27 Mức độ biểu p-eNOS phân tích Western blot .49 Hình 3.28 Số lần tăng biểu p-eNOS lô ủ với saponin dioscin (NN02) với lô chứng 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đất nước có Y học cổ truyền lâu đời với nguồn tài nguyên thuốc vô phong phú Là quốc gia nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt nam có nhiều điều kiện thuận lợi cho sinh vật phát triển tạo hệ thực vật phong phú đa dạng Với trình độ ngày phát triển nhu cầu chăm sóc sức khỏe người ngày nâng lên rõ rệt Trên giới, chăm sóc sức khỏe, việc phòng điều trị bệnh tương lai ngày trọng đến việc dùng sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên Nhiều thuốc cổ truyền phát triển, nhiều hợp chất, nhóm chất có tác dụng sinh học quý giá phát hiện, nghiên cứu ứng dụng vào thực tế Trong thời kỳ đại với phát triển khoa học kỹ thuật với nhiều thành tựu lĩnh vực công nghiệp dược có nhiều thuốc sản xuất từ hoạt chất chiết xuất từ cỏ thiên nhiên Trong số có nhiều loài thuốc quý sử dụng Nguồn thuốc dân gian vốn sử dụng dược liệu phong phú đồng bào dân tộc kho tàng quý giá để khám phá Tuy nhiên việc sử dụng chúng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian hay y học cổ truyền lưu truyền từ đời qua đời khác, nhiều thuốc chưa nghiên cứu nghiên cứu chưa có hệ thống Vì việc nghiên cứu cỏ làm thuốc cách đầy đủ toàn diện điều cần thiết góp phần nâng cao tính an toàn hiệu điều trị Saponin ý nhiều nhà khoa học toàn giới, cấu trúc đặc biệt tác dụng sinh học đa dạng Nhiều tác dụng dược lý đáng ý từ dịch chiết, từ nhóm hoạt chất hay hoạt chất tinh khiết chứng minh hạ đường huyết, hạ cholesreol, tăng cường miễn Chương BÀN LUẬN 4.1 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin nần nghệ (D collettii) Hai saponin steroids diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2){β-D-glucopyranosyl-(1→3)}-β-D-glucopyranoside) (NN01) diosgenin-3O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-{α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)}-β-Dglucopyranoside(NN02)đã phân lập từ phân đoạn ethyl acetat thân rễ nần nghệ thu hái Sơn La, Việt Nam Điểm chung hai saponin có phần aglycon diosgenin dẫn chất nó, phần đường hợp chất NN01 gồm đường có đường glucose đường rhamnose, hợp chất NN02 gồm đường có đường glucose đường rhamnose Việc phân lập saponin thành lớn nhóm nghiên cứu việc khẳng định lần thành phần diosgenin có thân rễ nần nghệ (D collettii) báo cáo trước Nguyễn Hoàng cộng nghiên cứu thành phần hóa học nần nghệ (D collectti) lấy từ Mộc Châu xác định thành phần chủ yếu loại spirostan sapogenin có phần genin diosgenin phần đường gồm phân tử đường glucose, rhamnose phân tử đường chưa xác định rõ [12], [17] Hơn nữa, vào tài liệu tham khảo phân chúng thuộc nhóm saponin steroid với tên thường gọi gracillin dioscin, điều phù hợp với số báo cáo giới xác định 14 hợp chất saponin từ dịch chiết ethanol nần nghệ (D Collettii var hypoglauca) bao gồm: prosapogenin A dioscin , dioscin, gracillin, proroneodioscin, protodioscin, protoneogracillin, protogracillin, methyl protoneodioscin, methyl protodioscin, methyl protoneogracillin, methyl protogracillin, hypoglaucin F, hypoglau H [31] Đây lần hai hợp chất tìm thấy thân rễ nần nghệ (D collettii Hook.f, 51 Dioscoreace) thu hái Sơn La, Việt Nam tạo sở liệu quan trọng cho sàng lọc hợp chất tự nhiên chất dẫn đường cho nghiên cứu sau Diosgenin chứng minh có nhiều tác dụng dược lý, đặc biệt bệnh chuyển hóa rối loạn lipid máu, tiểu đường, bệnh ung thư ung thư vú, ung thư phổi, ung thư ruột kết [30] Một ứng dụng quan trọng diosgenin nguồn nguyên liệu bán tổng hợp 16dehydro pregnenolon (16-DPA), chất trung gian để tổng hợp dẫn xuất steroid [23], [37] Khoảng 90% dẫn chất steroid dùng làm thuốc sản xuất từ nguyên liệu diosgenin Điều cho thấy tầm quan trọng diosgenin ngành y dược ngày Chính vậy, nần nghệ đánh giá nguồn nguyên liệu quan trọng để chiết xuất diosgenin Việt Nam [14] Ngoài ra, Hoàng Kim Huyền, Nguyễn Minh Thu, Nguyễn Hoàng, Nguyễn Trung Chính (1991) [13], [14] khảo sát sơ số tác dụng dược lý độc tính động vật thí nghiệm cho thấy cao nần nghệ (D collettii) độc dùng đường uống, tác dụng chống viêm đáng lưu ý tác dụng hạ cholesterol có nhiều triển vọng: tác dụng chống viêm tương đương prednisolon, tất trị số lipid máu trở bình thường, đặc biệt hạ mạnh lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), có xu hướng tăng lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), hạ tỷ số cholesterol/HDL Bào chế thử khoảng vạn viên nén Diosgin 0,1g dùng cho khoảng 200 bệnh nhân, kết xét nghiệm sinh hóa tiêu lipoprotein máu (triglycerid), cholesterol tổng số (CT), LDL, HDL tỷ số CT/HDL cho thấy diosgin thể tác dụng tốt, đặc biệt CT máu 100% bệnh nhân xét nghiệm giảm trung bình 36,76 mg % Thuốc có tác dụng hạ huyết áp hầu hết bệnh nhân có cao huyết áp Trong trình điều trị không thấy có tai biến tác dụng không mong muốn Đây lý mà nhóm 52 nghiên cứu thử tác dụng hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu nhằm đánh giá khả chống xơ vữa động mạch saponin mà phân lập được, góp phần tiến tới đưa hoạt chất có dược liệu vào sử dụng rộng rãi lâm sàng Như kết nghiên cứu chiết xuất, phân lập saponin có nần nghệ phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin làdiosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-{β-D-glucopyranosyl-(1→3)}-βD-glucopyranoside) (NN01) diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-{αL-rhamnopyranosyl-(1→4)}-β-D-glucopyranoside (NN02) với tên thường gọi gracillin dioscin 4.2 Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu ECV304 saponin NN02 có nần nghệ (D collettii) Trước tiến hành đánh giá tác dụng saponin có thân rễ nần nghệ (D collettii) tế bào nội mô mạch máu ECV304, tiến hành thử nghiệm khả gây độc tế bào saponin Đây thử nghiệm nhằm khảo sát khả gây độc mẫu thử dòng tế bào cụ thể sử dụng thí nghiệm tiếp theo, đồng thời sở để xem xét việc lựa chọn nồng độ mẫu thử đánh giá tác dụng mẫu tế bào Phương pháp đánh giá khả gây độc tế bào sử dụng nghiên cứu phương pháp MTT (MTT assay) MTT assay phương pháp thử độc tính mẫu thử tế bào nuôi cấy thông qua xác định khả sống/chết tế bào dựa vào chức tế bào Trong ty thể tế bào sống có chứa enzym succinat dehydrogenase hoạt động 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide 53 (MTT) chất hóa học có màu vàng, vào ty thể tế bào bị dehydro enzym succinat dehydrogenase tạo thành formazan sản phẩm không tan, có màu tím đen Các tế bào chết succinat dehydrogenase hoạt động, tế bào chết, tạo thành formazan Formazan không tan nước tan tốt ethanol, DMSO isopropanol Có thể xác định sống/chết tế bào thông qua có mặt enzym succinat dehydrogenase cách ủ tế bào với thuốc thử MTT, sau bổ sung dung môi hữu (DMSO isopropanol) để hòa tan formazan định lượng formazan phương pháp đo quang bước sóng 540nm Kết cho thấy saponin dioscin (NN02) nồng độ 400µg/ml, 200µg/ml 100µg/mlkhông gây độc tế bào Do lấy ba nồng độ để tiếp tục thử tác dụng hoạt hóa eNOS Ở chọn Dioscin (NN02) có nồng độ 100µg/ml để thử tác dụng Hoạt hóa eNOS làm tăng sản xuất NO [45], NO đóng vai trò quan trọng việc điều trị số bệnh thể như: xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính [15] Osthol có nhiều hoạt tính sinh học như: chống ung thư, chống loạn nhịp tim, ngăn ngừa viêm gan giãn mạch Gần đây, osthol chứng minh có tác dụng hạ huyết áp, làm giãn mạch [40] Osthol tăng cường biểu eNOS hoạt hóa protein thông qua photphoryl hóa Ser1177, kích thích giải phóng NO lớp nội mô dẫn đến giãn mạch phổi [45] Do đó, thử nghiệm tác dụng hoạt hóa eNOS lựa chọn osthol làm chứng dương Các nghiên cứu giới trước cho thấy cà ri (Fenugreek, Trigonella foenum-graecum L.) số saponin có tác dụng chống oxy hóa 54 làm tăng mức độ eNOS mạch vành, saffron crocin có thành phần nghệ tây (Crocus sativus, Iridaceae)cũng có tác dụng chống oxy hóa eNOS [19] Saponin ginsenoside có tác dụng kích hoạt eNOS saponin nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng giải phóng NO từ tế bào nội bào thỏ [21] Tuy nhiên Việt Nam, theo biết chưa có báo cáo tác dụng hoạt hóa eNOS hợp chất có dược liệu nói chung saponin nói riêng Việc nghiên cứu phát saponin NN02 có tác dụng hoạt hóa eNOS một thành công to lớn nhóm nghiên cứu, góp phần đưa thêm chứng tác dụng dược liệu nần nghệ việc điều trị bệnh bệnh liên quan đến việc giúp giải phóng NO xơ vữa động mạch, rối loạn lipid máu, bệnh tim mạch khác, bệnh tắc nghẽn phổi mãn tính Hơn từ việc phát dioscin (NN02) phân lập từ phân đoạn ethyl acetat tác dụng hoạt hóa eNOS giúp chứng minh hay làm tiền đề cho nghiên cứu sâu hợp chất để dùng làm thuốc thử nghiệm lâm sàng Tuy nhiên thời gian nhiều hạn chế nên thử nồng độ dioscin (NN01) 100 µg/ml, đề xuất tiến hành thử tác dụng nồng độ thấp nhằm chứng minh rỏ ràng tác dụng hoạt hóa eNOS dioscin (NN02) 55 KẾT LUẬN Về chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học saponin nần nghệ Đã chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học tên saponin có nần nghệ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái Sơn La, Việt Nam là: - Gracillin: Diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-{β-D- glucopyranosyl-(1→3)}-β-D-glucopyranoside) (NN01) - Dioscin: Diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-{α-L- rhamnopyranosyl-(1→4)}-β-D-glucopyranoside(NN02) Về đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu ECV304 dioscin (NN02) có nần nghệ Saponin dioscin (NN02) với nồng độ 100µg/ml có tác dụng hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu ECV304 56 KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu trên, đưa số đề xuất sau: Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn khác dược liệu Tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu chế khác có tác dụng chống xơ vữa động mạch hợp chất nhằm làm sáng tỏ tác dụng dược liệu điều trị xơ vữa động mạch nói riêng bệnh tim mạch nói chung 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế, Giải phẩu sinh lý người, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, tr 119-121 Hoàng Tiến Bành (1988), "Một số đặc điểm dược liệu nần nghệ", Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội., tr 1-57 Bộ Khoa học Công nghệ Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ Việt Nam, Phần II: Thực vật, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội, tr 391-392 Bộ Khoa học Công nghệ Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ Việt Nam, Hà Nội, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ, tr 391-392 Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), Thực vật học, Hà Nội, tr 387-399 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 328-340 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học, Hồ Chí Minh, tr 243-283 Nguyễn Hữu Đỉnh , Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr 1-256 Nguyễn Trí Dũng (2014), Mô học phân tử - Tập 2, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tr 17-300 10 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, TP Hồ Chí Minh, I, tr 751 11 Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích (1987), "Diosgenin số loài Dioscorea Việt Nam", Công trình nghiên cứu khoa học Y Dược 1986, tr 270-271 12 Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích, Đỗ Minh Hà (1983), "Diosgenin nần nghệ", Tạp chí dược học, 2, tr 8-9 13 Hoàng Kim Huyền, Nguyễn Minh Thu (1991), "Khảo sát độc tính cao nần nghệ", Tạp chí dược học, tr 28-29 14 Hoàng Kim Huyền, Nguyễn Minh Thu, Nguyễn Hoàng, Nguyễn Trung Chính (1991), "Khảo sát sơ số tác dụng dược lý nần nghệ", Tạp chí dược học, tr 15-17 15 Dương Qúy Sỹ, Lê Đông Nhật Nam, Hứa Huy Thông, Đinh Xuân Anh Tuấn (2011), "Rối loạn chức nội mô bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (BPTNMT): Vai trò oxit nitơ endothelin-1", J Fran Viet Pneu 02(05), tr 1-92 16 Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu - tập 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 126-136 17 Đỗ Thị Bích Thủy (1987), "Bước đầu nghiên cứu chế phẩm từ nần nghệ", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 1-57 18 Nguyễn Hoàng Tuấn (2016), "Đặc điểm thực vật nần nghệ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái Sơn La", Tạp chí dược liệu, Tập 21, số 1+2, tr 8-13 Tiếng Anh 19 Ahmad R, Rahman T, Froemming GA, Nawawi H (2016), "Anti-oxidant properties of fenugreek and saponins, and their effects on eNOS expression on human coronary artery endothelial cells", Atherosclerosis, 252, p 158 20 Bonetti P O Lerman L.O., et al (2003), Endothelial dysfunction: a marker of atherosclerotic risk, Arterioscler Thromb Vasc Biol, pp 168-175 21 Chen Xiu, Lee Tony J‐F (1995), "Ginsenosides‐induced nitric oxide‐ mediated relaxation of the rabbit corpus cavernosum", British journal of pharmacology, 115(1), pp 15-18 22 Cheryll Williams (2013), "Medicinal Plants in Australia ", An Antipodean Apothecary, 4, p 437 23 Dewick Paul M (2009), "Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach", John Wiley and Sons Inc., USA, pp 247-265 24 Hong bao Ma (2006), "Western Blotting method", The Journal of American Science, 2, pp 23-27 25 Howes L.G Abbott D et al (1997), "Lipoprotein and cardivascular reactivity", Br J Clin Pharmacol, 44, pp 319-324 26 Hu K and Yao X (2003), "The cytotoxicity of methyl protoneogracillin (NSC-698793) and gracillin (NSC-698787), two steroidal saponins from the rhizomes of Dioscorea collettii var hypoglauca, against human cancer cells invitro", Phytotherapy Research, 17, pp 620-626 27 Hu K Dong A, Yao X, Kobayashi H, Iwasaki S (1996), "Antineoplastic agents; I Three spirostanol glycosides from rhizomes of Dioscorea colletti vatt Hypoglauca.", Planta Medica, pp 537-575 28 Hu Ke, Dong Aijun, Yao Xinsheng, Kobayashi Hisayoshi, Iwasaki Shigeo (1997), "Antineoplastic agents II: four furostanol glycosides from rhizomes of Dioscorea collettii var hypoglauca", Planta medica, 63(02), pp 161-165 29 Huang Yun Cui Lijian, Zhan Wenhong, Dou Yuhong, Wang Yongli, Wang Qiang, and Zhao Ding (2007), "Separation and identification of steroidecompounds with cytotoxic activity againts human gastric cancer cell lines in vitro from the rhizomes of Pari polyphyllar var chinensis ", Chemistry of natural Compounds, 43(6), pp 672-677 30 Jayadev Raju Chinthalapally V Rao2 " Diosgenin a Steroid Saponin Constituent of Yams and Fenugreek: Emerging Evidence for Applications in Medicine", Bioactive Compounds in Phytomedicine, p 126 31 Ke Hu Ai-Jun Dong Xin-Sheng Yao, Hisayoshi Kobayashi and Shigeo Iwasaki (1999), "Antineoplastic steroidal saponin from rhizomes of Dioscorea colletti var Hypoglauca", Advances in Plant Glycosides Chemistry and Biology, 6, pp 220-229 32 Ke Hu Xinsheng Yao (2002), "The cytotoxicity of protoneodioscin (NSC698789), a furostanol saponin from the rhizomes of Dioscorea colletti var hypoglauca, against human cancer cells in vitro", Phytomedicine, pp 550-565 33 Li Huige Förstermann Ulrich (2000), "Nitric oxide in the pathogenesis of vascular disease", J Pathol 190, pp 244-254 34 Liu CL, Chen YY, Ge SB, Li BG (1983), "Studies on the constituents of Dioscorea plants II Isolation and identification of steroidal saponins from Dioscorea collettii Hook F", Yao xue xue bao= Acta pharmaceutica Sinica, 18(8), pp 597-606 35 Minghe Yang, Yanyong Chen (1983), "Steroidal sapogenins in Dioscorea collettii", Planta medica, 49(09), pp 38-42 36 Moncada S HiggsA (1993), "The L- arginine-nitric oxide pathway", N Engl J Med, 329, pp 2002-2012 37 Peter M.S.Palaniswami and K.V (2008), "Horticulture Science Series", Tuber and Root Crops, New India Publishing Agency, India, , 9, pp 88-90 38 RH.et.al Scofield (2006), "Western blotting", Methods, 38, pp 283-293 39 Sun Bu Tong, Zheng Li Hua, Bao Yong Li, Yu Chun Lei, Wu Yin, Meng Xiang Ying, Li Yu Xin (2011), "Reversal effect of Dioscin on multidrug resistance in human hepatoma HepG2/adriamycin cells", European journal of pharmacology, 654(2), pp 129-134 40 Teng Che-Ming, Lin Chein-Huang, Ko Feng-Nien, Wu Tian-Shung, Huang Tur-Fu (1994), "The relaxant action of osthole isolated from Angelica pubescens in guinea-pig trachea", Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology, 349(2), pp 202-208 41 Vogel H.G (2008), "Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays", Springer, p 1455 42 Weyermannet.al (2005), "A practical note on the use of cytotoxicity assays", International Journal of Pharmaceutics, 288, pp 369-376 43 Yang Deng-Jye, Lu Ting-Jang, Hwang Lucy Sun (2003), "Simultaneous determination of furostanol and spirostanol glycosides in Taiwanese yam (Dioscorea spp.) cultivars by high performance liquid chromatography", Journal of Food and Drug Analysis, 11(4), pp 271-276 44 Yang Y., Hongbao Ma (2009), "Western Blotting and ELISA techniques", Researcher, 1(2), pp 67-86 45 Yao Li, Lu Ping, Li Yumei, Yang Lijing, Feng Hongxuan, Huang Yong, Zhang Dandan, Chen Jianguo, Zhu Daling (2013), "Osthole relaxes pulmonary arteries through endothelial phosphatidylinositol 3-kinase/AkteNOS-NO signaling pathway in rats", European journal of pharmacology, 699(1), pp 23-32 Tài liệu trực tuyến 46 http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-239984 47 https://sites.google.com/site/tlykhoa/chude/chudemachmauvatuanhoan PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỔ CỦA HỢP CHẤT NN01 - 1H- NMR - 13C-NMR - COSY - Dept - HMBC - HSQC PHỤ LỤC PHỔ CỦA HỢP CHẤT NN02 - 1H- NMR - 13C-NMR - COSY - Dept - HSQC - HMBC ... mô mạch máu saponin có Nần Nghệ (Dioscorea collettii Hook. f, Dioscoreace) thu hái Sơn La với mục tiêu: Chiết xuất phân lập saponin từ nần nghệ (Dioscorea collettii Hook. f, Dioscoreace) thu hái. .. Sơn La Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS tế bào nội mô mạch máu ECV304 saponin phân lập từ nần nghệ (Dioscorea collettii Hook. f, Dioscoreace) thu hái Sơn La Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nần nghệ. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH HẠNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG HOẠT HÓA eNOS TRONG TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU CỦA SAPONIN CÓ TRONG NẦN NGHỆ (Dioscorea collettii